PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

Sunandan Saha; Yozo Nakazawa; Leslie E. Huye; Joseph E. Doherty; Daniel L. Galvan; Cliona M. Rooney; Matthew H. Wilson

doi:10.3791/4235

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

16.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4235

⸱

5 ноября 2012 г.

Sunandan Saha¹^,² , Yozo Nakazawa³ , Leslie E. Huye⁴^,⁵ , Joseph E. Doherty²^,⁶ , Daniel L. Galvan² , Cliona M. Rooney⁴^,⁵^,⁷ , Matthew H. Wilson¹^,²^,⁴^,⁸

¹Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , ²Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , ³Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, ⁴Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , ⁵Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , ⁶Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , ⁷Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , ⁸Michael E. DeBakey VA Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод генетической модификации первичных Т-клетки человека с использованием трансгенных невирусных PiggyBac Транспозона системы. Т-клетки модифицирован для использования PiggyBac Транспозона системы выставку стабильной экспрессии трансгенов.

Аннотация

Система транспозона piggyBac активна в естественных условиях и была первоначально выделена из капустной совки^1,2. Эта невирусная система основана на использовании плазмид; чаще всего применяются две плазмиды, одна из которых экспрессирует фермент транспозазу piggyBac , а вторая представляет собой плазмиду-транспозон, содержащую целевой ген (или гены) между элементами инвертированных повторов, которые необходимы для переноса гена. PiggyBac обеспечивает перенос генов по механизму «вырезать и вставить», при котором транспозаза интегрирует сегмент транспозона в геном целевой клетки (или клеток). PiggyBac продемонстрировал эффективную доставку генов в широкий спектр клеток насекомых^1,2, млекопитающих^3-5 и человека6, включая первичные Т-клетки человека^7,8. Недавно была создана гиперактивная транспозаза piggyBac , что позволило повысить эффективность переноса генов^9,10.

Т-лимфоциты человека представляют клинический интерес для адаптивной иммунотерапии рака¹¹. Примечательно, что было одобрено первое клиническое исследование, включающее модификацию Т-клеток человека с помощью транспозонной системы Sleeping beauty¹². Ранее мы оценивали применимость piggyBac как невирусного метода генетической модификации Т-клеток человека. Мы обнаружили, что piggyBac эффективно модифицирует Т-клетки человека с использованием репортерного гена и неиммуногенного индуцибельного гена-самоубийцы⁷. Анализ сайтов геномной интеграции показал отсутствие предпочтения интеграции в известные протоонкогены или рядом с ними¹³. Мы использовали piggyBac для генетической модификации цитотоксических Т-лимфоцитов с целью экспрессии химерного антигенного рецептора, направленного против опухолевого антигена HER2, и обнаружили, что генетически модифицированные Т-клетки обеспечивали направленное уничтожение HER2-положительных опухолевых клеток in vitro и in vivo на ортотопической мышиной модели¹⁴. Мы также использовали piggyBac для создания Т-клеток человека, устойчивых к рапамицину, что должно быть полезно при терапии рака, в которой применяется рапамицин¹⁵.

В данной работе мы описываем метод использования piggyBac для генетической модификации первичных Т-клеток человека. Метод включает выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК) из крови человека с последующим культивированием, генетической модификацией и активацией Т-клеток. Для целей данного отчета Т-клетки были модифицированы репортерным геном (eGFP) для анализа и количественного определения экспрессии гена с помощью проточной цитометрии.

PiggyBac может быть использован для модификации Т-клеток человека различными интересующими генами. Хотя мы использовали piggyBac для перенаправления Т-клеток на опухолевые антигены¹⁴, мы также применяли piggyBac для введения индуцибельного «выключателя безопасности» с целью элиминации генно-модифицированных клеток при необходимости⁷. Большая емкость переносимого генетического материала piggyBac также позволила осуществить перенос гена крупной рапамицин-резистентной молекулы mTOR (15 kb)¹⁵. Таким образом, мы представляем невирусную методику стабильной генной модификации первичных Т-клеток человека для широкого спектра целей.

