Мы описываем новый метод выделения геномной ДНК из цельной крови, собранной для плазменных / серологический. После сбора плазмы крови уплотненного обычно выбрасывают. Наш новый метод представляет собой значительное улучшение по сравнению с существующими методами и делает ДНК и плазменными из одной коллекции, не требуя дополнительного крови.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Практические и новый метод для извлечения геномной ДНК из крови Комплекты Коллекция по сохранению белков плазмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лабораторные исследования могут проводиться с использованием клеточных или жидких компонентов крови. Выбор пробирок для забора крови определяет, какая часть крови будет подвергнута анализу (цельная кровь, плазма или сыворотка). Лаборатории, занимающиеся изучением генетических основ заболеваний человека, используют антикоагулированную цельную кровь, собранную в вакутайнеры с ЭДТА, в качестве источника ДНК для генетического и геномного анализа. Поскольку большинство клинических лабораторий на первом этапе исследования фенотипических проявлений проводят биохимические, серологические и вирусные тесты, антикоагулированная кровь также собирается в пробирки с гепарином (пробирки для плазмы). Таким образом, когда для одновременного и параллельного анализа геномных и протеомных данных требуются и ДНК, и плазма, принято собирать кровь в пробирки с ЭДТА и гепарином. Если бы кровь можно было собрать в одну пробирку, которая служила бы источником и плазмы, и ДНК, такой метод считался бы усовершенствованием существующих методик. Использование осадка крови после экстракции плазмы представляет собой альтернативный источник геномной ДНК, что позволяет минимизировать объем обрабатываемых образцов крови и сократить их количество, требуемое от каждого пациента. В конечном итоге это позволит сэкономить время и ресурсы.
Система для сбора крови BD P100 для сохранения белков плазмы была разработана как усовершенствованный метод по сравнению с предыдущими пробирками для сбора плазмы или сыворотки1, чтобы стабилизировать содержание белков в крови, обеспечивая более эффективный поиск белковых биомаркеров и проведение протеомных исследований крови человека. Пробирки BD P100 содержат 15,8 ml распылительно высушенного K2EDTA и лиофилизированный запатентованный коктейль из ингибиторов протеаз широкого спектра действия для предотвращения коагуляции и стабилизации белков плазмы. Они также оснащены механическим сепаратором, который создает физический барьер между плазмой и клеточным осадком после центрифугирования. Было разработано лишь несколько методов экстракции ДНК из образцов свернувшейся крови, собранных в старых пробирках для плазмы2-4. Проблемы при использовании этих методов были в основном связаны с типом сепаратора внутри пробирок (гель-сепаратора) и включали трудности с извлечением свернувшейся крови, неудобства при фрагментации или диспергировании сгустка, а также препятствование экстракции сгустка разделительным гелем.
Мы представляем первый метод экстракции и очистки геномной ДНК из крови, взятой в новые пробирки BD P100. Мы сравниваем качество образцов ДНК из пробирок P100 с образцами из пробирок с ЭДТА. Наш подход прост и эффективен. Он включает четыре основных этапа: 1) использование пробирки для плазмы BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) с механическим сепаратором для забора крови, 2) удаление механического сепаратора с помощью комбинации сахарозы и стерильного металлического крючка из скрепки, 3) отделение слоя лейкоцитарного слоя (buffy coat), содержащего белые кровяные тельца, и 4) выделение геномной ДНК из лейкоцитарного слоя с использованием стандартного коммерческого набора для экстракции ДНК или аналогичного стандартного протокола.
Протокол
1. Сбора проб
- Соберите образцы крови у лиц с надлежащей информированного согласия. Для каждого человека, привлечь от 4 до 5 мл крови в трубке P100 (BD Diagnostics, Франклин озеро, Нью-Йорк, США). Для целей сравнения одновременно собирать крови в пробирку ЭДТА.
