Методическая статья

Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

DOI:

10.3791/4282

⸱

23 апреля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем анализ электрохимических датчиков метод для быстрого бактериального обнаружения и идентификации. Анализ включает в себя датчик массива функционализированы олигонуклеотида захвата зондов для рибосомной РНК (рРНК) видоспецифической последовательностей. Сэндвич-гибридизации целевых рРНК с зондом захвата и пероксидазой хрена олигонуклеотида, детектор зонд производит измеримые амперометрического тока.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрохимические датчики широко используются для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в крови и может быть адаптирована для обнаружения широкого спектра анализируемых веществ. Электрохимические датчики работают по трансдукции биологических распознавание событий в полезный электрический сигнал. Передача сигнала происходит путем соединения активность окислительно-восстановительных ферментов для амперометрического электрода. Датчик специфичность либо неотъемлемой характеристикой ферментов глюкозооксидазы в случае сенсор глюкозы, или продукт связь между ферментом и антитела или зонда.

Здесь мы описываем анализа электрохимического датчика метод непосредственного обнаружения и идентификации бактерий. В любом случае, зонды, описанные здесь, представляют собой ДНК-олигонуклеотидов. Этот метод основан на гибридизации сэндвич захвата и датчики пламени с целевыми рибосомной РНК (рРНК). Захват зонда прикреплен к поверхности датчика, а детектор зонд связан с чorseradish пероксидазы (HRP). Когда субстрат, такой как 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) в электроде с захватом-мишень-детектор комплексы, связанные с его поверхности, субстрат окисляется пероксидазой хрена, и уменьшается на рабочем электроде. Этот результат окислительно-восстановительного цикла в челночные электронов на подложке из электрода для HRP, производя тока в электроде.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование рРНК в качестве молекулы-мишени для бактериальной обнаружения и идентификации имеет ряд преимуществ. Обилие рРНК в бактериальных клетках предусматривает предел чувствительности по цене от 250 бактерий на миллилитр без необходимости целевого усиления 1. Бактериальные рРНК содержит уникальный видоспецифических последовательностей, которые являются доступными для гибридизации с ДНК-зондами. Следовательно, множество электрохимических датчиков может быть использована для идентификации неизвестных бактерии, где каждый датчик функционализированных различных видов конкретного захвата зонда. Положительный контроль датчики должны быть включены в синтетический олигонуклеотид, который мишень "мостов" захват и детектор зондов создать внутренний сигнал калибровки.

Электрохимические датчики имеют широкий спектр основных и поступательного исследовательских задач. Например, анализ, описанный здесь был использован, чтобы точно измерить эффект E. кишечной фазе роста на RRNИ пре-рРНК числом копий, что представляет большой интерес для исследователей, заинтересованных в бактериальной физиологии 2. Чувствительность анализа электрохимического датчика определяется отношение сигнал-шум. Разнообразие усиления сигнала и методы шумоподавления были изучены. Мы считаем, что улучшение химии поверхности датчика является ключом к сокращению неспецифическое связывание зонда детектора и / или HRP фермента. В частности, смешанного монослоя alkanedithiols и mercaptohexanol было установлено, уменьшить фон путем покрытия поверхности электрода более полно, сохраняя при этом доступность захватывающего зонда для гибридизации мишень 3. Эти процедуры химии поверхности особенно важны для анализа с участием сложных биологических образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Функционализация электрохимическими сенсорами

  1. Подготовьте тиолированным зонд захвата в концентрации 0,05 мкМ 300 мкМ 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М NaCl, 1 мМ ЭДТА и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин . Инкубация тиолированным зонд захвата с HDT гарантирует, что тиольной группой захватывающего зонда уменьшается, что приводит к более надежные результаты.
  2. Применение в токе азота до чистого золота 16 матрицы датчика чип (ы) в течение 5 секунд для удаления влаги и / или твердых частиц.
  3. Применение 6 мкл HDT-тиолированным смесь зонд захвата к рабочему электроду всех 16 датчиков матричного датчика и хранить сенсорный чип (ы) в закрытом чашке Петри при температуре 4 ° С в течение ночи. Тиолированными зондов захвата связываются непосредственно с голым электродом золота и HDT действует, предотвращая переуплотнения захвата зондов и держать их в вытянутой конформации, что способствует гибридизации с мишенью.
  4. следующий день, мыть микросхемы датчика деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
  5. Применение 6 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 6-меркапто-1-гексанола (MCH) к рабочему электроду всех 16 датчиков и инкубируют в течение 50 мин. Этот и все последующие инкубации чипа датчика выполняется в закрытой чашке Петри при комнатной температуре. MCH действует в качестве блокирующего агента, заполнение пробелов, где тиолированным зонд захвата или HDT не присутствует на поверхности электрода.

