Методическая статья

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

18.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4110

⸱

26 августа 2012 г.

 , 
1Department of Life Sciences, Imperial College London

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод сродство с метками очистки рекомбинантных белков с использованием жидкого обработки робототехники. Этот метод обычно применяется к мелким очистки растворимые His-меченных белков в высокой пропускной способности формате.

Аннотация

Рентгеноструктурный анализ является предпочтительным методом для получения детального представления о структуре белков. Подобные исследования необходимо дополнять дальнейшим биохимическим анализом для более глубокого понимания взаимосвязи между структурой и функцией. Достижения в технологиях синтеза олигонуклеотидов и генов делают стратегии широкомасштабного мутагенеза все более доступными, включая замену целевых остатков всеми остальными 19 аминокислотами. Последующее выявление фенотипов с усилением или потерей функции позволяет делать систематические выводы, например, о вкладе конкретных остатков в каталитическую активность, стабильность белка и/или специфичность белок-белковых взаимодействий.

Чтобы отнести различные фенотипы к природе мутации, а не к колебаниям экспериментальных условий, крайне важно очищать и анализировать белки контролируемым и воспроизводимым образом. Стратегии высокопроизводительного скрининга и автоматизация ручных протоколов на роботизированных платформах для работы с жидкостями создали возможности для выполнения таких сложных молекулярно-биологических процедур с минимальным участием человека и низким уровнем ошибок1-5.

В данной работе мы представляем общий метод высокопроизводительной очистки рекомбинантных белков с His-тегом. В недавнем исследовании мы применили этот метод для детального изучения взаимосвязи структуры и функции TFIIB — компонента базального аппарата транскрипции. TFIIB незаменим для промотор-зависимой транскрипции in vitro и необходим для привлечения РНК-полимеразы в преинициаторный комплекс6-8. TFIIB содержит гибкий линкерный домен, который проникает в щель активного центра РНК-полимеразы9-11. Этот линкерный домен обеспечивает две биохимически измеряемые активности TFIIB, а именно: (i) стимуляцию каталитической активности на стадии «абортивной» инициации транскрипции и (ii) дополнительный вклад в специфическое привлечение РНК-полимеразы в преинициаторный комплекс4,5,12. Мы использовали метод высокопроизводительной очистки для создания единичных, двойных и тройных замещающих и делеционных мутаций в линкере TFIIB с последующим анализом их стимулирующего эффекта на каталитическую активность РНК-полимеразы в функциональных тестах4. В общей сложности мы получили, очистили и проанализировали 381 мутант — задача, выполнение которой вручную было бы крайне трудоемким и длительным. Мы синтезировали и тестировали белки в нескольких повторностях, что позволило нам оценить любые экспериментальные вариации и получить четкое представление о воспроизводимости наших результатов.

Данный метод представляет собой универсальный протокол очистки белков с His-тегом и был успешно применен для очистки других рекомбинантных белков. На данный момент он оптимизирован для очистки 24 белков, однако может быть адаптирован для очистки до 96 белков.

Протокол

ЧАСТЬ: Высокая пропускная рост бактериальных культур.

1. Вырастить бактерии Ночевка в 2 мл Autoinduction среды с использованием 24-луночных планшетах

  1. Стерилизуйте 24-луночные планшеты в микроволновую печь.
  2. Инокулировать 1,5 мл autoinduction среды (Overnight Средний Express) с недавно выросли колонии бактерий или замороженных запасов глицерина. Мы обычно прививают трех скважин на мутанта с тремя отдельными клонированных колоний. Резервный шесть скважин для положительного и отрицательного контролей. Для положительного контроля мы растем три клона дикого типа и для отрицательных контролей мы растем 2 клона, которые были трансформированы без выражения плазмиды. Проверьте, достаточно ли стерилизация пластины, оставив одну скважину пустой на среднесрочную только контроль.
  3. Рост клеток в течение 18 часов при температуре 37 ° C и встряхивании при 250 оборотах в минуту. Мы используем лак-индуцируемых BL21 (DE3) Rosetta 2 клетки. Autoinduction среда содержит смесь глюкозы и лактозы. Бактерии изначальнопитаются глюкозой, а затем начать использовать лактозу, который также индуцирует экспрессию рекомбинантных белков.
  4. Снимите крышку и поместите пластину на роботизированной платформе.

Часть B: Robotic очистки рекомбинантных белков.

2. Подготовка роботизированной платформы

  1. Макияж промывочный буфер, состоящий из 20 мМ имидазола, 0,1% Тритон Х-100, 0,5 М NaCl, 20 мМ Трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ MgOAc 2, 0,7 мМ ZnOAc 2, 10% глицерина, и элюции буфера, состоящего 0,5 М имидазола, 0,1% Тритон Х-100, 0,5 М NaCl, 20 мМ Трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ MgOAc 2, 0,7 мМ ZnOAc 2, 10% глицерина. Эти буферы будут использоваться для мытья шариков после отмеченных белки были связаны с ними, или для элюции белков из бисера, соответственно.

  2. Макияж бактериальной разбавителя (100 мл дистиллированной воды, 15 мкл реагента пеногаситель). Это решение будет использоватьсясделать разведение бактериальных культур для ночлега оптической плотности (A600) измерений. Наличие пеногаситель в разбавителем предотвращает образование пузырьков воздуха, которые будут мешать измерениям ридер.
  3. Макияж лизиса раствор, состоящий из 10х реагента FastBreak, 2 мкл lysonase на образец и 15 мМ MgOAc 2. FastBreak содержит смесь синтетических моющих средств и солей, которые нарушают стенки бактериальных клеток и способствовать освобождению внутриклеточных белков. Lysonase является собственностью смесь лизоцима и нуклеазы. Лизоцим оказывает помощь в срыве клеточной стенки и нуклеазы сборники выпущены бактериальных нуклеиновых кислот.
  4. Дополнительно: Макияж 6 М гуанидина гидрохлорида раствор. Некоторые рекомбинантные белки, как правило, придерживаются тефлоновым покрытием пипетки иглы. Гуанидингидрохлорида решение денатурации белков и моет их, более эффективно, чем вода, которая обычно используется для промывки моющиеся роботов пипетки советов после каждого йEP.
  5. Подготовка BCA (bicinchoninic кислоту) белок количественный реагентов путем смешивания bicinchoninic кислоты (реагента) и раствор сульфата меди (реагент B): пептидных связей снижения Cu 2 + из CuSO 4 компонента, присутствующего в BCA реагентов для Cu 1 + которому количество Cu 1 + пропорционально количеству пептидных связей, присутствующих в растворе. На втором этапе, две молекулы кислоты bicinchoninic хелатных Cu 1 + в результате поглощения сдвиг до 562 нм, в результате фиолетового цвета. Цветной реакции зависит от времени и обычно требуется несколько часов, чтобы быть окончательным. После этого цвет стабильны в течение нескольких часов.
  6. Заполните впадины или пластины нужного размера и поместить их в предварительно выделены позиции на роботизированной платформе.
  7. Поместите один 24-луночный планшет для отходов гуанидингидрохлорида, два четких 96-луночные планшеты для OD 600 и поглощения измерений и одна синяя 96-луночный планшет для гоэлектронной очищенных белков по их позициям на платформе. Поместите один 96-Deepwell табличка на магнитной подставке.
  8. Развести MagneHis Ni-частиц, которые связываются белками, образуя хелаты с Его-теги 5-кратное в дистиллированной воде и залить их в шарик перемешивания устройство. Включите мешалку на хранить бусины в виде суспензии.
  9. Переключитесь на роботизированной платформе и промойте пипетки иглы в течение нескольких минут, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые иначе влияют на точность пипетки. Многоразовые иглы пипетирования сбрасываются между отдельными шагами пипетирования. Кроме того, одноразовые наконечники могут быть использованы. Все последующие шаги осуществляются робота. Робота протокола предоставляется по запросу.