- BD P100 трубы содержат 15,8 мл высушенного распылением K2EDTA и лиофилизированных собственной широкий спектр коктейлем ингибиторов протеаз для предотвращения коагуляции и стабилизации белков плазмы. Они также содержат механические сепаратора. После сбора цельной крови, держать обе трубки при комнатной температуре в течение 60 минут на ночь, пока обработка не выполняется.
- Центрифуга BD P100 пробирки при 2500 г в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Передача плазмы, собранной выше механический сепаратор на микро пробирки.
- Храните P100 трубы, содержащие кровь уплотняется ниже сепаратора, при -80 ° С, пока вы не будете готовы начать ДНК добraction.
2,1 из крови P100 трубку (P100_DNA)
- P100 трубы хранили при -80 ° C после экстракции плазмы. В течение 3 до 4 месяцев, извлекать P100 пробирку, содержащую уплотненный крови из морозильной камеры и оттаивания при 37 ° на водяной бане в течение 5 мин (рис. 1А). Удаления остаточной плазмой, которая сидит над сепаратором. Добавить 2 мл 17% раствора сахарозы (градиент решения испытано в доме - неопубликованные данные) в P100 трубы над сепаратором (рис. 1В). Центрифуга труб при комнатной температуре в течение 20 мин при 2500 г; этот процесс толкает механического сепаратора в верхней части трубки и дает три слоя раствора, включающего лейкомассы (рис. 1в). Вручную извлечь сепаратор использованием steriled крючковатым скрепки металла (рис. 1D).
- После получения механический сепаратор из каждой пробирки (рис. 1D), удалять и discarг верхний слой сахарозы. Передача средний слой, представляющий лейкомассы (BC) слой, в стерильные 15 мл коническую трубку. Добавить фосфатом солевой буфер (PBS), чтобы увеличить громкость лейкомассы до 3 мл. Извлечение ДНК из лейкоцитарной пленки с использованием реагентов из крови Kit Qiagen Puregene в соответствии с рекомендацией изготовителя; кроме центрифугирования скоростью 2500 г (вместо 2000 г).
- Для лизиса и удалить красных кровяных телец (эритроцитов), добавить 9 мл лизис РБК к 3 мл лейкоцитарной пленки. Инверсия каждой трубки несколько раз, и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин с периодическим обращением во время инкубации. Спин каждой смеси вниз на 2500 г в течение 5 мин и отбросить супернатант. Лечение оставшихся гранул в каждую пробирку с 3 мл клеточной лизирующего раствора и вихрь на 15 сек. Лечить лизата с 1 мл раствора белка и вихревые осадков на 15 сек.
- Центрифуга при 2500 г в течение 5 мин и надосадочную жидкость передавать в свежем 15 мл коническую пробирку, содержащую3 мл 100% изопропанола. Инверсия новой трубы 10 раз и центрифуге при 2500 г в течение 3 мин. Удалите супернатант и добавляют 1 мл 70% этанола. Переверните конические пробирки несколько раз, чтобы выбить и мыть осадок ДНК. Центрифуга при 2500 г в течение 1 мин. Разрешить гранулы сушат в течение 3 мин (поместить трубку вверх дном) при комнатной температуре, а затем приостановить ДНК с 250 мл регидратации раствор при 37 ° С в течение 10 минут и переносят в предварительно меченных 1,7 мл микропробирки. Хранить трубы при -80 ° С до использования.
2,2 из крови ЭДТА Ttube (EDTA_DNA)
- Цельной крови для обычного тестирования иммуногематологии собирают в пластиковые пробирки vaccutainer распыления покрытый 10,8 мг К 2 EDTA и хранили при -80 ° С. Поскольку трубы не содержат механические сепаратора экстракции ДНК не включать в себя этапы, связанные с механическим сепаратором (2.1.1 и 2.1.2).
- В течение 3-х до 4 месяцев хранения крови, DNИзвлекали с помощью KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Это экстракции ДНК автоматизации системы, основанной на технологии магнитной частицей и состоит из лизиса клеток / ДНК-связывающий несколько стадий промывки и элюции ДНК.
