Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

12.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50060

⸱

28 января 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Albany, SUNY

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Техника генетически манипулировать эпителиальных клеток в целом Бывших естественных условиях Культурной эмбриональных подчелюстной железы мыши (SMG) с помощью вирусного переноса генов описано. Этот метод использует врожденные способности SMG эпителия и мезенхимы спонтанно рекомбинировать после разделения и инфекции эпителиальных зачатков с аденовирусных векторов.

Аннотация

Ветвящийся морфогенез происходит во время развития многих органов, и эмбриональная мышиная подчелюстная железа (SMG) является классической моделью для изучения ветвящегося морфогенеза. При развитии SMG этот процесс включает в себя итеративные этапы формирования эпителиального зачатка и протока, что в конечном итоге приводит к образованию сложной разветвленной сети ацинусов и протоков, которые служат для производства и модификации/транспортировки слюны, соответственно, в ротовую полость1-3. Эпителиально-ассоциированная базальная мембрана и аспекты мезенхимального компартмента, включая мезенхимные клетки, факторы роста и внеклеточный матрикс, продуцируемый этими клетками, имеют решающее значение для механизма ветвления, хотя то, как координируются клеточные и молекулярные события, остается плохо изученным. Изучение молекулярных механизмов, управляющих морфогенезом эпителия, углубляет наше понимание механизмов развития и дает представление о возможных подходах регенеративной медицины. Проведение таких исследований затруднено из-за отсутствия эффективных методов генетической манипуляции с эпителием слюны. В настоящее время аденовирусная трансдукция представляет собой наиболее эффективный метод нацеливания на эпителиальные клетки во взрослых железах in vivo5. Однако в эмбриональных эксплантах плотная мезенхима и базальная мембрана, окружающая эпителиальные клетки, препятствуют вирусному доступу к эпителиальным клеткам. Если мезенхима удалена, эпителий может быть трансфицирован с помощью аденовирусов, а эпителиальные рудименты могут возобновить ветвящийся морфогенез в присутствии Матригеля или ламинина-1116,7. Рост эпителиального рудимента без мезенхимы также требует дополнительного дополнения растворимыми факторами роста и не полностью повторяет морфогенез ветвления, как это происходит в интактных железах8. В данной статье мы описываем метод, который облегчает аденовирусную трансдукцию эпителиальных клеток и культуру трансфицированного эпителия с ассоциированной мезенхимой. После микродиссекции эмбриональных SMG, удаления мезенхимы и вирусной инфекции эпителия GFP-содержащим аденовирусом мы показали, что эпителий спонтанно рекомбинирует с неинфицированной мезенхимой, восстанавливая интактную железистую структуру SMG и ветвящийся морфогенез. Популяцию генетически модифицированных эпителиальных клеток можно легко контролировать с помощью стандартных методов флуоресцентной микроскопии, если использовать аденовирусные конструкции с флуоресцентной мечкой. Описанный здесь метод рекомбинации тканей в настоящее время является наиболее эффективным и доступным методом трансфекции эпителиальных клеток диким или мутантным вектором в рамках сложной 3D-тканевой конструкции, не требующей генерации трансгенных животных.

Протокол

Протокол содержит четыре основных шага, как показано на рисунке 1. Все действия описаны во всех подробностях. Строительство аденовирус и вирусных очистки должны быть выполнены до начала извлечения органов для использования в генетической трансдукции расчлененный эпителиальные зачатки. Все стандартные BSL-2 Меры предосторожности следует соблюдать при работе с аденовирусов.

1. Мышиных эмбриональных подчелюстной железы (SMG) Сбор и Microdissection

  1. Усыпить тайм-беременным самкам мышей (беспородных штамм CD-1 или ICR) с использованием CO 2 наркоза, а затем путем смещения шейных позвонков и урожай строк эмбрионов мыши на эмбриональный день 13 (E13, 3-5 эпителия почек) следующих процедур, утвержденных институциональных IACUC комитет. В день открытия вагинальный плагин предназначен как E0. Слюнных желез также может быть собран и культивировали при E12 стадии, когда есть один основной бутон и стебель с трещинами только начинаетсяинициировать. SMGs до этой стадии требуют различных условий культуры, чем указано здесь.
  2. Перенос эмбрионов строк в стерильные 10 см культуре тканей блюда заполнены 25 мл DMEM / Хэма "с F12 Medium (F12) отсутствие фенола красного (Life Technologies) с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (ручка-стрептококк, Life Technologies).
  3. Используя стерильный скальпель (# 11 лезвий) и щипцы (# 5, Fine Инструменты наук, 11252-20), удалить эмбрионы из мешков в отдельное блюдо 10 см, содержащий 25 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококк.
  4. Север эмбриона головы с угловой разрез чуть ниже нижней челюсти.
  5. Изолировать нижней челюсти с головы под стерео рассекает микроскопом с передаваемой базы света (Nikon SMZ645 или эквивалент) с помощью разреза ниже верхней челюсти. Поместите тканей на вершине лишний кусок стекла, а не непосредственно на стекло компонентов микроскопа базы.
  6. Сбор нижней челюсти в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в стерильный 35 мм блюдо культуры ткани.
  7. Поместите кусочек нижней челюсти рассекая на столике микроскопа так, что язык находится на нижней части среза, но направлен в сторону от 12:00 часов.
  8. Используя одну сторону из двух скрещенных щипцами в движение ножницами, удалить и уничтожить ниже 1/3 от нижней челюсти срез.
  9. Поверните срез на 90 ° вправо (если правша) и, пользуясь ножницами разрез с помощью пинцета, вырезать верхнюю часть нижней челюсти срез (без разрезания языка) на полпути в срез.
  10. Очистите от избыточной ткани и удалить его, чтобы разоблачить пистолетов-пулеметов под ним. Там будет один на каждой стороне у основания языка.
  11. Используя одну пару щипцов, чтобы удерживать ткань языка, использовать другие щипцы, чтобы дразнить SMG от языка. Повторите эти действия для других желез.
  12. Сбор микродиссекции слюнных желез в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в новом стерильном 35 мм тканейкультуры блюдо. Примечание: чем больше подчелюстных желез (3-5 эпителиальные почки) вместе с подключенной меньше сублингвального железы (1 почка) можно культивировать нетронутыми, пропуская к шагу 4 и выполняя шаги 4.1, 4.3, и 4.4, как описано выше 2,8.

2. SMG Эпителиальные Разделение Рудимент

  1. Место 5 (или более) слюнные железы в стакан дном, диаметром 50 мм микролуночные блюдо (Маттек Corporation, P50G-1.5-14-F), содержащие 200 мкл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS не хватает Ca + + и Mg + +, Life Technologies), содержащей 0,4% (V / V) диспазы (Life Technologies, кот. нет. 17105-041) и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C.
  2. После инкубации, используя стерильные 200 мкл кончика пипетки, тщательно аспирации из диспазы решение, не нарушая желез. Сразу добавить 200 мкл DMEM/F12 средах, содержащих 5% (вес / объем) BSA (DMEM/F12-BSA, предварительно стерилизованные с 0,22 мкм), чтобы нейтрализовать диспазы.
  3. Под рассекает микроскопом, с помощью пары щипцов с тонкими советы (# 5 Dumostar, Fine Инструменты наук, 11295-20), аккуратно отделить ослабил мезенхимы со всего SMG эпителия почек и каналов, заботясь, чтобы оставить нетронутыми эпителия .
  4. Предварительно мокрой стерильные 200 мкл кончика пипетки с DMEM/F12-BSA СМИ и осторожно пипеткой из эпителиальных зачатков в новом диаметром 50 мм микролуночные блюда, содержащие 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Используйте высококачественный 200 мкл кончика пипетки с гладким краем.
  5. В блюдо, которое содержит мезенхимы частей, отказаться от любого не-мезенхимальных тканей, включая подъязычных желез и любой отдельный подчелюстной железы почки.

