Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Summary

Методы разработку и утверждение количественного анализа флуоресценции для измерения активности калия внутрь выпрямителя (Кир) каналы высокой пропускной скрининга соединений представлены.

Abstract

Специфические члены семейства калиевых каналов внутреннего выпрямителя (Kir) являются постулируемыми мишенями для лекарств при различных расстройствах, включая гипертонию, фибрилляцию предсердий и боль^1,2. По большей части, однако, прогресс в понимании их терапевтического потенциала или даже основных физиологических функций замедлился из-за отсутствия хороших фармакологических инструментов. Действительно, молекулярная фармакология семейства внутренних выпрямителей значительно отстает от молекулярной фармакологии суперсемейства потенциал-зависимых калиевых (Kv) каналов S4, для которых^{был открыт ряд} наномолярных аффинных и высокоселективных модуляторов пептидного токсина. Токсин пчелиного яда тертиапин и его производные являются мощными ингибиторами каналов Kir1.1 и Kir3^4,5, но пептиды имеют ограниченное применение как в терапевтических, так и в экспериментальных целях из-за их антигенных свойств и низкой биодоступности, метаболической стабильности и проникающей способности тканей. Разработка мощных и селективных низкомолекулярных зондов с улучшенными фармакологическими свойствами станет ключом к полному пониманию физиологии и терапевтического потенциала Kir-каналов.

Сеть центров производства молекулярных библиотек зондов (MLPCN) при поддержке Общего фонда Национальных институтов здравоохранения (NIH) создала возможности для академических ученых инициировать кампании по исследованию молекулярных мишеней и сигнальных путей, нуждающихся в улучшении фармакологии⁶. MLPCN предоставляет исследователям доступ к отраслевым скрининговым центрам, а также поддержку в области медицинской химии и информатики для разработки низкомолекулярных зондов для выяснения функции генов и генных сетей. Важнейшим шагом на пути к получению доступа к MLPCN является разработка надежного анализа, специфичного для мишени или пути, который поддается высокопроизводительному скринингу (HTS).

Здесь мы описываем, как разработать анализ потока таллия (Tl⁺) на основе флуоресценции функции канала Kir для высокопроизводительного скрининга соединений^7,8,9,10. Анализ основан на проницаемости пор канала K⁺ для родственной группы K⁺ Tl⁺. Коммерчески доступный флуоресцентный репортерный краситель Tl⁺ используется для обнаружения трансмембранного потока Tl⁺ через пору. Существует как минимум три коммерчески доступных красителя, которые подходят для анализа Tl⁺ флюса: BTC, FluoZin-2 и FluxOR^7,8. Этот протокол описывает разработку анализа с использованием FluoZin-2. Несмотря на то, что первоначально FluoZin-2 был разработан и продавался как индикатор цинка, он демонстрирует устойчивое и дозозависимое увеличение излучения флуоресценции при связывании Tl⁺. Мы начали работать с FluoZin-2 до того, как появился FluxOR^{в версии 7,8} и продолжаем работать в^9,10. Тем не менее, этапы разработки анализа по существу идентичны для всех трех красителей, и пользователи должны определить, какой краситель наиболее подходит для их конкретных потребностей. Мы также обсуждаем контрольные показатели эффективности анализа, которые должны быть достигнуты, чтобы быть рассмотренным для включения в MLPCN. Поскольку Tl⁺ легко проникает в большинство K⁺ каналов, анализ должен быть адаптируемым к большинству мишеней K⁺ каналов.

