Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Summary

Методы разработку и утверждение количественного анализа флуоресценции для измерения активности калия внутрь выпрямителя (Кир) каналы высокой пропускной скрининга соединений представлены.

Abstract

Специфические члены семейства калиевых каналов внутреннего выпрямителя (Kir) являются постулируемыми мишенями для лекарств при различных расстройствах, включая гипертонию, фибрилляцию предсердий и боль^1,2. По большей части, однако, прогресс в понимании их терапевтического потенциала или даже основных физиологических функций замедлился из-за отсутствия хороших фармакологических инструментов. Действительно, молекулярная фармакология семейства внутренних выпрямителей значительно отстает от молекулярной фармакологии суперсемейства потенциал-зависимых калиевых (Kv) каналов S4, для которых^{был открыт ряд} наномолярных аффинных и высокоселективных модуляторов пептидного токсина. Токсин пчелиного яда тертиапин и его производные являются мощными ингибиторами каналов Kir1.1 и Kir3^4,5, но пептиды имеют ограниченное применение как в терапевтических, так и в экспериментальных целях из-за их антигенных свойств и низкой биодоступности, метаболической стабильности и проникающей способности тканей. Разработка мощных и селективных низкомолекулярных зондов с улучшенными фармакологическими свойствами станет ключом к полному пониманию физиологии и терапевтического потенциала Kir-каналов.

Сеть центров производства молекулярных библиотек зондов (MLPCN) при поддержке Общего фонда Национальных институтов здравоохранения (NIH) создала возможности для академических ученых инициировать кампании по исследованию молекулярных мишеней и сигнальных путей, нуждающихся в улучшении фармакологии⁶. MLPCN предоставляет исследователям доступ к отраслевым скрининговым центрам, а также поддержку в области медицинской химии и информатики для разработки низкомолекулярных зондов для выяснения функции генов и генных сетей. Важнейшим шагом на пути к получению доступа к MLPCN является разработка надежного анализа, специфичного для мишени или пути, который поддается высокопроизводительному скринингу (HTS).

Здесь мы описываем, как разработать анализ потока таллия (Tl⁺) на основе флуоресценции функции канала Kir для высокопроизводительного скрининга соединений^7,8,9,10. Анализ основан на проницаемости пор канала K⁺ для родственной группы K⁺ Tl⁺. Коммерчески доступный флуоресцентный репортерный краситель Tl⁺ используется для обнаружения трансмембранного потока Tl⁺ через пору. Существует как минимум три коммерчески доступных красителя, которые подходят для анализа Tl⁺ флюса: BTC, FluoZin-2 и FluxOR^7,8. Этот протокол описывает разработку анализа с использованием FluoZin-2. Несмотря на то, что первоначально FluoZin-2 был разработан и продавался как индикатор цинка, он демонстрирует устойчивое и дозозависимое увеличение излучения флуоресценции при связывании Tl⁺. Мы начали работать с FluoZin-2 до того, как появился FluxOR^{в версии 7,8} и продолжаем работать в^9,10. Тем не менее, этапы разработки анализа по существу идентичны для всех трех красителей, и пользователи должны определить, какой краситель наиболее подходит для их конкретных потребностей. Мы также обсуждаем контрольные показатели эффективности анализа, которые должны быть достигнуты, чтобы быть рассмотренным для включения в MLPCN. Поскольку Tl⁺ легко проникает в большинство K⁺ каналов, анализ должен быть адаптируемым к большинству мишеней K⁺ каналов.

Protocol

1. Генерация Стабильный Поликлональные клеточных линий

1. Создание высокого качества стабильной клеточной линии, выражающие Кир канала интересов является важным первым шагом на пути создания надежной высокопроизводительного скрининга анализа. Учредительный K ⁺ канала гиперэкспрессия может привести к активации клеточной гибели пути, стабильной клеточной линии вырождения и потери качества анализа. Чтобы избежать этих потенциальных проблем и обеспечивают удобный внутреннего контроля для анализа развития (см. ниже), тетрациклин-индуцируемой экспрессии системы рекомендуется ^8.
2. Культура родительских T-REX-НЕК293 с использованием стан....

Results

Применение тетрациклина-индуцируемой экспрессии система обеспечивает удобный внутреннего контроля для различения Tl ⁺ поток через эндогенный пути и Кира канал интерес. Рисунок 1 показывает некоторые примеры ячейки покрытия карт, используемых в различных типах экспериментов. Положение лунки, содержащие неиндуцированных или тетрациклин клетках в обозначаются различными цветами. Рис. 2А показана карта источник пластины используются для определения оптимального Tl ⁺ ко.......

Discussion

Обработка данных: После того как данные собраны, общий шаг анализа заключается в нормализации флуоресценции ответ каждого колодца, F, к своему исходному значению в начале эксперимента, F _0. Это обычно упоминается как "статическое отношение" и символизирует "F / F ^_0". В случаях, когда F ₀ доминируют индикатора краситель статического соотношение существенно исправить многие факторы, такие как disuniformities освещения, сигнал сбора, и сотовый.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Тетрациклин-индуцируемой экспрессии вектора
T-REX-НЕК293	Invitrogen	R71007	Тетрациклин-индуцируемый клеточной линии
Lipofectamine LTX / Plus реагентов	Invitrogen	15338100	Трансфекции реагента
FBS	АТЛАНТА биологические	S11550	СМИ Клеточные культуры
DMEM	Invitrogen	11965	СМИ Клеточные культуры
Гигромицина	Invitrogen	10687-010	СМИ Клеточные культуры
Бластицидин S	Invitrogen	R210-01	СМИ Клеточные культуры
Пенициллина / стрептомицина	Invitrogen	15140	СМИ Клеточные культуры
HBSS-двухвалентных бесплатно	Mediatech	21022CV	Сотовые стиральные
Трипсин-0,25%	Mediatech	25053CI	Клеточная диссоциация
Тетрациклин-HCl	Сигма	T9823	Индукционная реагентов
Диализу FBS	АТЛАНТА биологические	S12650	Покрытие СМИ
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Флуоресцентный краситель
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Краска загрузки
HBSS	Invitrogen	14175	Буфер для анализа
HEPES	Invitrogen	15630	Буфер для анализа
NaHCO 3	Сигма	S6297	Tl + стимул буфер
MgSO 4	Сигма	M2643	Tl + стимул буфер
CaSO 4 • 2H 2 O	Сигма	C3771	Tl + стимул буфер
D-глюкозы	Сигма	G7528	Tl + стимул буфер
Таллия сульфат	Aldrich	204625	Tl + стимул буфер
HEPES	Сигма	H4034	Tl + стимул буфер
ДМСО	Сигма	D4540	Растворитель
Восьмиканальный электронных дозаторов	Biohit	E300	Сотовые покрытия в 384 -луночных
BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетов	BD Biosciences	356719	Анализ микропланшетов
Эхо квалифицированы 384-Ну полипропилена планшет (384PP)	Labcyte	P-05525	Микропланшеты соединение источника
384-луночных микропланшетов полипропилена	Greiner Bio-One	781280
Multidrop реагента Combi дозатором	Thermo Scientific	5840300
ELx405 микропланшетов шайбы	BioTek	ELx405HT	Автоматизированная стиральных клетки
Эхо жидкость обработчик	Labcyte	Labcyte Echo 550
Браво автоматизированной обработки жидких платформы	Agilent Technologies	Стандартное исполнение
HamamaТГУ FDSS 6000	Hamamatsu		Кинетическая изображений ридер