Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Зеленый монстр процесса генерации штаммов дрожжей проведение нескольких удалений Гена

13.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4072

⸱

15 декабря 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Synthetic Biology and Bioenergy, J. Craig Venter Institute, 2Department of Microbial and Environmental Genomics, J. Craig Venter Institute, 3Donnelly Centre & Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 4Lunenfeld Research Institute, Mt Sinai Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Зеленый монстр метод позволяет быструю сборку нескольких удалений отмечены кодирования гена-репортера зеленого флуоресцентного белка. Этот метод основан на вождение штаммов дрожжей через повторяющиеся циклы сексуальных ассортимент удалений и флуоресценции на основе обогащения клеток, несущих более удалений.

Аннотация

Фенотипы при делеции гена часто проявляются только тогда, когда мутация тестируется на определенном генетическом фоне или при определенных условиях окружающей среды1,2. Существуют примеры, когда для выявления скрытых функций генов требуется делеция множества генов3,4. Несмотря на потенциал для совершения важных открытий, генетические взаимодействия с участием трех или более генов остаются в значительной степени неизученными. Исчерпывающий поиск взаимодействий в мультимутантных линиях был бы непрактичен из-за огромного количества возможных комбинаций делеций. Однако изучение выбранных наборов генов, таких как группы паралогов с большей a priori вероятностью наличия общей функции, было бы информативным.

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae нокаут генов осуществляется путем замены гена селективным маркером посредством гомологичной рекомбинации. Поскольку количество доступных маркеров ограничено, были разработаны методы удаления и повторного использования одного и того же маркера5,6,7,8,9,10. Однако последовательное внесение множественных мутаций с использованием этих методов требует много времени, так как затрачиваемое время линейно зависит от количества создаваемых делеций.

Здесь мы описываем метод «Зеленого монстра» (Green Monster) для рутинного создания множественных делеций у дрожжей11. В этом методе репортерный зеленый флуоресцентный белок (GFP), интегрированный в места делеций, используется для количественной маркировки штаммов в зависимости от количества делеций в каждом из них (Рисунок 1). Повторяющиеся циклы сортировки делеций, маркированных GFP, посредством спаривания и мейоза дрожжей в сочетании с проточным цитометрическим обогащением штаммов, несущих большее количество таких делеций, приводят к накоплению делеций в штаммах (Рисунок 2). Параллельное выполнение нескольких процессов, при этом в каждом процессе за один раунд вносится одна или более делеций, сокращает время, необходимое для конструирования штаммов.

Первым шагом является подготовка гаплоидных одиночных мутантов, называемых «ProMonsters», каждый из которых содержит GFP-репортер в делетированном локусе и один из локусов «инструментария» (toolkit) — либо Green Monster GMToolkit-a, либо GMToolkit-α в локусе can1Δ (Рисунок 3). С использованием штаммов из коллекции делеций дрожжей12 делеции, маркированные GFP, можно удобно создавать путем замены общей кассеты KanMX4, присутствующей в этих штаммах, на универсальный фрагмент GFP-URA3. Каждый GMToolkit содержит: либо специфичный для гаплоидного спаривающего типа a или α селективный маркер1, и ровно один из двух маркеров, которые при наличии обоих GMToolkit позволяют совместно проводить селекцию диплоидов.

Вторым этапом является проведение половых циклов, в ходе которых локусы делеций могут быть объединены в одной клетке за счет случайного распределения и/или мейотической рекомбинации, сопровождающих каждый цикл спаривания и споруляции.