3. Аденовирусной инфекции эпителиальных зачатков

  1. Сделать 200 мкл вирусной инфекции СМИ путем разбавления аденовирус интерес к DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в микроцентрифуге трубку так, что титр полученного раствора составляет 1x10 8 -10 9 Pfus.оптимальных титр, необходимых для различных вирусов могут отличаться. Важно использовать хлорид цезия (CsCl)-очищенных вирусных препаратов для оптимальной эффективности поглощения.
  2. Удалите носитель из блюдо, содержащее пять эпителиальные зачатки. Быстро добавить 200 мкл инфекции СМИ, сохраняя рудименты мокрого во все времена. Принять необходимые меры предосторожности при обращении с вирусом и утилизации загрязненного советы пипетки. Лечить любого вируса загрязненными поверхностями с 10% раствором хлорной извести.
  3. Переместить эпителиальные зачатки далеко друг от друга с помощью пинцета, чтобы предотвратить их слипание и позволит им оседать на дно тарелки. Инкубируйте зачатки вирусной средствах массовой информации в течение 1 часа при комнатной температуре. Во время инкубации, отделить зачатки, если они движутся близко друг к другу. Чрезмерное качалке или движения позволит желез слипаются.
  4. После инкубации аккуратно удалить вирусные содержащих средства массовой информации и отказаться соответственно, заботясь, чтобы не нарушить гudiments. Добавить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Повторите это мыть по крайней мере, еще два раза и заменить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая СМИ. Эти моет являются критическими удалять любой вирус, который не сильно привязаны к эпителия и, чтобы предотвратить инфекцию мезенхимы.
  5. Инкубируйте эпителиальных зачатков 200 мл DMEM/F12, содержащий 2% (V / V) Matrigel (BD Biosciences, 356231) в течение 20 мин. Мы считаем, что этот короткий инкубационный в Matrigel сводит к минимуму регресс существующих трещин в начальный период культурой, но этот шаг может не производиться при воздействии Matrigel не требуется.