- Набор, используемый в экстракции ДНК является KingFisher Flex 24 ДНК крови (Qiagen, Германия).
3. Количество ДНК и оценка качества
Количество, качество и целостность геномной ДНК оценивали комбинацию метода, который включает в себя PicoGreen, спектроскопии и электрофореза.
- Концентрация геномной ДНК определяется Nanodrop и PicoGreen количественной оценки.
- Чистота определяется из 260/280 Измерение коэффициента на Nanodrop спектрофотометра.
- Образец (500 нг) также загружаются на 1% агарозный гель для оценки целостности (деградация) ДНК.
4. Genotypinг анализы и контроль качества
- Пять P100_DNA и соответствующие образцы EDTA_DNA случайно отобраны для дальнейшего анализа с использованием пользовательских иммуночипа (Иммуно Анализ ДНК BeadChip). Иммуночипа это микросхема Infinium генотипирования полиморфизмов содержащий 196524 и предназначен для исследования иммуногенетическими 5.
- Для каждого образца 200 нг ДНК амплифицируют, разобщены, осаждали и ресуспендировали в соответствующем буфере гибридизации.
- Денатурированные образцы гибридизуют на Immunochips при 48 ° C в течение минимум 16 часов.
- После гибридизации Immunochips обрабатываются для одной базы расширения реакций и запятнанным.
- Immunochips затем отображаемого использованием Illumina Hiscan бисера читатель решетки и нормированного шарик данные интенсивность загружается в программное обеспечение Illumina GenomeStudio и преобразуется в генотипами. Генотипы вызываются с помощью алгоритма autocalling GenomeStudio. Контроля качества вvolves исключение одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) с призывом скорости <95%.
- Скорость SNP вызова используется как мера эффективности анализа иммуночипа. Он рассчитывается как процент от общего количества анализов на чипе (196524 SNP, закодированных на каждом чипе), которые обеспечивают достижение достаточной интенсивности и качества сигнала для получения автоматизированной назначение генотипа. Высокое качество ДНК (260/280 Отношение 1,8 или выше, и отсутствие деградации) как ожидается, достигнет по крайней мере, с той же скоростью звонок, так как ДНК HapMap управления включены в анализ иммуночипа. Контроль качества включает в себя исключение ОНП с призывом скорости <95% в каждом наборе данных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ДНК оценки качества и измерение концентрации
Выходы P100_DNAs были значительно ниже, чем у EDTA_DNAs (табл. 1 и 2). ДНК чистота лице 260/280 Значение коэффициента одинакова для обоих P100_DNA и EDTA_DNA выборочной совокупности (табл. 1 и 2). Качество ДНК достаточно равномерным в пределах каждого набора образцов хотя некоторое ухудшение видно в образцах EDTA_DNA, как указано световых пятен (рис. 2). EDTA_DNAs ко...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Многие человеческие болезни имеют генетические причины и изучения генетической основы заболевания человека требует увеличения высокое качество ДНК. Наиболее распространенным источником ДНК используется в генетических исследованиях антикоагулированной цельной крови. Поскольку большинство клинических лабораторий выполняют биохимические, серологические и вирусных тестирования в качестве первого шага в расследовании фенотипических результат, кровь часто собираются в плазме трубки. После сбора плазмы крови уплотненного часто...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пробирки BD P100 | BD Diagnostics | 366448 | |
| Пробирки с ЭДТА | BD Diagnostics | 367863 | |
| Сахароза | Sigma | S9378 | |
| Канцелярская скрепка | Office product | ||
| Пробирка 15 ml | Corning | 430052 | |
| Эритроциты (RBC) | Qiagen | 158389 (набор) | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| Набор BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| Микропробирки 1,7 ml | Axygen | MCT-175-C | |
| Набор Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Считыватель BeadArray | Illumina | NA | |
| Программное обеспечение GenomeStudio | Illumina | N/A |
Ссылки
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101(2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