Протокол

День 0

1. Выделение МКПК из крови человека

Соберите 20 мл свежей человеческой крови с помощью венепункции в Na-гепарин труб Vacutainer.
Mix крови и Advanced RPMI 1640 в 1:1 (объем / объем) отношение.
Добавить 20 мл Lymphoprep средних и 50 мл центрифужные пробирки (25 ° C). Медленно слоем 25-30 мл крови RPMI 1640 смеси в верхней части Lymphoprep.
Центрифуга при 400 мкг в течение 40 минут без тормозов.
Соберите как различны и нечеткой слои с помощью одноразовой пипетки на 10 мл 1x PBS (25 ° C) и довести объем до 50 мл 1x PBS.
Центрифуга при 450 х г в течение 10 мин.
Аспирируйте супернатант полностью и добавить 20 мл Расширенный RPMI 1640.
Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
Аспирируйте супернатант. Добавить 10 мл полной среды T клетки с добавлением 5 нг / мл rhIL-15 предварительно нагретой при 37 ° C.
Подсчитайте количество клеток и пластины в 24 и пальто культуре тканиред пластину на 2 х 10 ⁶ клеток / лунку в полной T СМИ ячейки с добавлением 5 нг / мл rhIL-15 Добавить стерильной водой для окружающих скважин. Выдержите в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO _2.

День 1

2. Покрытие пластин с анти-CD28 и анти-CD3 антитела для стимулирования Т-клеток

Развести анти-CD28 и анти-CD3 антитела в стерильной воде в концентрации 1 мкг / мл каждая.
Добавить 500 мкл раствора каждого антитела к 5 отмеченные лунки не покрытых тканевой культуре 24-луночный планшет.
Добавить стерильную воду, чтобы отдохнуть скважин. Оберните пластину в термоусадочную пленку и положите в холодильник на 4 ° C.

3. Nucleofection стимулированных Т-клеток

Prewarm Т-клеточной среде при 37 ° C и дополнения с 5 нг / мл rhIL-15. Подготовить всю nucleofector решение, добавив 500 мкл Nucleofector Дополнение 1 к 2,25 мл Nucleofector решение.
liquot 5 мкг каждого из транспозонов (Zeo-PT-CMV-EGFP) и транспозазы (pCMV-PiggyBac) в 1,5 мл трубки микроцентрифуге. Примечание: это может быть необходимо для оптимизации транспозазы и транспозонов количество ДНК для оптимальной доставки генов и свести к минимуму клеточной токсичности. Плазмиды могут быть получены из авторов запроса.
Урожай МПК от 24 луночный планшет для культивирования тканей в 50 мл трубки. Подсчитайте количество клеток. Сохранить 2 х 10 ⁶ клеток для использования в качестве контроля при проточной цитометрии.
Добавить 7-10 х 10 ⁶ клеток на 15 мл и трубки центрифуги при 400 мкг, 5 мин, супернатант и пальцем движением гранул.
Добавить 100 мкл Т-клеток полное решение для nucleofection ослабил осадок клеток.
Добавить растворе смеси клеток в пробирке, содержащей плазмиды.
Добавить решение клеток-плазмиды смесь на дно nucleofection кювет. Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырей.
Nucleofect клеток с использованием программ U-014 (Нестимулированные Т-клеток, человека, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
Сразу добавить 500 мкл предварительно нагретого сред с rhIL-15 в кювете. Передача клетки лунку 24-луночный планшет с 1,5 мл предварительно нагретого сред с rhIL15.
Выдержите в течение ночи в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO _2.

День 2

4. Неспецифическая стимуляция Т-клеток

Урожай клеток и определения количества клеток. Отложите 0,5 х 10 ⁶ клеток для проточной цитометрии для определения частоты GFP-положительных клеток. Использование не-трансфицированных МПК в качестве контроля.
Аспирируйте CD3/28 раствор антител из культуры ткани, не покрытой пластины и промыть каждую лунку с Т СМИ ячейки.
Ресуспендируют nucleofected клетки на уровне 0,5 х 10 ⁶ клеток на мл в полной CTL СМИс добавлением 5 нг / мл rhIL-15. Добавить 2,0 мл каждого из nucleofected клеток в 4 скважинах без планшета для культуры ткани. Добавить 0,5 х 10 ⁶ клеток, не nucleofected на ^5-е хорошо.
Выдержите в течение 3 дней в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO _2.

День 5

Урожай вынужденного Т-клеток от не-покрытием планшета для культуры ткани.
Граф и replate клеток в 24 хорошо покрытием планшета для культуры ткани на уровне 0,7 х 10 ⁶ клеток / мл в средствах массовой информации Т-клеток с 5 нг / мл IL-15.

День 7

7. Анализ экспрессии генов

Урожай клеток и пятна с анти-CD8 антител человека (может также использовать анти-CD3 и анти-CD4) и проанализировать с помощью проточной цитометрии для выражения GFP%.

День 8 (необязательно)

8. Расширение Т-клеток

На 8 день после трансфекции, Т-клетки могут быть replated в T-Клеточной среде с IL-15 при плотности 0,7 х 10 ⁶ клеток на лунку для дальнейшего расширения ^16.