Протокол

1. Генерация ProMonsters

  1. Подготовка универсальные кассеты замены GFP путем усиления Teto 2-GFP маркер и маркер URA3 из плазмиды pYOGM012 (ампициллину) с использованием праймеров с последовательностями:
    GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG и GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (полужирным регионов обеспечить гомологии с фланговых районах KanMX4 кассеты позволяет целевых замены). ПЦР должна проводиться с Phusion полимеразы, HF буфера, и 3% диметилсульфоксида (New England Biolabs), начиная с концентрацией ДНК-матрицы 0,5 нг / мкл. Программа ПЦР 98 ° C в течение 30 сек и 35 циклов 98 ° C в течение 10 сек, 49 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1,5 мин. Реакция объем должен быть> 50 мкл, чтобы обеспечить достаточно ДНК для каждого преобразования эксперимент. Мы очищаемпродукта с использованием QIAquick ПЦР очистки (Qiagen) с ~ 50 мкл ПЦР-реакции, обрабатываемых в колонке, но пропуская стадию очистки может увеличить выход трансформантов.
    Кроме того, отпустите фрагмент, содержащий Teto 2-GFP и URA3 маркеров, а также гомологичные регионы KanMX4 таргетинг, путем расщепления плазмиды pYOGM057 (ампициллину) с помощью ферментов рестрикции EcoRI (New England Biolabs). Концентрация ДНК в этой реакции должно быть ~ 30 нг / мкл. Реакция объем должен быть> 34 мкл.
    Для интеграции GFP кассету в регионе, кроме KanMX4, отрегулируйте гомологии области ПЦР-праймеров выше соответствующего гомологичных последовательностей.
  2. Transform-гаплоидные штамма из коллекции KanMX4 нокаутом дрожжи 12 с универсальной кассетой удаления GFP. В соответствии с протоколом лесами и Gietz 13 0,34 мклОбразец ДНК (очищенный продукт ПЦР или не очищенный ограничение дайджест) следует использовать для каждого преобразования эксперимент. Плита пятая часть преобразований смесь на CAA-Ура пластины (0,67% базы дрожжей азота, 2% глюкозы, 0,6% казаминовой кислоты, 0,0025% аденина гемисульфат, 0,005% триптофана, и 2% агар).
  3. Подряд из трансформантов на свежем CAA-Ура пластины для получения изолированных колоний.
  4. Передача клетки из колонии на тарелку YPDA, содержащий 200 мкг / мл G418, чтобы подтвердить отсутствие роста. Для подтверждения успешной интеграции GFP, выполните следующие действия (1,5) - (1,9) для выполнения ПЦР колоний.
  5. Добавить клеток, взятых из колонии в 2 мкл буфера для лизиса (0,1 М фосфата натрия, рН 7,4, 1 единица zymolyase от ZymoResearch) в 0,2-мл ПЦР трубу или колодец 96-луночный планшет. Смешать с помощью пипетки решение и выход из кончика пипетки.
  6. Наложение одной капле (около 20 мкл) минерального масла с использованием P200 Pipetman (Gilson).
  7. Выдержите эту смесь при температуре 37 °С в течение 20 мин, а затем при 95 ° С в течение 10 мин.
  8. Развести лизат с 50 мкл воды. Смешать с помощью пипетки решение и выход в десять раз.
  9. Анализ 1 мкл лизатов с помощью 10-мкл ПЦР-реакции с (A) прямой праймер, что отжига выше по течению флангового региона в сочетании с грунтовкой последовательности CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 б.п. с начала кассеты), (B) обратные праймер, который отжигается вниз по течению региона в паре с грунтовкой последовательности GCATTGGGTCAACAGTATAG (375 б.п. с конца), (C) двух праймеров, что отжиг в KanMX4 с последовательностями CGTACTCCTGATGATGCATG и GACGAAATACGCGATCGCTG (181 б.п.) и (D) двух праймеров, что отжига в последовательности дикого типа целевого гена (рис. 4). (D) является важным, поскольку около 8% штаммов в удалении коллекций как известно, содержат анеуплоидии 14. Правильное Трансформант должно быть положительным (А) и (Б), и отрицательным (C) и (D).
  10. Для введенияGMToolkit в Трансформант, добавить примерно 250000 клеток из трансформированного штамма и 250000 клеток либо RY0146 (содержащие GMToolkit-а) или RY0148 (содержащие GMToolkit-α) в 1,6-мл трубки Эппендорф. Vortex. Генотипов RY0146 и RY0148 являются MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-[CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] и MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], соответственно. PR обозначает промотор. Сотовый номер должен быть оценен по оптической плотности предыдущей культуры.
  11. Центрифуга при 800 мкг в течение 2 мин.
  12. Удалить супернатант.