2. Подготовка образцов

  1. Передача 1 мл бактериальной культуры в логарифмической фазе роста (OD 600 ≈ 0.1) к трубке микроцентрифужных и центрифуге при 16000 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант культуры. Бактериальный осадок может быть обработан немедленно, либо хранили при -80 ° С для последующего использования.
  2. Тщательно ресуспендируют бактериальный осадок в 10 мкл 1 М NaOH с применением пипетки к ботовТом трубки микроцентрифужные и пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируют в суспензии при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Нейтрализовать бактериальный лизат добавлением 50 мкл 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащем 2,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,25 мМ флуоресцеином модифицированный детектор зонда. Инкубируют нейтрализованного лизат в течение 10 мин при комнатной температуре. Флуоресцеина модифицированных зондов детектор гибридизации с бактериальными целевых молекул рРНК.

3. Электрохимический сенсор анализа

  1. Промыть MCH от датчика чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
  2. Применение 4 мкл нейтрализованного бактериального лизата к рабочему электроду каждого из датчиков 14 и инкубировать в течение 15 мин. Target-детектор комплексов зонда гибридизации с иммобилизованными зондами тиолированными захвата.
  3. Применение 4 мкл 1 нМ преодоление олигонуклеотидов в 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащем 2,5% БСА и 0,25 &му; М флуоресцеина модифицированный детектор зонд 2 положительный контроль датчики (используется для нормализации сигнала) и инкубируют в течение 15 мин.
  4. Промыть сенсорный чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
  5. Применение 4 мкл 0,5 Е / мл анти-флуоресцеин-HRP в 1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащим 0,5% казеина к рабочему электроду всех 16 датчиков и инкубируют в течение 15 мин. Анти-флуоресцеин-HRP связывается с иммобилизованными флуоресцеина модифицированных зондов детектора.
  6. Промыть сенсорный чип деионизированной H 2 O в течение 2-3 сек и сушат под потоком азота в течение 5 секунд.
  7. Нанесите слой также наклейку на поверхности чипа датчика и нагрузки в держателе датчика чипа. 50 мкл субстрата ТМВ на все 16 датчиков и закрыть держателе датчика чипа.
  8. Получить амперометрии и измерения циклической вольтамперометрии для всех 16 датчиков, использующих Helios Chip Reader. Амперометрические тока пропорциональна скорости TMB ГОбразование на поверхности датчика (см. рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опишем электрохимический анализ, который имеет конструкцию, подобную сэндвич-ELISA. Как показано на рисунке 1, задача рибосомальной РНК (рРНК) гибридизации с захватом и детектор зондов разработан окислительно-восстановительной реакции, катализируемой конъюгированное с HRP антифлуоресцентного фрагменты антител, которые связываются с 3 'связь флуоресцеин на детекторе зонда. Важной составляющей анализа чувствительности химии поверхности золотого электрода. Мы обнаружили, что тройной монослой, состоящий из ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ электрохимический сенсор описанный здесь позволяет быстрое обнаружение нуклеиновых кислот-мишеней. Чувствительность и специфичность зависеть частично от свободной энергии мишень-гибридизации с зондом, который, в свою очередь, зависит от длины и GC содержание захвата и детектор зондов. Мы обычно выполняют гибридизации шагов при комнатной температуре (~ 20 ° C) 5, 6. Однако гибридизации шагов (3.2 и 3.3) также может быть выполнена при более высоких температурах в печи гибридизации если чип помещают в зак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы являются изобретателями на патенты, имеющие отношение к методам, описанным. Один из этих патентов была лицензирована для Qvella Corporation. BMC и ДАХ имеют доли участия в Qvella Corporation. В.Г. является президентом GeneFluidics, которая является производителем массива чипов электрохимический датчик, чип гору, и чип читателя описанные в этой статье.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Совместная премия AI075565 Соглашения (в ПРЗ) из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и Венди и Кен Рубин фонда за высокое качество исследований в области педиатрии в урологии. BMC является Джудит и Роберт Уинстон кафедра детской урологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-меркапто-1-гексанол (MCH)Sigma451088Хранить при комнатной температуре
1,6-гексанедитиол (HDT)SigmaH-12005Хранить при комнатной температуре
Тиолированные зондызахвата OperonN/AХранить при 100 мкм; M в 0,1x TE при -20 °°; C
Модифицированные флуоресцеином детекторные зондыOperonN/AStore at 100 μ M в 0,1x TE при -20 °°; C
Bridging OligonucleotideOperonN/Aхранить при 100 мкм; M в 0,1x TE при -20 °°; C
Anti-fluorescein-HRP, Fab fragmentsRoche11 426 346 910Store at 4 ° C
Helios Chip ReaderGeneFluidicsGFR-2009
Крепление для сенсорного чипаGeneFluidicsGFR-003
Наклейка на пленочный колодецGeneFluidicsПоставляется с сенсорными чипами
Голое золото 16-сенсорные чипы GeneFluidicsSC1000-16X-BХранение в 100% N2 при комнатной температуре
Бычья сыворотка Альбумин SigmaA7906Store at 4 ° C
1M Фосфатный буфер, pH 7,2 0,35M2PO4, 0,65M K2HPO4, скорректированный до pH 7,2
Блокатор казеина в PBS Pierce37528Разбавленный равным объемом 1М фосфатного буфера, pH 7,2, хранить при температуре 4 °°; C
Таблица 1. Реагенты и оборудование.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи