Методическая статья

Очистка стенограммы и метаболитов из

24.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50245

⸱

15 марта 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida , 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida , 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida , 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь процедуры выделения и очистки мРНК и метаболиты Drosophila Головами. Мы применяем эти методы, чтобы лучше понять сотовой возмущения, лежащие в основе дегенерации нейронов. Эти методики можно легко масштабировать и адаптировать для других "ЭКОНОМИЧЕСКОЕ» проектов.

Аннотация

За последнее десятилетие мы пытались понять молекулярные и клеточные механизмы дегенерации нейронов использованием Drosophila в качестве модельного организма. Хотя плодовых мушек обеспечивает очевидные преимущества экспериментальные исследования в области нейродегенеративных заболеваний, в основном полагаются на традиционные методы, в том числе генетических взаимодействий, гистология, иммунофлюоресценции, и биохимии белка. Эти методы являются эффективными для механистической, гипотеза управляемой исследования, которые приводят к глубокому пониманию роли отдельных генов в четко определенных биологических проблем. Тем не менее, нейродегенеративные заболевания являются очень сложными и затрагивают многочисленные клеточные органеллы и процессов с течением времени. Появление новых технологий и возраст омик предоставляет уникальную возможность понять глобальной сотовой возмущения, лежащие в основе сложных заболеваний. Гибкая модельных организмов, таких как Drosophila идеально подходят для адаптации этих новых технологий из-за их сильной AnnotATION и высокая уступчивость. Одна из проблем с этими мелкими животными, однако, заключается в очищении достаточно информационных молекул (ДНК, РНК, белков, метаболитов) с весьма актуальны ткани, такие как мухи мозги. Другие проблемы включают сбор большого количества мух для экспериментальной репликации (критический для статистической устойчивости) и развивающихся последовательные процедуры для очистки высокого качества биологического материала. Здесь мы описываем процедуры для сбора тысячи мух руководителей и добыча стенограммы и метаболитов, чтобы понять, как глобальные изменения в экспрессии генов и обмена веществ способствуют нейродегенеративных заболеваний. Эти процедуры легко масштабируются и могут быть применены к изучению протеомных и эпигеномном вклад в болезнь.

Введение

В прошлом веке, Drosophila оказалось бесценным инструментом лабораторию для исследования глубоких биологических вопросов, прежде всего в развитии, клеточной биологии, генетики и нейробиологии 1. Причины этого успеха в том, что плодовые мухи легко манипулировать, имеют постоянно расширяет инструментарий 18, 21, 31, и обладают относительно простой геном с высоким качеством аннотацию 26. Эти технические преимущества, в сочетании с изобретательностью и постоянные инновации в лету сообщества, привели к широкому научному вкладу, о чем свидетельствует присуждение трех Нобелевских премий (1933, 1995, 2011). Совсем недавно, Drosophila стала соответствующих моделью для изучения человеческих болезней, в первую очередь нарушениями развития, врожденный иммунитет, рак и нейродегенеративные 2. Мы особенно заинтересованы в раскрытии клеточные и молекулярные основы нейродегенеративных заболеваний. Эти сложные и разнообразные сотрудничествеnditions связаны с собрания, возможно, растворимых олигомеров, аномально свернутых белков и, следовательно, легко моделируется в мух. Все основные нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, несколько атаксии, tauopathies, прионных заболеваний и других редких заболеваний, были смоделированы у мух за последние пятнадцать лет 23. Fly лаборатории внесли свой ​​вклад в понимание этих заболеваний главным образом за счет использования доблесть дрозофилы генетики для выявления новых генов, участвующих в нейротоксичности патогенных белков. После новых генов, имеющих отношение к нейротоксическое каскада будут определены, их последствия, как правило, анализируются традиционные подходы, в том числе гистологии, чтобы установить формы дегенерации, иммунофлюоресценции, чтобы определить распределение белков и клеточной патологии и биохимические анализы для оценки количества и типа аномальной конформации белка . Наконец, поведениеioral анализа служит в качестве функционального считывания исходы заболевания. Эти устоявшихся методов были использованы для изучения вклада одного или нескольких генов-кандидатов в процесс болезни, в том числе окислительного стресса и митохондриальная дисфункция 13, транскрипционной регуляции 9, 27, 30, аберрантной аксонального транспорта и синаптической активности 14, ненормальные РНК Биология 9, нарушения регуляции клеточной сигнализации 29, ER dyshomeostasis 6, препятствует сотовой proteostasis 33, и многие другие 23. Тем не менее, пока не ясно, как эти токсичные белки могут помешать одновременно с несколькими взаимосвязанными путями, что это временная последовательность этих изменений, и то, что относительный вклад каждого путь к патогенез. Десятилетия исследований, направленных на одного гена, гипотеза управляемой подходы у людей и животных моделях привело к неполной, загадочные картины клеточные механизмы, которые вызываютнейродегенерации. В настоящее время плохое понимание точных механизмов, с помощью которых эти токсичные сборки белка вызывает невропатологии является основным ограничением для развития болезни изменения терапии.