  13. Для обеспечения воздухообмена, сделать отверстие на крышке помощью канцелярской кнопки обрабатывают 70% этанолом.
  14. Добавить 50 мкл YPDA среде (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкозы и 0,003% аденина hemisulfatе). Vortex.
  15. Центрифуга при 800 мкг в течение 5 мин.
  16. Поместите пробирку в сыром поле. Это может быть создан с пустой коробки наконечник, небольшой стенд чаевые, и влажное бумажное полотенце.
  17. Инкубируйте поле в течение ночи при 30 ° C.
  18. Выберите повязана диплоиды первым полос из клетки на CAA-Ура пластины. Инкубировать при 30 ° C в течение одного дня.
  19. Принимая клетки от основной области, полоса них, чтобы сделать изолированных колоний на чашках YPDA (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкозы, 0,003% аденина гемисульфат, и 2% агар), содержащей 200 мкг / мл G418 для выбора диплоиды содержащие GMToolkit-или 100 мкг / мл nourseothricin (Nat) 15 для выбора диплоиды содержащие GMToolkit-α.
  20. Инкубировать при 30 ° С в течение 3 дней.
  21. Начиная с изолированной колонии, передать большинство клеток в 500 мкл среды GNA без агар (1% дрожжевого экстракта, 3% Difco питательный бульон и 5% глюкозы; автоклаве глюкозы и остальных тОн компоненты по отдельности, как 2 × решения, чтобы избежать карамелизации) в 5-мл пробирку с крышкой ослаблены.
  22. Поверните трубу горизонтально в течение пяти часов при 30 ° C. Ось вращения должна быть параллельной продольной оси трубки.
  23. Убедитесь, что используется в колонии (1,21) являются Ura + от полос их на CAA-Ура пластины.
  24. Центрифуги трубы при 800 мкг в течение 2 мин. Удалите супернатант.
  25. Добавить 500 мкл минимальной среды споруляции (1% ацетата калия, 0,005% ацетата цинка; фильтр-стерилизовать). Vortex.
  26. Центрифуги трубы при 800 мкг в течение 2 мин. Удалите супернатант.
  27. Повтор (1,25) - (1,26) раза.
  28. Добавить 1 мл минимальной среды споруляции дополнен с 7,5 мкг / мл лизина, 7,5 мкг / мл лейцин, 5 мкг / мл гистидина, 5 мкг / мл метионина и 1,25 мкг / мл урацил (для повышения споруляции скорость ауксотрофный штаммов) . Vortex.
  29. Поворот трубки при комнатной температуре в течение одного дня.
  30. Поворот трубы при 30 ° С в течение 2 дней.
  31. Центрифуга 125 мкл этой смеси в 1,6-мл трубки Эппендорф при 800 мкг в течение 2 мин. Удалите супернатант.
  32. Добавить 50 мкл zymolyase решения (100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, 1 М сорбит, и 2 единицы zymolyase от ZymoResearch). Смешать с помощью пипетки решение и выход из кончика пипетки.
  33. Инкубировать при 30 ° С в течение 1 часа.
  34. Добавить 50 мкл 0,02% NP-40. Смешать с помощью пипетки решение и выход из кончика пипетки.
  35. Оставьте трубки при комнатной температуре в течение пяти минут.
  36. Добавить 500 мкл воды.
  37. Поместите пробирку на льду.
  38. Разрушать ультразвуком эту смесь два раза на выходе установки 1 (слабая установка) в течение 15 сек помощью 3,2-мм микронаконечником с Sonifier 450 (Branson). Между двумя турами ультразвуком, положил трубку на льду, чтобы вернуться температуры до ~ 0 ° C.
  39. Центрифуги трубы при 800 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  40. Добавить 200 мкл SC-Ура-Его(А) или SC-Ура-лей (α) среды, в зависимости от того креста по включению GMToolkit-или GMToolkit-α. Для приготовления средства массовой информации, делают SC-Ура-His-Leu среднего (0,67% базы дрожжей азота, 2% глюкозы, 0,01% аргинина, 0,01% аспарагиновой кислоты, 0,01% глутаминовая кислота, изолейцин 0,01%, 0,01% лизина, 0,01% метионина , 0,01% фенилаланина, 0,08% серин, треонин 0,04%, 0,002% тирозин, валин 0,03%, 0,0025% аденина, триптофан 0,005%, 0,003% аденина, и 0,005% триптофана) и дополнить его стерильным гистидина или лейцин перед использованием, чтобы конечной концентрации 0,01%.
  41. Сделайте отверстие на крышке помощью канцелярской кнопки обрабатывают 70% этанолом.
  42. Поверните трубу горизонтально при 30 ° С в течение 2 дней. Ось вращения должна быть параллельной продольной оси трубки.
  43. Подряд из клетки на SC-Ура-Его SC-Ура-Leu агар пластины (те же ингредиенты, что и выше, плюс 2% агара, треонин и аспарагиновой кислоты должен быть добавлен послеutoclaving, добавить гистидина или лейцин перед заливкой), чтобы сделать изолированных колоний для штаммов ProMonster.

