Методическая статья

Целевые маркировки нейронов в конкретных функциональных микро-области коры головного мозга путем объединения Внутренняя сигнала и Двухфотонные изображений

DOI:

10.3791/50025

⸱

12 декабря 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан способ маркировки нейронов с флуоресцентными красителями в заданных функциональных микро-областей коры головного мозга. Во-первых, внутренний сигнал оптических изображений используется для получения функциональной карте. Тогда двухфотонной микроскопии используется для обозначения и изображения нейронов в микро-область на карте.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В первичной зрительной коры не-грызунов млекопитающие, нейроны группируются в соответствии с их предпочтениями стимулом для функций, таких как ориентация 1-4, 5-7 направления, глазного доминирования 8,9 и бинокулярное несоответствие 9. Ориентация селективности является наиболее широко изучаются функции и непрерывное отображение с квази-периодические макет для преимущественной ориентации присутствует по всей первичной зрительной коры 10,11. Интеграция синаптических, сотовой сети и взносы, которые приводят к стимулы избирательный ответы на эти функциональные карты требуется гибридизации методов визуализации, которые охватывают суб-микрона до миллиметра пространственных масштабах. С обычной внутренней сигнала оптических изображений, общая компоновка функциональных карт по всей поверхности зрительной коры может быть определено 12. Развитие в естественных условиях двухфотонной микроскопии с использованием кальция чувствительных красителей позволяет определить synaptIC входе прибывающих в отдельных дендритных шипов 13 или записи активности одновременно из сотен отдельных тела нейронов 6,14. Следовательно, сочетание внутренней визуализации сигнала с субмикронной пространственное разрешение двухфотонных микроскопия дает возможность определить, какие именно дендритные клетки сегменты и вклад в микро-домен любой функциональной карты в коре головного мозга. Здесь мы показываем, высокодоходный метод для быстрого получения корковых ориентации карты и ориентации конкретных микро-домен в этой функциональной карты для маркировки нейронов с флуоресцентными красителями в не-грызун млекопитающее. С той же микроскоп используется для двух-фотонного изображений, мы сначала создать ориентации карты с помощью внутренней сигнала оптического изображения. Затем мы покажем, как настроить таргетинг на микро-области интереса помощью микропипетки загружается с красителем либо этикетку населения тела нейронов или этикетку одного нейрона, что дендриты и аксоны шипы видны вестественных условиях. Наши уточнений по сравнению с предыдущими методами облегчения рассмотрения нейронов структурно-функциональных отношений с субклеточном резолюции в рамках коры головного мозга функциональной архитектуры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Хирургическая подготовка

  1. Анестезии и постоянно контролировать частоту сердечных сокращений, в конечном приливной CO 2, ЭЭГ, и температура. Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Медицинского университета Южной Каролины и были основаны на тех, кого мы ранее опубликованные 9,15.
  2. Expose спинной поверхности черепа, разрезав кожу лезвие скальпеля. Проанализируйте соединительной ткани, прилежащие кости с помощью кюретки Brudon. Очистите кости с помощью хлопка наконечником аппликаторы и хлопка марли. Применение костного воска (при необходимости) к черепу, чтобы остановить кровотечение через случайные мелкие вены эмиссара.
  3. Прикрепить титана или нержавеющей стали голове черепа (по области интересов, где краниотомии будет осуществляться) с помощью стоматологического цемента смешивается с черной краской (см. материалы). Прямоугольное отверстие в центре головы пластина обеспечивает доступ к трепанации черепа и оптических изображений. Прикрепите металлическую камеру на верхнюю часть головы пластину. Эта камера будет служить резервуаром для жидкости изображения с объективом погружением в воду.
  4. Закрепите голову пластину этапе ху использованием металлических штифтов.
  5. Тонкие большой площади кость в прямоугольное отверстие в headplate с помощью бормашины. Области, чтобы разбавлять должны распространяться далеко за пределы запланированного трепанации черепа. Толстый череп не-млекопитающих грызуны должны быть разбавлены, если изображения с высоким разрешением должны быть получены из коры головного мозга, потому что на месте трепанации черепа, толщина костей будет определять толщину агарозном между покровного стекла, и поверхность коры головного мозга (см. ниже) .
  6. Просверлите 2 х 2 мм квадратный контур в кости для трепанации черепа. Промойте камеры периодически со свежей искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), чтобы удалить осколки кости и свести к минимуму рассеивание тепла к основной коры головного мозга. Применение костного воска по мере необходимости, чтобы остановить случайным кровотечением.
  7. Lifт костный лоскут с № 3 щипцов.
  8. Удалите все, кроме нижнего слоя оболочки с помощью тонкого пинцета (# 5CO) и ножницы Vannas весной. Оболочки, не связанных с грызунами млекопитающих толстым и непрозрачным, но может быть удален в разных слоях. Кровотечение бывает редко, но может быть остановлен с Gelfoam и любые остатки крови должны быть аккуратно удалены от остальных слой твердой мозговой оболочки с помощью пинцета и полоскания с ACSF. Последний слой твердой мозговой оболочки является прозрачной и мягкой мозговой оболочки сосудов должны быть ясно видны через него. Оставляя этот последний слой твердой мозговой оболочки неповрежденными во время внутренней визуализации сигнала будет увеличиваться вероятность успеха массовой загрузки флуоресцентных индикаторов кальция для последующего двухфотонного изображения этапе эксперимента (см. Обсуждение).
  9. Нанесите каплю теплого 2% агарозном (растворенного в ACSF) и сразу же разместить покровного стекла по трепанации черепа. Проверьте трепанацию черепа, чтобы дыхательной и сердечно-сосудистой пульсации являются минимальными с помощью хирургического рассечения микроскопа или окуляры двух-фотонного микроскопа в светлое поле режиме.