Protocol

1. Генерация Стабильный Поликлональные клеточных линий

1. Создание высокого качества стабильной клеточной линии, выражающие Кир канала интересов является важным первым шагом на пути создания надежной высокопроизводительного скрининга анализа. Учредительный K ⁺ канала гиперэкспрессия может привести к активации клеточной гибели пути, стабильной клеточной линии вырождения и потери качества анализа. Чтобы избежать этих потенциальных проблем и обеспечивают удобный внутреннего контроля для анализа развития (см. ниже), тетрациклин-индуцируемой экспрессии системы рекомендуется ^8.
2. Культура родительских T-REX-НЕК293 с использованием стандартных методов в B-среде (DMEM роста среде, содержащей 10% FBS, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 5 мкг / мл бластицидин S). Используйте ранних клеток прохода (например, 3-4 проходов, так как оттаивание от хранения в жидком азоте) для трансфекции и стабильный выбор клон.
3. Плита 4 миллиона T-REX-НЕК293 в75 см ² колбы так, чтобы колбы составляет около 80% вырожденная на следующий день. Культура ночь в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
4. Трансфекции клеток с использованием 10-15 мкг pcDNA5/TO-Kir ДНК и Lipofectamine LTX / Plus реагент в соответствии с протоколом производителя. После 5 часов, заменить трансфекции среду с B-среде.
5. Через 24 часа после трансфекции, заменить B-среде с B-среде, содержащей 250 мкг / мл гигромицину (BH-среда), чтобы начать стабильную выбор клон. Поток клетки каждые 2-3 дней со свежим BH-среде.
6. Более 90% клеток должны умереть в течение следующих 7 дней, оставляя позади небольшие колонии стабильно трансфицированных клеток. Разрешить колонии расти в течение дополнительных 10-14 дней до расщепления на 175 см ² колбы для расширения.
7. Для криоконсервации, заморозить 3 х 10 ⁶ клеток / мл в среде, содержащей 45% обусловлен BH-средний, 45% антибиотиков, сыворотки, содержащей DMEM и 10% ДМСО. Замерзатьклеток в течение ночи при -80 ° C в контейнере замораживании клетки, а затем перейти на жидкий азот для длительного хранения. Оттепель клеток из жидкого азота с использованием рекомендуемого протокола Invitrogen автора. Обратите внимание, что жизнеспособность клеток будет ниже, если они заморожены из фляжки, что составляет более 75% вырожденная во время обработки.

2. Генерация Стабильный моноклональных клеточных линий

1. Вымойте суб-вырожденная 75 см ² колбы стабильной поликлональных клеток с двухвалентной без HBSS. Добавить 1 мл трипсина и инкубировать в течение 3-5 мин в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C. Добавить 5 мл BH-среды в колбе для ингибирования трипсина деятельности и растирают неоднократно (например, 5 раз), чтобы полностью отделить клетки. Внимательно осмотрите клетки под микроскопом, чтобы обеспечить подвеска почти полностью состоит из одной клетки. Это позволит увеличить вероятность получения моноклональных клеточных линий.
2. Определить плотность клеток и разбавитьПодвеска в концентрации от 0,7 клеток на 20 мкл. Использование многоканальных дозаторов, пипетки 20 мкл клеточной суспензии в каждую лунку BD PureCoat амина покрытием (или эквивалент поли-D-лизин покрытием) 384-луночных планшетах. В принципе, 70% скважин должны получать одну ячейку с этим покрытием условиях. Таким образом, 384-а пластина должна содержать более 200 клонов для анализа. Продолжить культивирования клеток в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
3. Через неделю, осмотрите пластины под микроскопом для скважин, содержащих отдельные колонии. Обратите внимание, их положение на крышке с постоянным маркером для дальнейшего использования. Не забудьте также отметить и исключить скважин, содержащих несколько колоний. Это наиболее легко узнать по появлению колоний, выросших из разных сторонах хорошо. Следует помнить, что испарение имеет тенденцию происходить быстрее из колодцев вблизи края пластины. Добавить BH-средних скважин, где значительное испарение произошло. В противном случае, это ненужное тO кормить клеток.
4. Мониторинг скважин чаще в течение следующих 7-10 дней. Клетки будут готовы делить, когда скважины интерес, по крайней мере, 50% вырожденная.
5. Разделить клетки, чтобы дублировать 384-луночные планшеты, одна пластина для опробования с Tl ⁺ поток, а другой для продолжения моноклональных линий в культуре. Аспирируйте среды из лунок, содержащих клеточных линий, представляющих интерес. Вымойте клеток с двухвалентной без HBSS, добавить 20 мкл трипсина в каждую лунку и передать пластины на 37 ° C инкубаторе в течение 15-20 мин. После перемещения пластины обратно в капот культуре клеток, добавить 20 мкл BH-среда в каждую лунку и растирают несколько раз, чтобы отделить клетки. Осмотрите скважин под микроскопом, чтобы обеспечить клетки полностью диссоциированы. Для этого может потребоваться несколько раундов пипетирования, так как клетки будут плотно приверженца. Как только клетки разобщены, передавать 10 мкл каждой клеточной суспензии, чтобы дублировать скважин новый BD PureCoat амина покрытием 384-луночный планшет. Будьте уверены, чтобы отметить связь между источником хорошо, и дублировать назначения скважины, так что клоны выставке надежный канал Кир деятельности (см. ниже) может быть прослежено к первоначальному хорошо. Добавить 20 мкл BH-среде на первоисточник хорошо кормить оставшихся клеток и продолжать их в культуру в 5% CO _{2-инкубаторе} при температуре 37 ° C.
6. Разрешить клетки в конечном пластины придерживаться и расти до недели. Как только большинство клонов составит не менее 50% слияния, они могут быть оценены на Кир канал активности с использованием Tl ⁺ поток анализа, описанного ниже.
7. За день до теста, аспирации культуральной среде и заменить его BH среде, содержащей 10% FBS диализу. Это предотвращает случайное выражение канала, которые могут возникнуть тетрациклин загрязненной сыворотки. Вызвать Кир канал выражение только в одной из дублирующих скважин для каждого клона в том числе 1 мкг / мл тетрациклина. Дублировать неиндуцированные также будет служить«Фон» управления. Выполните Tl ⁺ поток анализов как описано далее.