2. Сексуальные Велоспорт

  1. Поворот культуры создан штамм GFP удалении в 100 мкл SC-His (а) или SC-лей (α) в зависимости от типа спаривания при температуре 30 ° С в течение ночи помощью 1,6-мл Eppendorf трубки. Для обмена воздуха, сделать отверстие с помощью канцелярской кнопки обрабатывают 70% этанолом. Поверните трубу горизонтально. Ось вращения должна быть параллельной продольной оси трубки. Это можно пересечь несколько штаммов через спаривания в массовом порядке. Когда отсортированный образец непосредственно используемых для этой цели, культуре клеток в 200 мкл при 30 ° С в течение 2 дней. Для приготовления среды, добавить урацил (конечная концентрация: 0,0025%) и гистидина (0,01%) или лейцин (0,01%) к SC-Ура-His-Leu среды.
  2. Смешать 250000-гаплоидных клеток и 250000 α-гаплоидных клеток штаммов GFP удаление в 1,6-мл Eppendorf трубку. Vortex.
  3. Совместите эти клетки, выполнив следующие действия (1,11) - (1,17).
  4. Передача 10 мкл спаривания смеси до 500 мкл среды GNA, содержащий 200 мкг / мл G418 и 100 мкг / мл Nat в 5-мл пробирку с ослабил крышку. Начиная OD 600 составляет примерно 0,1.
  5. Поверните культуры при 30 ° С в течение 24 часов. Это дает возможность выбора диплоиды, потому что только диплоиды, содержащие как KanMX4 в GMToolkit-и NatMX4 в GMToolkit-α может расти в присутствии G418 и Нат (рис. 3).
  6. Передача 20 мкл однодневный культуры до 500 мкл свежей GNA содержащей G418 и Nat. Начиная OD 600 составляет примерно 0,2.
  7. Поворот трубы на 30 ° C в течение 5 часов, чтобы принести клеток в логарифмической фазе (OD 600 из ~ 1).
  8. Следуйте инструкциям (1,24) - (1,38) в спорулируют диплоиды и изолировать споры.
  9. Сплит приостановлении спорулированных клетки на две 300-мклчасти и положить каждую в отдельный 1,5-мл трубки Эппендорф.
  10. Центрифуги трубы при 800 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
  11. Для гранул из одной трубки, добавляют 100 мкл SC-Его среда для выбора-гаплоидов. Для гранул из другой трубы, добавить 100 мкл SC-лей средних для выбора α-гаплоидов.
  12. Поворот трубы при 30 ° С в течение ночи. Окончательный OD 600 должна быть не менее 0,5. Если OD 600 имеет тенденцию быть слишком высокой, попробуйте культивирования при комнатной температуре.
  13. Для стимулирования GFP, добавьте 100 мкл свежей SC-His (а) или SC-лей (α) среде, содержащей 20 мкг / мл доксициклина. Конечная концентрация доксициклина составляет 10 мкг / мл. Vortex.
  14. Поворот трубы при 30 ° С в течение 2 дней.