2. Внутренняя сигнала оптических изображений

  1. Добавить Гель-пена пропитанной ACSF вокруг внешней стороны покровного стекла, чтобы предотвратить агарозном от высыхания во внутренней визуализации сигнала.
  2. Прикрепите внутренний сигнал изображения CCD камеры к стандартному C-креплением порт на верхней из двух-фотонного микроскопа (рис. 1). Поместите освещающего источника света на воздух таблице возле сцены ху (рис. 1А). Положение и обеспечить световодов по трепанации черепа и headplate / камеры (рис. 1б). Уберите первичной дихроичным зеркалом и ниже C-креплением порт так, чтобы отраженный красный свет необходимых для внутреннего сигналы будут проходить непосредственно от трепанации черепа с ПЗС-камерой (рис. 1С-D). Использование 4x цель воздухе (0,13 NA, 17 мм WD), 2 х 2 мм поле зрения доступно для внутренней визуализации сигнала.
  3. Вставьте тепла фильтра в лРАВО путь, чтобы предотвратить коры от отопления. Используйте фильтр, который проходит зеленым светом (546 нм центр λ) и записывать цифровое изображение ссылкой корковых сосудов поверхности.
  4. Переместить фокус г до 500 мкм ниже поверхности коры. Используйте красный фильтр (630 нм центр λ), чтобы осветить коры для измерения внутренних сигналов. Установите световодов таким образом, что поверхности коры равномерно освещен. Щит трепанация черепа от света производится путем визуального отображения стимул. Представить последовательность зрительных стимулов и запись изображений отражения данных. Для создания ориентации карты в течение 10 мин, собирать данные, соответствующие 4 повторения последовательности из 8 раздражители (4 ориентаций и двух направлениях для каждой ориентации).
  5. Анализ внутренних данных сигнала для генерации ложных ориентации карты цвета. Выбор потенциальных целевых регионах в течение двух-фотонного маркировки нейронов, например, ориентация вертушки особенности - точки на карте, гдеВсе предпочтительной ориентации сходятся (рис. 2A). Перекрытие ориентации карты и изображения корковых сосудистой поверхности (рис. 2В-C). Используйте расположение функциональных областей и расположения крупных надводных кораблей для выбора цели, избегая мест с крупными кровеносными сосудами и артериол 15.

3. Массовая загрузка флуоресцентных индикаторов кальция

  1. Приготовить раствор из 20% Pluronic / DMSO, добавляя 1 г Pluronic в 5 мкл ДМСО. Смесь нагревают при 60 ° С в течение 10 мин до полного растворения Pluronic. Дайте смеси остыть до комнатной температуры. Добавить 4 мкл Pluronic / ДМСО смесь до 50 мкг флакон флуоресцентного индикатора кальция Орегон Зеленый 488 ВАРТА-1 AM (OGB-1 AM). Затем добавить 1 мкл красного красителя (Alexa Fluor 594, 2 мМ маточного раствора) и 35 мкл раствора пипеткой (см. материалы) для конечной концентрации 1 мМ OGB-1 утра. Разрушать ультразвуком решение для ½ часа вохлажденной водяной бане, а затем центрифуги с 0,45 мкм фильтр для удаления примесей.
  2. Потяните длинный конус пипетки с наружным диаметром кончика 2.0-2.5 мкм. Загрузите 5 мкл красителя смесь в пипетку.
  3. Удалить последний слой твердой мозговой оболочки для облегчения введения пипетки и получить высокое качество двухфотонного изображений.
  4. Определите точное место на поверхности коры, что пипетки должны быть помещены для того, чтобы достичь своей цели в корковом слое 2/3. Наши заданной корковых цель вертушки особенность в ориентации карты (рис. 2). Пипетки должны быть загнаны в коре на 30 градусов, чтобы пройти между стенкой камеры и объектива. Таким образом, для обозначения целевой области 200 мкм ниже поверхности коры, положение пипетки въезд на поверхности коры составит примерно 350 мкм боковой на целевую позицию (рис. 3 AB).
  5. Переместить этапе ху (на которой животное и рipette микроманипулятора помещаются) в центре коры позиции ввода поверхности под цели (рис. 3). Используйте 20x или 40x объективом с рабочим расстоянием (WD) не менее 3 мм (см. материалы) для того, чтобы пипетка будет легко войти в коре, не касаясь цели или кости вдоль стенки черепа. После вступления позицию по центру под цели, повысить Z положение цели на 2 мм (рис. 3D). С помощью зеленой флуоресценции свет включен, чтобы визуализировать красный Alexa красителя в пипетку, использовать диагональные оси микроманипулятора для перемещения пипетки, пока его кончик центру (и сосредоточился) под цели прямо над корковой позиции ввода поверхности ( Рисунок 3E).
  6. Опустите пипетку вертикально (вдоль оси), пока пипетку достигает поверхности коры (рис. 3F), в то время непрерывного просмотра пипетки через OCUЛарс микроскопа. Использование ярких поле освещения, поверхности коры кровеносных сосудов и остальные менингеальных оболочек (мягкой и паутинной) хорошо видны как пипетка подходит к поверхности коры. Если пипетка не достигают желаемой позиции ввода, повышение пипетки и калибровку таргетинг на основе сосудистые ориентиры на поверхности коры.
  7. Удалить цель, фитиль избыток спинномозговой жидкости из трепанация черепа и высушить соседние кости с помощью безворсовой копья поглощения. Нанесите каплю теплого 3% агарозы (растворяется в ACSF) для стабилизации коры, которая видна через трепанацию черепа (рис. 3G). В не-грызунов, 3% агарозном необходимо смочить пульсаций для успешного поглощения флуоресцентных красителей нейронами. Для внутренних сигналов оптических изображений только 2% агарозном необходимо, потому что сочетание 2% агарозном и покровного стекла обеспечивает необходимую стабильность. Здесь нет покровного стекла используется для красителя загрузки шаг, чтобы 3% агарозунеобходимо. После агарозном укрепил, вставить 40x объектив (0,8 Н.А., 3,3 мм WD) и повторно заполнить камеру с ACSF.
  8. Переход от светлого поля до двух фотонов просмотра и поиска пипетки. Используя диагональную ось микроманипулятора, переместите пипетку до его кончика достигает нужной глубине в коре головного мозга (рис. 3H). Иногда давление выброса клубы красителя смеси (несколько фунтов на квадратный дюйм, каждый импульс 0,1 сек) поможет предотвратить пипетки от засорения. Потому что OGB-1 я только становится видимым при входе в клетках, красный Alexa краситель имеет решающее значение для визуализации пипетки внутри коры головного мозга.
  9. Прежде чем приступить к загрузке нейронов в корковом слое 2/3 с полной дозы красителя, переориентировать цели на поверхности коры, чтобы подтвердить глубину кончика пипетки и убедитесь, что наконечник в целевом расположении на основе макета надводных кораблей крови. Если пипетка находится в слое 2/3, небольшие клубы красителя смесь должна горетьвнеклеточного пространства и выявить плотной сборки круговой тела клетки, как темные тени.
  10. Для загрузки тела нейронов в области коры 300-600 мкм в диаметре, вводят смесь красителя во внеклеточное пространство, используя 30-90 импульсов, каждый импульс 1,0 сек, 2-10 атм. Импульсы давления, не должно быть настолько сильным, что ткань двигается. После инъекции завершен, подождите несколько минут, затем удалите пипеткой и объективным. Подождите в течение 1 часа, чтобы позволить OGB-1 утра до полностью приняты меры по нейронам.
  11. Снимите агарозном используется для загрузки красителей и промыть записи камеры. Нанесите небольшое падение на 2-3% агарозном на поверхность и быстро разместить покровного стекла по трепанации черепа. Потому что флуоресцентные красители являются светочувствительными, избегать чрезмерной подвергая кору до ярко-поле или эпи-флуоресцентного света. Вставьте высокой NA (1,0) 20x цели в цель владельца и повторно-центра помечены зоны коры головного мозга под цели использования этапе ху. Щит трепанация черепа от бывшихпосторонним источникам света, например, визуального отображения стимула, с использованием нескольких слоев материала затемнение.

4. Single-клетки Electroporation флуоресцентных красителей

  1. Для изучения дендритной морфологии, приготовить раствор из 100 мкМ Alexa Fluor 594 (разведение 1:20 в ACSF 2 мМ Alexa Fluor 594 акций). Для функциональной визуализации дендритов соль OGB может быть использовано 16,17.
  2. Потяните длинный конус пипетки с наконечником размером 1 мкм и загрузить 5 мкл красителя в пипетку. Все остальные шаги таргетинг функциональной области идентичны основной метод загрузки (рис. 1-3). Чтобы разместить пипетки, прилегающих к нейрональной мембраны клеток организма, следить за увеличением импеданса электрода и оказать давление клубы краситель для освещения межклеточное пространство и увидеть клеточных тел, как тени в течение двух-фотонной обработки изображений.
  3. Когда кончик пипетки находится рядом с нейронной мембраны клеток организма, используйте Axoporator 800A применять1-3 импульсов (-8 до -10 В, 10 мс импульс). Непосредственное наполнение нейрона с красителем легко визуализированы с двухфотонной микроскопии. Удалите пипетки и собирать изображения с высоким разрешением дендритов и аксонов в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для иллюстрации точности наших красителей методами маркировки, мы нацелены на наименьшее микро-домен любой известной функциональной карты в не-грызунов коры головного мозга. Редким перемежается всей ориентации карты в первичной коры являются визуальные особенности. Они возникают в точках, где все привилегированные ориентаций сходятся так, что в ложных карт цвет предпочтительной ориентации, регионов вокруг сингулярности выглядят как "флюгеры" (рис. 2A-B). Один за вертушки трепанация черепа выбран для кра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем метод для целевой маркировки тела нейронов (или дендритов и аксонов) в заранее определенных функциональных микро-областей коры головного мозга. Слияние внутреннего сигнала оптического изображения с двух-фотонной микроскопии дает возможность определить, какие синапсы клеток и способствуют микро-домен любого функционального карте, будь нейронов коррелирует с селективностью расположения нейронов в функциональную карту, и нейронные цепи компонентов , которые меняются с визуального восприятия 7 или...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Национального института глаза R01EY017925 и R21EY020985 и финансирование из Dana & Whitehall основы для PK Мы также благодарим Мэтью Петрелья за помощь в хирургических процедурах, Грейс Dion для отслеживания дендритов показано на рисунке 5А и Pratik Chhatbar для замечания по рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название Реагенты / Материал Компания Номер по каталогу Комментарии
1. Жизнеобеспечение / Подготовка эксперимента
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05
Isoflurane испаритель Midmark VIP 3000
Обратная связь регулируемым отоплением одеяло Harvard Apparatus 50-7079F
ЭКГ-монитор Digicare биомедицинских LifeWindow Lite
ЭЭГ усилителя AM системы 1800
ЭЭГ-монитор Hewlett Packard 78304A
Конец приливной CO 2 монитора Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Оптимизация вентиляции
Твердосплавные сверла для сверления заусенцы кости Henry Schein штрафа (0,5 мм наконечник) и грубые (1,25 мм наконечник)
Цемент для headplate / камеры Dentsply 675571, 675572
Черный порошок краска, темпера Сарджент искусства Инк 22-7185 Добавить в цемент для улучшения свете защиты и уменьшения отражений