3. Рост клеток проверяют, измеряя OD600

  1. 10 мкл ночной культуры разводят в 90 мкл разбавителя решение.
  2. Измерьте OD 600 для того, чтобы бактерии выросли по похожей плотности(Рис. 1).

4. Клетки разрушаются, чтобы освободить Белки и Разрешить бисера-связывающий

  1. 100 мкл магнитных Ni-шарик подвески распределяется в каждую лунку второй 24-луночный планшет.
  2. 900 мкл каждого мелкого бактериальной культуры переносят в 24-луночный планшет, содержащий бисера. Добавить 100 мкл 10x FastBreak / lysonase смеси.
  3. 24-луночный планшет передается сотрясение платформу для быстрого встряхивании (800 оборотов в минуту) в течение 30 мин при комнатной температуре. Бактериальные клеточные стенки разрушаются сочетание механических сил и действием химических и рекомбинантных белков выпущен в раствор. С их теги сродство они сразу же связываются парамагнитного бисером хелатирующие никеля.

5. Бисер промывали

  1. Клеточных лизатов содержащие ресуспендированных магнитных шариков переданы в 96-Deepwell пластины, которая расположена на стенде с мagnetic стержней, которые скользят между скважинами. 96-луночные получили квадратные конусообразной нижней части, который позволяет упростить удаление супернатанта. Скважины может содержать объемом до 2,1 мл, но наполнены гораздо меньших объемах. Это позволяет нам выполнять энергичного встряхивания шаги без образца перекрестного загрязнения от брызг.
  2. Наконечники моют между отдельными пипетками шаги с 6 М гуанидин-HCl. Этот шаг является решающим для очистки TFIIB и другие "липкие" белки, чтобы избежать перекрестного загрязнения. С другими белками может быть достаточным для промывки иглы большим количеством воды между пипеткой шаги.
  3. Магнитные стержни магнитной подставкой привлечь парамагнитного бисера, вытягивая их от центра скважины и позволяет пипетки иглы свободного доступа к супернатант. Супернатант отбрасывают.
  4. 500 мкл промывочного буфера сначала добавляют в 24-луночный планшет, а затем переведен в 96-луночный планшет на еNsure полной передачи бисера. 24-луночный планшет будет удален из шейкера.
  5. Еще 500 мкл промывочного буфера добавляют непосредственно в 96-луночный планшет, пластины передается в шейкер и энергично встряхивают в течение 1 мин. Пластина вернулся в магнитном стенде и промывочного буфера отбрасываются.
  6. Этот шаг повторяется дважды, и процедуру промывания закончен, удалив все остатки буфера от пластины.

6. Элюируйте Белки в буфера для элюции

  1. 100 мкл буфера элюирования добавляют в гранулы, пластины перемещается в шейкер и энергично встряхивают в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. Пластина вернулся в шейкере и элюата, содержащего очищенный рекомбинантный белок, переносится в новую пластинку.

7. Измерения концентрации очищенных белков

  1. 190 мкл смеси реагентов BCA передается четко 96-луночный планшет и 10 мкл пробелка раствор добавляли.
  2. После нескольких часов инкубации (обычно 5-6 или на ночь), измерить оптическую плотность и сравнить его с BSA стандартов для определения концентрации каждого из очищенных белковых препаратов (рис. 2).
  3. Очищенных белков теперь могут быть использованы для последующего применения в соответствующей концентрации (рис. 3).