3. Проточной цитометрии

  1. Добавить 900 мкл предварительно отфильтрованные TE буфером (рН 7,5), содержащем 10 мкг / мл доксициклина в 5-мл полипропиленовые трубы (BD Falcon # 352063) с крышкой местами с клеточнойФильтр колпачок с 5-мл полистирола трубки (BD Falcon # 352235). Полипропиленовые трубы предназначены для проточной цитометрии. Крышка фильтра требуется для удаления крупных частиц.
  2. Аккуратно поместите 75 мкл ТЕ-буфера с доксициклином на сотовом фильтр крышки.
  3. Добавить 25 мкл индуцированных клеток в растворе на крышке.
  4. Нажимая на кончике Pipetman против сеткой, снимать все комбинированного раствора через фильтр.
  5. Надавите на крышку фильтра и вихревой трубки.
  6. Подготовить коллекцию трубок (1,6 мл Eppendorf труб), заполненная 200 мкл SC-Его SC-лей.
  7. Начало клетки сортировщика и настройки параметров в зависимости от производителя руководства.
  8. Vortex как коллекция трубку (чтобы покрыть стены со средой) и пробирку, содержащую клетки, прежде чем загружать их на клетку сортировщика.
  9. Приобретать проточной цитометрии данных образца. Штамм не содержащих GFP может быть отрицательным контролем.
  10. Ничья ворота для сортировки. (A)Чтобы избежать клеточные агрегаты, которые могут обладать высокой интенсивности GFP, отказаться от выбросов с непропорционально большой ширины импульса для рассеяния вперед (FSC), используя участок шириной импульса и высота для MoFlo сортировщика или непропорционально малый FSC высоту с помощью сюжета высота FSC и FSC области для FACSAria сортировщик (рис. 5, верхней левой панели). (B) С большим FSC (область), как ожидается, для клеточных агрегатов, только взять клеток в нижние 20% в ФСБ, избегая регионов с самым низким FSC и боковые рассеяния (SSC) значения, где остатки клеток часто встречается (рис. 5, верхней правой панели). (C) SSC (области) и GFP сигнала (область), часто положительно коррелируют. Потому что просто взять самые яркие клетки данного ворот выше, также обогащают для клеток с высоким значением SSC, нарисуйте ворота по периферии населения, использующего участок GFP интенсивности и SSC взять такой же процент из самых ярких клеток из каждой точки ГНЦ оси (рис. 5, бутОМ-левая диаграмма). Население выбран в (С) должно быть 0,1-1% населения, выбранный в (B).
  11. Сортировка 200 клеток в пробирку с учетом критериев (3,10). Для процесса в массовом порядке или для других проектов, требующих более сложной населения, сортировку больше клеток по мере необходимости.
  12. Vortex пробирки для покрытия отсортированных клеток со средой.
  13. Плита подмножество клеток (например, 50 ячеек) на тарелку YPDA для генотипирования.
  14. Инкубировать при 30 ° С в течение 2 дней.
  15. Сделать лизат для ~ 12 колоний следующие шаги (1,5) - (1,8).
  16. Передача остаточных клеток на кончике используется в (1,5) в пятно на тарелке YPDA содержащей G418 и Nat, осторожно касаясь пластины с наконечником. Выбранный гаплоидов не должны расти на этой пластинке. Диплоиды может иметь несколько копий GFP и поэтому может быть ярче. Этот тест может показать эффективность гаплоидных выбор.
  17. Для генотипирования, анализировать 1 мкл лизатов с помощью 10-мкл ПЦР-Reaction с прямым праймером, что отжига выше по течению фланкирующей области каждом удален ген в паре с грунтовкой последовательности CCTGAGAAAGCAACCTGACC.
    Мультиплекс ПЦР-реакции, если возможно (условия могут быть определены с использованием лизатов одиночных мутантов). ПЦР может быть сделано в 96 - или 384-луночных формате. Последний формат подходит для реакции объемом всего 5 мкл. Выстроив из ПЦР смесей, отличающихся грунтовки и добавление клеточных лизатов этих смесей может быть осуществлена ​​с использованием многоканальной пипетки или жидкого робота обработки. Совет изменения не являются обязательными при добавлении же лизат различных смесей ПЦР.
  18. Анализ продуктов ПЦР. Гель XL Ultra V-2 электрофорез системы (Labnet) совместим с загрузки образца использовании многоканальных пипеток.
  19. На основании информации из (3,16) и (3,18), определить вероятность гаплоидов, что желали генотипов.
  20. Создание этих штаммов на свежей пластинки (YPDA, CAA-УПА, или SC-Ura-His/Leu). Кроме того, заморозить их в25% глицерина при температуре -80 ° C. Дополнительные тесты, такие как подтверждение отсутствия дикого типа последовательностей генов для удаленных и импульсных поле гель-электрофореза рекомендуется.