4. EX VIVO культуры рекомбинированные SMGs

  1. Место каждого зачатка, по одному за раз, используя предварительного увлажнения 200 мкл кончика пипетки, на вершине зубчатый (небольшой разрез) 13 мм, 0,1 мкм Nuclepore трек-Etch мембранный фильтр (ватман) плавают более 200 мкл культуральной среды ( 5 зачатки / фильтр) в стеклянным дном пластины микролуночные. Медиакультурыявляется: DMEM/F12 + ручка-острый, содержащей 50 мкг / мл трансферрина и 150 мкг / мл аскорбиновой кислоты, как описано выше 2,8. Трансферрин как известно, стимулирует выживание и морфогенеза ветвления слюнных желез и других эксплантов органа 9. Добавление аскорбиновой кислоты было показано, чтобы стимулировать ветвление SMG 10. Известно, что он действует в качестве кофактора во многих реакциях гидроксилирования метаболических путей (например, гидроксилирование пролина в формировании коллагеновых волокон 11), а также стимулирует фибронектин и ламинин производства в других эксплантов органа 12.
  2. Удалить столько средств массовой информации в верхней части фильтра, как после добавления каждого эпителиального зачатка. Слишком много средств массовой информации в верхней части фильтра может привести фильтра тонуть, а меньше средств массовой информации делает размещение зачатки и мезенхимы гораздо проще. Избыточные средства массовой информации могут быть удалены либо с кончика пипетки или с помощью щипцов для захвата средств массовой информации между советами.
  3. Место части мезенхимы, полученных сюдам 3:57 железы на верхней и / или вокруг каждого эпителиального зачатка. Извлеките все дополнительные средства массовой информации, которые окружающие железы, чтобы избежать движения мезенхимы от рудиментов. Мезенхимы выведены из более желез не выгодно, но менее может быть вредно для роста эпителиальных зачатков.
  4. Инкубируйте рекомбинированные пистолетов-пулеметов в увлажненном инкубаторе (95% воздуха / 5% CO 2) при 37 ° С в течение 48 -72 часов, как хотелось бы.
  5. Приобретать светлого и / или флуоресцентных изображений живых железы в 0 часов (по желанию), 2 часа после рекомбинации и каждые 24 часа после этого на перевернутую, в вертикальном положении, или стерео световой микроскоп снабжен цифровой камеры с использованием 4х или 5-кратным увеличением целью захватить весь рекомбинированные железы в одном кадре зрения. Изображения слюнных желез показать лучший контраст либо с помощью установки светлого или соответствующего кольца фазы помещен часть пути на свет путем (что невозможно на полностью автоматизированных микроскопов). Стандартный фазового контраста нетт необходимо, поскольку железы толстая и создает контраст.
  6. В нужное время точки, рекомбинированные пистолетов-пулеметов может быть исправлена ​​в течение 20 минут с фиксирующим раствором, приготовленным из 2% параформальдегида (PFA) в 1X PBS, содержащем 5% (вес / объем) сахарозы (чтобы лучше сохранить внутреннюю клеточную структуру, сохраняя клетки isosmotic состоянии). В отличие от 4% PFA, PFA 2% позволит сохранить значительное количество сигнал GFP, если фиксатор полностью удаляется после фиксации. Железы можно хранить до 1 недели в 1X PBS в темноте при 4 ° С до целого иммуноцитохимия крепления и конфокальной микроскопии осуществляется, как сообщалось ранее 3,6,13-15. В идеале, иммуноцитохимия и изображения должны быть выполнены вскоре после фиксации для получения наилучшего качества изображения. Железы могут быть также лизировали в буфере RIPA для SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Поток из основных экспериментальных шагов указаны на рисунке 1. Пример нетронутыми SMG, изолированных эпителиальных зачатков, и соответствующий мезенхимы показано на рисунке 2. Светлое изображение рекомбинированных пистолетов-пулеметов, которые продолжают подвергаться морфогенеза ветвления при культивировании естественных бывших в указанное время, показаны на рисунке 3. Рекомбинированные железы выросла на 48 часов выражения эпителиального GFP показано на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Экс естественных эпителиальных мезенхимальных рекомбинации техника была впервые опубликована в подчелюстной слюнной железы в 1981 16. В этом протоколе, мы расширяем на оригинальный метод, с помощью аденовирусной инфекции манипулировать эпителиальные клетки экспрессии генов в контексте рекомбинированные железы. Мы показали, что процент эпителиальных клеток, инфицированных аденовирус, в то время как процент клеток, которые заражены зависит от свойств вирусного промотора, титр вируса, и вирусный чистоты...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Дейдра Нельсон за полезные замечания и критическое чтение рукописи. Эта работа финансировалась грантами NIH DE019244, DE019197, и DE021841 к ML, F32DE02098001 к SJS, и C06 RR015464 в университете в Олбани, штата Нью-Йорк.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
DMEM / Хэма "с F12 среде без фенола красного Life Technologies 21041-025
Пенициллина и стрептомицина Life Technologies 15070-163 10X складе
Диспазы Life Technologies 17105-041 Замораживание одной порции использования на-20C
BSA Сигма A2934-100G Доля V, низкий эндотоксина
Adeno-X-GFP BD Biosciences 8138-1 Должен быть высокий титр (1x10 10 БОЕ / мл). CsCl очищенного вируса являются более эффективными, чем столбцов очищенных вирусов в этом анализе.
16% параформальдегид Электрон наук микроскопии 15710 Разводненная прибыль на 2% в PBS с 5% сахарозы (вес / объем)
1X фосфат-солевым буфером (PBS) Life Technologies 70011-044 Получают из 10х складе
Сбалансированный солевой Хэнка решение Life Technologies 14175095 нет кальция, магния нет, не Фенол красный
Трансферрин Сигма T8158 25 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 СМИ. Замораживание одноразовые аликвоты при-20C
L-аскорбиновая кислота (витамин С) Сигма A4403 75 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 media.Freeze одноразовые аликвоты при-20C
Таблица 1. Список реагенты для SMG рекомбинации протокол.
10 см стерильная посуда пластиковая Гранулирование 430167 Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован.
Stereo рассекает микроскопом в проходящем свете базу Nikon SMZ645 Любой стерео рассекает микроскоп может быть использован, который имеет проходящем свете базу.
35 мм блюд культуре ткани Сокол 353001 Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован.
Диаметром 50 мм микролуночные блюд Маттек корпорации P50-G-1.5-14F
Nuclepore трек-Etch мембранные фильтры Ватман 110405 Диаметром 13 мм, 0,1 мм, размер пор
Широкоугольные флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss, США Axio наблюдателей Z1 Любой флуоресцентного микроскопа (в вертикальном положении, яnverted или стерео рассекает микроскопом) может быть использован для мониторинга GFP выражение при небольшом увеличении с приложенной цифровой камеры.
Конфокальной микроскопии Leica Microsystems TCS SP5 Конфокальной микроскопии необходимо, чтобы увидеть подробную клеточных структур. Любой конфокальной микроскопии может быть использована.
Временный беременных самок мышей, штамм CD-1 или ICR Charles River Labs Эмбрионы собирали в день 13 (с днем ​​плагин открытия обозначен как день 0).
Лезвие скальпеля № 11 Средства изобразительных наук 10011-00
Скальпель ручкой № 3 Средства изобразительных наук 10003-12
Дюмон # 5 пинцет из нержавеющей стали сплава, 0,05 X 0,02 мм Средства изобразительных наук 11252-20 Идеально подходит для уборки желез из эмбрионов
Дюмон # 5 щипцы dumostar сплав, 0,05 X 0,01 мм Средства изобразительных наук 11295-20 Изобразительное советы, необходимые для удаления мезенхимы из эпителия. Вольфрам иглы также может быть использован.
Таблица 2. Оборудование, используемое в SMG рекомбинации протокол.

Ссылки

  1. Tucker, A. S. Salivary gland development. Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).
  2. Sakai, T., Onodera, T. Embryonic organ culture. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19(2008).
  3. Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation. 74, 349-364 (2006).
  4. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).
  5. Zheng, C., et al. Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland. J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).
  6. Larsen, M., et al. Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis. Developmental biology. 255, 178-191 (2003).
  7. Hoffman, M. P., et al. Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms. Development. 129, 5767-5778 (2002).
  8. Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development. Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).
  9. Partanen, A. M., Thesleff, I. Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture. Differentiation. 34, 25-31 (1987).
  10. Naka, T., et al. Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate. In Vivo. 19, 883-888 (2005).
  11. Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. The Proteins. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).
  12. Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture. Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).
  13. Daley, W. P., et al. ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity. Development. 139, 411-422 (2012).
  14. Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis. Developmental biology. 336, 169-182 (2009).
  15. Sequeira, S. J., et al. The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds. Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).
  16. Nogawa, H., Mizuno, T. Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development. Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).
  17. Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423, 876-881 (2003).
  18. Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).
  19. Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science. 329, 1645-1647 (2010).
  20. Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis. J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).
  21. Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells. Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).
  22. Zheng, C., Baum, B. J. Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands. Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).
  23. Hsu, J. C., et al. Viral gene transfer to developing mouse salivary glands. J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Поднижнечелюстная слюнная железааденовирусная трансдукцияэпителиально-мезенхимальная рекомбинацияветвящийся морфогенезSMG эмбриона мышифлуоресцентная микроскопияиммунохимический анализвестерн-блоттингкультура в Matrigelметод рекомбинации тканей
Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.