Агарозы - Тип III- Сигма A9793 Для минимизации пульсаций во внутренний сигнал и двухфотонного изображений
Покровного стекла: 5 или 8 мм, 0,17 мм толщиной Всемирный точности вприборов 502040, 502041 Для минимизации пульсации во время съемки, покровного стекла можно вырезать по мере необходимости
Brudon кюреты Джордж Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Очистка поверхности черепа
Кость воска Ethicon W31G Быстро остановить кровотечение
Хлопок палочки Электрон наук микроскопии 72308-05 Чистый и сухой поверхности кости
Дюмон # 5CO щипцы Средства изобразительных наук 11295-20 Возьмите отдельные слои оболочки или мягкой
Vannas Весна Ножницы Средства изобразительных наук 15000-03 Cut оболочки
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 Для остановки кровотечения на длительность
Поглощение копья Средства изобразительных наук 18105-01 Ultra-быстро и без ворса влагу из CSF
Blackout материала Thorlabs BK5 Щит трепанация черепа
2. Краска подготовки / инъекций
Диметилсульфоксид (DMSO) Сигма D2650
Pluronic Сигма P2443
Орегон Зеленый 488 ВАРТА-1 утра Invitrogen O6807 Кальций индикатор
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Центробежный фильтр (0,45 мкм размер пор) Millipore UFC30HV00 Для удаления примесей перед инъекцией
Стеклянная пипетка съемника Sutter Instruments P97
Боросиликатное стекло filamented капиллярные (1,5 мм наружный диаметр) Инструменты Всемирной Precision 1B150F-4 Краска пипетки выброса
Microloader Eppendorf 5242 956 003 Для загрузки красителя в пипетку
Микроманипулятор Sutter Instruments MP-285 Чтобы разместить пипетки
Контроллер импульса давления Parker Hannifin PicoSpritzer III Для давление впрыска на красителе
Single-клетки электропоратора Molecular Devices Axoporator 800A Для электропорации красителя
3. Внутренняя IMAненности ВИЧ варьируется
Цель 4x (0,13 NA, 17 мм WD) Олимп UPLFLN4X
Внутренняя аппаратного / программного обеспечения Оптических изображений Инк Imager 3001 / VDAQ VDAQ программное обеспечение используется для эпизодических изображений
CCD камеры Adimec Adimec-1000
Свет питания источник KEPCO ATE 15-15M
Источник света Оптических изображений Инк HAL 100 Интенсивность света на поверхности коры составляет 3-5 мВт
Зеленый фильтр (для сосудистых изображение) Оптических изображений Инк λ = 546 нм (полоса пропускания 30 нм) Для справки изображение поверхности сосудистой
Красный фильтр (для собственного сигнала) Оптический Imagiнг Инк λ = 630 нм (полоса пропускания 30 нм) Для сбора внутренние сигналы
Тепло фильтр Оптических изображений Инк KG-1
4. Двухфотонные установки / визуализации
Двухфотонные микроскопа и программное обеспечение Prairie технологий См. Shen и соавт. 2012 по пути света, фильтры и мощность лазера
Ti: Sapphire лазер Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 мм WD) Олимп UMPLFLN20X 0,5 нА цели используется только для выравнивания пипеткой по трепанации черепа (не для двух изображений фотона)
20x (1,0 NA; 2,0 мм WD) Олимп XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 мм WD) Олимп LUMPLFLN40X/IR
Air стол Newport ST-200 Изолирует подготовки от внешних вибраций
ху этапе Майк машины Co (Attleboro, MA) Экспериментальный предмет и Sutter микроманипулятора размещены на сцену ху
Рецепты
Искусственные спинномозговой жидкости NaCl (135 мм), KCl (5,4 мМ), MgCl 2 (1,0 мМ), CaCl 2 (1,8 мм), HEPES (5 мМ), рН 7,4
Внесите Решение 14 NaCl (150 мМ), KCl (2,5 мм), HEPES (10 мМ), рН 7,4

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

Похожие статьи