3. Генеральный Tl ⁺ поток Процедура анализа

1. За день до Tl ⁺ поток эксперимент, отделить клетки и количественного определения плотности клеточной суспензии, как описано в разделах 2.1 и 2.2. Пластина 20000 моноклональных клеток, стабильно трансфицированных геном Kir канал интерес в каждую лунку BD PureCoat амина покрытием 384-а диск с помощью Thermo Multidrop Combi или многоканального дозатора. Используйте BH среде, содержащей 10% FBS диализа для покрытия. Заметим, что некоторые клетки будут культивировали в течение ночи с 1 мкг / мл тетрациклина, чтобы побудить Кир канала выражении, в то время как другие не будут. Расположение индуцированных клеток и неиндуцированных будет отличаться для каждого типа эксперимента и показано на рисунке 1.
2. На следующий день, осмотрите пластины под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки являются приверженцем и равномерно распределяется по днускважин. Скважин должна быть 80-90% вырожденная.
3. Используйте ELx405 Промыватель микропланшетов, чтобы заменить среду клеточной культуры с 20 мкл на лунку HBSS буфера для анализа, содержащем 20 мМ HEPES и буфером до рН 7,3 с помощью NaOH. Кроме того, можно использовать "Флик и шлема" метод, при котором пластина переворачивается и щелкнул резко вниз, чтобы извлечь среду в мусорный контейнер, а затем похлопал сложены на бумажные полотенца, чтобы удалить оставшиеся средства массовой информации. Сразу добавить обратно HBSS буфера для анализа к плите, чтобы предотвратить клетки от осушающий.
4. Подготовка FluoZin-2, AM раствор красителя нагрузки. После кратковременного центрифугирования труб, растворить 50 мкг FluoZin-2 порошка в 100 мкл безводного ДМСО. На данный момент, аликвоты раствора 1000 х можно хранить при температуре -20 ° C для дальнейшего использования. Когда все будет готово к использованию, добавить 50 мкл 20% веса в объеме раствора Pluronic F-127/DMSO на краску и смешайте с осторожным пипетированием. Не замораживать красителя раз Pluronic F-127 был добавлен, какнизкая температура может привести к поверхностно-активным веществом, чтобы осадить из раствора. Добавить 150 мкл объема FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 до 100 мл HBSS буфера для анализа и аккуратно перемешать, чтобы краситель буфера загрузки. Использование Multidrop Combi или многоканального дозатора, добавить 20 мкл красителя буфера загрузки в каждую лунку, уже содержащей 20 мкл HBSS буфера для анализа. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение примерно 1 часа (как правило, инкубационный было сделано в темноте, хотя нет прямых доказательств того, что это необходимо).
5. В то время как клетки загрузки с красителем, подготовить стимул Tl ⁺ пластины. Свежий растворить 0,5 г бикарбоната натрия в 50 мл 5 раз Tl ⁺ стимул буфера, содержащего 1 мМ сульфата магния, 1,8 мМ сульфата кальция, 5 мМ глюкозы, 10 HEPES мм и 12 мм Tl ⁺ сульфат. Кроме того, бикарбонат натрия может быть заменен глюконат натрия, если, например, рН раствора должна быть в пределах очень узкого диапазона и потери углекислого газавызывает беспокойство. Закройте пробирку крышкой плотно, чтобы ограничить утечку углекислого газа и перевернуть несколько раз, пока бикарбонат натрия переходит в раствор. Использование многоканальных дозаторов, добавить 50 мкл раствора в каждую лунку полипропилена 384-луночный планшет (табл. 1).
6. После того, как клетки были загружены FluoZin-2, М., мыть тарелки с ELx405 Промыватель микропланшетов или с помощью "Флик и шлема" методом, как описано выше в разделе 3.3. В зависимости от типа Tl ⁺ поток эксперимента должны быть выполнены, добавить туда 20 мкл или 40 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Пластины готовы к экспериментам.
7. Клетки и Tl ⁺ плит в Hamamatsu функциональной системы скрининга лекарственных средств (FDSS) или эквивалент кинетической ридере изображений с интегрированным выдачи жидких возможности. Используйте соответствующие фильтры для флуоресцеина / флуоресцеина на основе красителей, таких как Fluo-4.
8. Установка одного дополнения протокола, так что 10 мкл 5x Tl ⁺Серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 40 мкл HBSS буфера для анализа. Запись базовой флуоресценции при частоте 1 Гц отбор проб в течение 10 сек. А-к-а флуоресценция должна быть равномерной и стабильной по всей пластине раз условия оптимального покрытия ячейки, мойки и красителей нагрузки устанавливаются. Интегрированный 384-канала дозатора используется для одновременного добавить стимул Tl ⁺ буфера в каждую лунку.
9. Запись по крайней мере 2 мин, так что скорость и пик Tl ^{+-индуцированное} увеличение флуоресценции захватил для обработки и анализа.

4. Определение оптимальной концентрации Tl +

1. Tl ⁺ легко проникает в самые внутренние выпрямителя K ⁺ каналы. Для того, чтобы Tl ⁺ концентрация не превышает динамический диапазон Tl ⁺ репортерного красителя FluoZin-2, следует эмпирически определить оптимальные концентрации Tl ^+, которые будут использоваться в высоко-тhroughput экрана. Мы рекомендуем концентрации Tl ^+, которая вызывает 80% от максимальной флуоресценции ответ (EC ₈₀₎ в условиях, когда канал максимально активированы.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием или эквивалент поли-D-лизином 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 40 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Как показал в своей тарелке карту на рисунке 1а, столбец 1 и строки А1-А23 должна содержать клетки, которые не были вызваны с тетрациклином и, следовательно, не выражаем Кир канал интерес. FluoZin-2 сигналов флуоресценции от неиндуцированных скважин будет использоваться для определения уровня Tl ⁺ поток через эндогенные путей, таких как Na ⁺ - K ^{+-АТФазы} насос и напряжение закрытого K ⁺ каналы, которые обычно выражаются в НЕК- Клетки 293.
3. Использование Agilent Bravo автоматизированной обработки жидких платформы или ручной пипетки для подготовкиодиннадцать точки Tl ⁺ концентрация серии разведений в буфер анализ HBSS. Как правило, 3-кратные серийные разведения серии в диапазоне от 100% до 0,002% Tl ⁺ оценивается в анализе. Серия должна быть составлена ​​на 5-кратным концентрацию, потому что Tl ⁺ решения будет разбавляться 1:5 в окончательный анализ. Подготовка серии разведений путем разбавления стандартного 5x Tl ⁺ буфер описано в разделе 3 с 5-кратным Tl ^{+-свободный} буфер, содержащий 1 мМ сульфата магния, 1,8 мМ сульфата кальция, 5 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES. Опять же, только растворить 0,5 г бикарбоната натрия в 50 мл конечного буфера Tl ⁺ непосредственно перед покрытием в полипропиленовой 384-луночный планшет в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 2А.
4. Загрузите клетки и Tl пластины ⁺ стимул в FDSS. Установка одного дополнения протокола, так что 10 мкл 5x Tl ⁺ серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 40 мкл HBSS буфере. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции в течение 10 секунд, прежде чем добавить Tl ⁺ к плите. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

5. Определение чувствительности анализа в ДМСО

1. Малых молекул допрошен в высокой пропускной способности экрана растворяют в органическом растворителе диметилсульфоксид (ДМСО), который сам по себе может влиять на производительность анализа. Таким образом, чувствительность теста в ДМСО сначала должны быть рассмотрены с целью установить высокие концентрации ДМСО допустимого на экране.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Вся пластинка должна содержать клетки, которые были вызваны с тетрациклином (рис. 3А).
3. Используйте Bravo Автоматизированная платформа обработки жидких или ручной пипетки для подготовки одиннадцать точке DMSO концентрации разведения серии в HBSS буфера для анализа. Как правило, в 2-кратном разведении серии в пределах от 10% до 0,01% об / об ДМСО оценивается на деятельность в анализе. Серия должна быть составлена ​​на 2x концентрация ДМСО, потому что решения будут разбавлять наполовину в окончательном анализе. Разбавления серии должны быть покрыты в полипропиленовой 384-луночный планшет, в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 3А.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе EC ₈₀ или оптимальное Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Загрузите клетки, ДМСО и Tl ⁺ стимул плит в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x концентрация ДМСО серия будет добавлена ​​в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Оставьте ДМСО на клетки для того же количества времени клетки будут подвергаться небольшой автомобиль молекулы при экраном. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции нане менее 10 секунд, прежде чем добавить 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.
6. Анализа должны быть терпимы к ДМСО концентрации не менее 0,1% об / об для типичного высокой пропускной способностью экрана, в которой соединения испытывают при концентрации 10 мкМ.

6. Определение чувствительности анализа в известных фармакологических модуляторов

1. После определения оптимальной концентрации Tl ⁺ и ДМСО толерантности анализа, последствия известны фармакологически активных веществ на канале Кир-опосредованной Tl ⁺ потока должны быть изучены. Эта серия опытов будет проведена оценка чувствительности анализа, умение ранга порядка соединений на основе их активность, способность классифицировать соединений на основе их образ эффективности (например, активаторов, ингибиторов), и определение хорошо себя соединения управления, которые будут использоваться позже в Анализ DАЗВИТИЕ и экрана.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Колонка 1 и строки А1-А23 должна содержать клетки, которые не были вызваны с тетрациклином (рис. 4а).
3. Используйте Bravo Автоматизированная платформа обработки жидких или ручной пипетки для подготовки одиннадцать точки концентрации разведения ряд известных модуляторов в HBSS буфера для анализа. Как правило, в 3-кратном разведении серии в диапазоне от 100 мкм до 2 нм оценивается по активности в тесте. Серия должна быть составлена ​​на 2x концентрация ДМСО, потому что решения будут разбавлять наполовину в окончательном анализе. Разбавления серии должны быть покрыты в трех экземплярах, полипропилен 384-луночный планшет, в соответствии с пластиной карте показано на рисунке 4а. Будьте уверены, что разведение сделаны таким образом, чтобы конечная концентрация ДМСО такие же, между лекарства и меньше тха N или равна предельно допустимой концентрации ДМСО, определенных в разделе 5.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе оптимального Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Загрузите клетки, соединения и Tl пластины ⁺ стимул в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x серии концентрации соединения добавляют в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Добавить соединений в клетке пластины и инкубировать в течение 20 мин. Обратите внимание, что оптимальное время инкубации для соединений для выявления лучшего сигнала к фону можно определить, запустив серию экспериментов, в которых пара разное время инкубации избранных. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции по крайней мере 10 секунд перед добавлением 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

_title "> 7. Шахматная анализ

1. В следующей серии экспериментов, равномерность и воспроизводимость анализа будут оцениваться с использованием "шахматной доски" анализ. Как правило, контроль ингибитора помещают в любой другой хороший каждого столбца и строки 384-луночный планшет, как показано на рисунке 5А. Для строго оценивать шум в анализе, EC ₈₀ концентрации ингибитора должна быть использована. ДМСО добавляют в другие скважины в качестве средства контроля. Tl ⁺ поток в ДМСО и наркотиков обработанных клеток используется для расчета значения Z премьер, статистическая мера а-к-а изменчивость между двумя популяциями скважин. Премьер-Z рассчитывается по формуле:
   Премьер-Z = 1 - _(р + 3SD 3SD _п) / | означает, _р + означает _п |
   где SD стандартное отклонение, р раскованно потока и п полностью тормозится поток ценностей. Анализ со значениями Z 'больше или равно 0,5 на 3 отдельные дни считаются сUITable для высокопроизводительного скрининга.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3, в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку. Обратите внимание, что вся пластинка должна быть вызваны с тетрациклином.
3. Сделайте соединение / ДМСО пластины с помощью пипетки в 384-луночные полипропиленовые пластины с использованием многоканальных дозаторов, 80 мкл / лунку известный ингибитор канала целевой Кир при концентрации определены в разделе 6.5, и 0,1% об / об ДМСО автомобиля, как показано на рисунке 5а. Добавить известный ингибитор, начиная с A1 и использовании многоканальных дозаторов и заместителя хорошо B2 и так далее до и B24. Повторите эту процедуру с ДМСО, начиная с хорошо B1 и так далее до и A24. Окончательный вариант пластинки должно совпадать с шахматной доски.
4. Подготовка 5x Tl ⁺ стимул плиты на основе оптимального Tl ⁺ определены в разделе 4.
5. Загрузите клетки, соединение и Tл ⁺ стимул плит в FDSS. Установить два дополнения протокола, так что 20 мкл 2x серии концентрации соединения добавляют в соответствующие лунки ячейки пластины, содержащей 20 мкл буфера для анализа HBSS. Добавить соединений в клетке пластины и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Запись базовой FluoZin-2 флуоресценции по крайней мере 10 секунд перед добавлением 10 мкл 5x Tl ⁺ буфера в каждую лунку клеточной пластинки. Повторите эксперимент на 3 отдельных дней, чтобы установить воспроизводимость результатов.

8. Пилот экрана

1. В заключительном этапе анализа развития, выполнить пилотный экран несколько тысяч соединений для оценки результатов анализа в условиях, которые будут использоваться в конечном счете в крупномасштабных высокой пропускной способностью экрана.
2. Plate, краситель нагрузки и промыть клетки BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетах, как описано выше в разделе 3), в результате чего 20 мкл HBSS аналитического буфера в каждую лунку.Обратите внимание, что вся пластинка должна быть культивировали в течение ночи с тетрациклином, чтобы побудить Кир канал выражения.
3. Выберите примерно 2.000 до 3.000 структурно разнообразных соединений для проверки. Очень часто соответствующего и удобный в использовании соединений с известными коллекциями деятельности, потенциально обогащенные для модуляторы ионных каналов. Такие наборы включают Spectrum Collection (MicroSource) и LOPAC коллекции (Sigma). Кроме того, целесообразно включить известные модуляторы Кир интерес в экспериментальном экране. В идеале эти соединения будут добавлены в скважинах слепым, чтобы дать объективное тестирование хита сбор методов, описанных ниже. Подготовка соединений в 384-луночные полипропиленовые плиты (плиты назначения) с помощью жидких Labcyte Handler Echo или подходящим инструментом штифт для передачи соответствующего объема выбранных соединений в ДМСО из коллекции MLPCN (источник плит) к месту назначения пластин Обратите внимание, что тест соединения Только в колонках 3-22;В любой другой хорошо столбцов 1, 2, 23, 24 добавить известный ингибитор в концентрации известны в полной мере подавлять Кира, как это определено в разделе 7. В остальных скважинах столбцы 1, 2, 23 и 24 добавить соответствующий объем ДМСО для получения концентрации ДМСО из контрольной группы транспортных средств. Развести все скважин с использованием аналитического буфера Multidrop Combi. Обычно тест соединения будет составлять 20 мкм, 2-кратный выше их концентрация скрининга цели.
4. Сделать Tl ⁺ стимул пластин на основе оптимального Tl ⁺ определяют концентрацию в разделе 4.
5. Выполнение пилотного экрана. Позаботьтесь, чтобы поразить шагов выполнения протокола для поддержания соответствует времени между пластинами в преддверии отбора пилотов.
6. Как только пилот экран завершения анализа шахматной скважин из колонки 1, 2, 23 и 24 с использованием Z-премьер уравнения. Проверьте пластины, которые показывают, Z-премьер значения менее 0,5 для определения источника плохое разделение контроля населения. Удар бэлектронной выбирается с помощью ряда методов. Для пилотного экранах она является общей для вычисления среднего значения и стандартного отклонения населения управления транспортным средством и забрать хиты основана на скважинах значения> / = 3 стандартных отклонения от среднего транспортного средства контроля.
7. После удара сбор, повторное тестирование выбранных хитов в двух экземплярах, 2 комплекта пластин. Один набор пластин содержит стабильные клетки Кир в отсутствии тетрациклина, а другой стабильной клеточной линии Кир в присутствии тетрациклина. Хиты, что повторное тестирование положительные, по крайней мере один из двух повторных испытаний пластин и не показывают значительную активность в неиндуцированных пластины можно считать проверено хитов. Изучите проверено расстрельный список, чтобы определить, сколько из "скрытых" контрольных образцов не было обнаружено. Невозможность определить контроля в экспериментальном экране указывает на необходимость дальнейшей оптимизации скрининга или хит-сбор параметров.

Results

Применение тетрациклина-индуцируемой экспрессии система обеспечивает удобный внутреннего контроля для различения Tl ⁺ поток через эндогенный пути и Кира канал интерес. Рисунок 1 показывает некоторые примеры ячейки покрытия карт, используемых в различных типах экспериментов. Положение лунки, содержащие неиндуцированных или тетрациклин клетках в обозначаются различными цветами. Рис. 2А показана карта источник пластины используются для определения оптимального Tl ⁺ ко...

Discussion

Обработка данных: После того как данные собраны, общий шаг анализа заключается в нормализации флуоресценции ответ каждого колодца, F, к своему исходному значению в начале эксперимента, F _0. Это обычно упоминается как "статическое отношение" и символизирует "F / F ^_0". В случаях, когда F ₀ доминируют индикатора краситель статического соотношение существенно исправить многие факторы, такие как disuniformities освещения, сигнал сбора, и сотовый...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Тетрациклин-индуцируемой экспрессии вектора
T-REX-НЕК293	Invitrogen	R71007	Тетрациклин-индуцируемый клеточной линии
Lipofectamine LTX / Plus реагентов	Invitrogen	15338100	Трансфекции реагента
FBS	АТЛАНТА биологические	S11550	СМИ Клеточные культуры
DMEM	Invitrogen	11965	СМИ Клеточные культуры
Гигромицина	Invitrogen	10687-010	СМИ Клеточные культуры
Бластицидин S	Invitrogen	R210-01	СМИ Клеточные культуры
Пенициллина / стрептомицина	Invitrogen	15140	СМИ Клеточные культуры
HBSS-двухвалентных бесплатно	Mediatech	21022CV	Сотовые стиральные
Трипсин-0,25%	Mediatech	25053CI	Клеточная диссоциация
Тетрациклин-HCl	Сигма	T9823	Индукционная реагентов
Диализу FBS	АТЛАНТА биологические	S12650	Покрытие СМИ
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Флуоресцентный краситель
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Краска загрузки
HBSS	Invitrogen	14175	Буфер для анализа
HEPES	Invitrogen	15630	Буфер для анализа
NaHCO 3	Сигма	S6297	Tl + стимул буфер
MgSO 4	Сигма	M2643	Tl + стимул буфер
CaSO 4 • 2H 2 O	Сигма	C3771	Tl + стимул буфер
D-глюкозы	Сигма	G7528	Tl + стимул буфер
Таллия сульфат	Aldrich	204625	Tl + стимул буфер
HEPES	Сигма	H4034	Tl + стимул буфер
ДМСО	Сигма	D4540	Растворитель
Восьмиканальный электронных дозаторов	Biohit	E300	Сотовые покрытия в 384 -луночных
BD PureCoat амина покрытием 384-луночных планшетов	BD Biosciences	356719	Анализ микропланшетов
Эхо квалифицированы 384-Ну полипропилена планшет (384PP)	Labcyte	P-05525	Микропланшеты соединение источника
384-луночных микропланшетов полипропилена	Greiner Bio-One	781280
Multidrop реагента Combi дозатором	Thermo Scientific	5840300
ELx405 микропланшетов шайбы	BioTek	ELx405HT	Автоматизированная стиральных клетки
Эхо жидкость обработчик	Labcyte	Labcyte Echo 550
Браво автоматизированной обработки жидких платформы	Agilent Technologies	Стандартное исполнение
HamamaТГУ FDSS 6000	Hamamatsu		Кинетическая изображений ридер