  21. Повторите сексуальной езда на велосипеде из (2,1) полезных штаммов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когда-гаплоидные штамма с четырьмя GFP-заметным делеции (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) были скрещены с α-гаплоидные штамма с четырьмя делеции (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), с двумя делеции (ycl033cΔ yer042wΔ) на территории двух штаммов, представитель результат был получен. Спаривания смесь культивировали в среде, содержащей YPDA G418 и Нат, чтобы выбрать диплоидов. В результате диплоиды культивировали в споруляции среды. Споры были разогнаны zymolyase лечения и ультразвуком, а п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как мы разработали подход Зеленый Монстр, мы были обеспокоены возможностью рекомбинации между различными кассетами замены GFP, что приводит к перестройке генома. Смягчение против этой возможности нашего выбора для клеток, которые успешно прошли несколько раундов спаривания и мейоза. Клетки, несущие переставить геномов как ожидается, будут менее приспособленных после спаривания в клетках, не идентичны перестройки. Действительно, мы не наблюдали нестабильность генома в результате рекомбинации между кассетами GFP 11.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана США Defense Advanced Research Projects Agency контракту N66001-12-C-4039, чтобы Ю.С., грант от Alfred P. Sloan Foundation в РГБ и американского Национального института здравоохранения грантов R01 и R21 HG003224 CA130266 в FPRFPR было Также поддерживается общение от Канадского института передовых исследований и исследований Канады программы мастерства председателей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента или инструмент Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
G418 Sigma-Aldrich A1720 Растворите в воде и фильтр-стерилизовать (0,2-мкм фильтр). Со концентрации 200 мг / мл. Хранить при температуре 4 ° C.
ClonNAT (nourseothricin) WERNER биоагентов 5001000 Растворите в воде и фильтр-стерилизовать (0,2-мкм фильтр). Со концентрации 100 мг / мл. Хранить при температуре 4 ° C.
Доксициклин Sigma-Aldrich D9891 Растворить в 50% этанола и фильтр-стерилизовать (0,2-мкм фильтр). Со концентрации 10 мг / мл. Сделайте свежие каждые четыре недели. Щит от света, используя алюминиевую фольгу и хранить при 4 ° C.
Zymolyase ZymoResearch E1005
Difco азотистого основания дрожжей без аминокислот BD 291940
Revolver (ротатор для труб) Labnet H5600
Enduro Gel XL электрофореза блок Labnet E0160
Sonifier 450 Брэнсон 101-063-198
Микронаконечником для Sonifier 450 Брэнсон 101-148-062
FACSAria клетки сортировщик BD
MoFlo клетки сортировщик Beckman-Coulter
Biomek FX или эквивалентная робот Beckman Coulter Необязательно. Для создания генотипирование ПЦР.

Ссылки

  1. Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).
  2. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  3. Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues. Genetics. 157, 1117(2001).
  4. Wieczorke, R., et al. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS letters. 464, 123-128 (1999).
  5. Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Genetics. 116, 541-545 (1987).
  6. Akada, R., et al. PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 399-405 (2006).
  7. Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic acids research. 24, 2519(1996).
  8. Delneri, D., et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system. Gene. 252, 127-135 (2000).
  9. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).
  10. Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast. Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).
  11. Suzuki, Y., et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection. Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).
  12. Winzeler, E. A. Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  13. Woods, R. A., Gietz, R. D. High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).
  14. Hughes, T. R., et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling. Nature. 25, 333-337 (2000).
  15. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15, 1541-1553 (1999).
  16. Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441, 840-846 (2006).
  17. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962(2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GFP
Зеленый монстр процесса генерации штаммов дрожжей проведение нескольких удалений Гена
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.