8. Представитель Результаты

Очистка протокол предлагает две стадии контроля качества, примеры которых приведены. Мы можем выявить и документировать возможные проблемы на бактериальную стадию роста (рис. 1), а позже при оценке доходности очищенных белков (рис. 2). Как правило, мы очистить белками и проверять их в трех экземплярах. Это, в сочетании с двух шагов контроля качества, дает нам уверенность, что любые изменения мы наблюдали в наших функциональных анализов в связи с мутантным phenotypе (рис. 3), а не вызваны экспериментальные вариации или неудачные очищения. Выходы, полученные обычно составляет от 50-200 мкг и более чем достаточно для различного функционального анализа.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Гистограмма измерений ОП 24-луночный планшет с ночевкой культур. Три клоны шести TFIIB мутантных вариантов, а также дикого типа TFIIB были выращены. Два клона проведение без выражения плазмиды и хорошо со средним служить лишь в качестве отрицательного контроля. OD измерения показывают, что есть небольшие вариации в темпах роста между отдельными культурами.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Белки выходы, полученные из этих культур определяется анализом BCA и подтверждено PAGE SDS. Один из вариантов не выражается на высоких уровнях. В комкомбинации с рисунка 1, мы можем заключить, что это не было связано с дифференциальным роста клеток, но из-за экспрессии белка не индуцированные правильно.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Представитель результате транскрипции анализа. Мы измерили стимуляции активности TFIIB варианта на производстве небольших неудачных протоколов по РНКП. Здесь, стимуляция последствий полную библиотеку одной аминокислотные замены TFIIB остаток K87 показано. Высокая степень воспроизводимости подтверждается небольшой процент ошибок. Образца геля, демонстрирующий работу трех мутантов по сравнению с дикого типа (WT), отрицательного контроля (НК) и элюции буфером только контролирует изображен внизу.

Обсуждение

Автоматизированные рекомбинантного метода очистки белков описано здесь позволяющий производства и очистки большого количества мутантных белков в небольшом масштабе формате при весьма воспроизводимых условиях с минимальным вмешательством человека. Рисунки 1 и 2 показывают результаты систематического контроля качества и примеры очищенных белков. 3 видно, что очищенная транскрипционных факторов, используемых в этом примере выполняет в высшей степени воспроизводимым образом в функциональном анализе.

Хотя процедура была разработана для очистки архейных TFIIB, он широко применяется для очистки сродство-меченных белков. Использование таких автоматизированных протоколы очистки, таким образом, значительно облегчит биохимический анализ рекомбинантных белков и таким образом углубить наше понимание белок-белковых взаимодействий в масштабах, которые трудно достичь вручную.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Wellcome гранта (078043/Z/05/Z), чтобы ROJW

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Ночевка Экспресс мгновенных Средний ТБ Merck Chemicals Ltd 71491-4
FastBreak Promega ООО V8573
Lysonase реагентов Bioprocessing / 1 мл Merck Chemicals Ltd 71230
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Company Ltd A6426
MagneHis Ni-частицы Promega V8565
Имидазол Sigma-Aldrich Company Ltd 56750
Trizma базы Sigma-Aldrich Compлюбая ООО 93362
NaCl VWR 27810.295
Bicinchoninic определения белка кислота Sigma-Aldrich Company Ltd BCA1-1KT
Планшета с глубокими ячейками 2,2 мл площади Wells PP PK10 Anachem Ltd 1810-00
Микропланшетов микролуночные 96 лунок с плоским дном полистирол не лечится 12 рукава из 5 пластин ясным 0,4 мл и объеме 128 мм х 86 мм Thermo Scientific Nunc Fisher Scientific ООО DIS-984-090M
Микропланшетов синий VWR NUNC367001
24-Ну блоки RB (24) Qiagen 19583
Гуанидингидрохлорида VWR ALFAA13543.0B
Моющиеся иглы для TheOnyx Aviso GmbH 8152-317001
Реагент Стойка для магнитных шариков Aviso GmbH 8152-035003
Ридер Synergy HT BioTek 4200-000043
Роботизированная платформа TheOnyx 44OH/150/100 Aviso GmbH 8145-050046
Шейкер для микропланшетов Variomag Teleshaker Inheco 3800047
96-а Тип магнита Qiagen 36915

Ссылки

  1. Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  2. Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
  3. Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40(2008).
  4. Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
  5. Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. Revealing the Function of TFIIB. Transcription. , Forthcoming (2011).
  6. Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
  7. Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
  8. Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
  9. Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
  10. Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
  11. Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
  12. Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).

Перепечатки и разрешения

Теги

HisSDS PAGE
Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.