В настоящее время мы заинтересованы в применении новых подходов к пониманию того, как эти патогенные белки вызывают глобальное сотовой возмущения. Наступление эры омик позволяет глубокой зондирования сложные биологические проблемы с помощью сложных высокопроизводительных технологий, которые могут привести к эффективному лечению заболевания в ближайшем будущем. Экспрессия генов (транскриптомику) исследований были установлены после завершения нескольких последовательностей генома, так как высококачественное аннотации может предсказать наиболее стенограммы. Последнее приложений следующего поколения секвенирования для анализа транскриптов (РНК-след) предоставил новые преимущества и возможности по сравнению с микрочипов, в том числе беспристрастный подход, улучшение количественного диапазона, а также снижение стоимости 32.Мы хотим, чтобы использовать преимущества РНК-след, чтобы лучше понять наиболее распространенная форма преимущественно унаследовала атаксия, спиноцеребеллярные типа атаксии 3 (SCA3) или Мачадо-Джозефа болезни. SCA3 является моногенных, доминантное заболевание с полной пенетрантностью, вызванных CAG тринуклеотидной расширения в гене Ataxin3 (ATXN3) 16. Эта мутация приводит к производству Atxn3 белка с длинным полиглутаминовых (polyQ) трека, что делает его склонным к совокупности. Поскольку мутант Atxn3 является нейротоксическое агента в SCA3 ответственность за все связанные с болезнью возмущения, это идеальный болезни для применения этих новых подходов OMIC. Кроме того, SCA3 был одним из первых нейродегенеративных заболеваний, смоделированные в мух 34.

При установлении процедуры сбора большого количества мух головки для РНК-след, мы поняли, что мы могли бы использовать тот же материал для проведения глобальных исследований других информационных молекул. Среди других новых discipлиний, протеомики, epigenomics, и метаболомики позволяют рассмотрении клеточной патологии на глубину не ранее достигнутые, хотя и не без проблем. В отличие от мРНК, каталог белков и метаболитов довольно неполными в это время в связи с увеличением трудности в прогнозировании всех возможных вариантов сплайсинга и еще более загадочное происхождение всех нормальных и патогенных метаболитов. Большие усилия в настоящее время в каталог белков во многих организмах и при болезненных состояниях. Для этого мы хотели сосредоточиться на вклад измененных метаболитов в патогенезе SCA3 помощью простых организмов, таких, как дрозофилы. Это относительно новое и перспективное направление, особенно с недавним введением ядерного магнитного резонанса (ЯМР), который обеспечивает высокую воспроизводимость и не разрушает образцов 5, 24. Мы полагаем, что метаболит профилирования может способствовать выявлению и биомаркеров заболевания механизмы, вовлеченные в neurodegeneratiо.

Одним из важных моментов с этими ЭКОНОМИЧЕСКОЕ проектов является то, что они требуют больших, однородных образцах (200 глав лету), а также точные методы очистки, чтобы минимизировать экспериментальные вариации. Мы начали собирать мух следующие процедуры мы использовали ранее для микрочипов, а также используется в последнее время для РНК-след 12. Но вскоре мы столкнулись с рядом проблем, связанных с misexpressing SCA3 конструкций. Во-первых, мы должны были выбрать Gal4 драйверов для этих экспериментов 4, где ткани-мишени для анализа была мозга. Очевидный выбор был бы пан-нейронных драйвера, так как SCA3 это болезнь мозга. Однако, поскольку мы намерены собрать мРНК и метаболитов из цельной головы, эта опция будет производить смешанный материал из тканей выразить и не выражает конструкций. Для создания однородных образцов, где все клетки экспрессируют конструкций, мы решили использовать слабые, но вездесущий драйвер линии, daughterless (да)-Gal4. Интереспокалывание, многие из генов, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, в том числе ATXN3 20, имеют широкого распространения, делая выбор повсеместного выражение уместно. Затем, с которыми мы столкнулись вторая проблема: повсеместное выражение патогенного Atxn3-78Q вызвало летальность при развитии. Чтобы обойти эту летальность, мы включили Gal80 TS контролировать временную активацию Gal4 19. Это позволило нам собрать экспериментальную мухи, возраст их на срок до 20 дней, заморозить их, и обрабатывать их лиофилизированный главы либо РНК (TRIzol) или метаболит (метанол-хлороформ) добычи (рис. 1). Мы уже использовали этот протокол для получения образцов для транскриптомных и metabolomic анализов, но есть и другие очевидные применения этой методики (например, протеомных или нервно-peptidomic анализов).

Экспериментальный обзор: общая цель этих протоколов является поддержка коллекция ПОСЛУЖИТЬСтент образцов лету главы по добыче стенограммы и метаболиты. Конкретная цель этих процедур является приобретение мух выражения Atxn3-27Q и Atxn3-78Q (не-патогенных и патогенных экспериментальных конструкций), а также LacZ (контроль конструкция), где один образец состоит из 200 глав лету. Хотя современная технология позволяет анализировать очень маленькие образцы, в том числе одиночных камерах 28, мы объединенных 200 голов для устранения экспериментальных, биологических и технических изменений, что позволяет нам идентифицировать клеточные изменения, связанные с процессом болезни с высокой статистической достоверностью. Этот подход предназначен для обнаружения только те изменения в экспрессии генов, которые соответствуют населения, направляя нас к наиболее важным пути движения дегенерации. Так как мы заинтересованы в возрастных изменений в головах этих мух, каждый генотип был получен на 1, 10 и 20 дней от роду.

Одним из основополагающих аспектов этихглобального анализа является производство биологических повторяет, которая поддерживает устойчивое статистического анализа. Наш опыт работы с микрочипов и РНК-след показывает, что анализ биологических образцов в трех экземплярах обеспечивают сильную статистическую значимость данных 11, 12. Мы описываем в разделе 1) как создать единый биологический повторных (Rep 1) для каждой точки генотипа и времени. Эти процедуры могут быть повторены для создания Репс 2 и 3, или сделать параллельно, так как каждый Rep правильно идентифицировать. Хотя три Репс это цель, установив четвертый (или даже пятый) Вес Настоятельно рекомендуется, чтобы покрыть вопросы, связанные с низкой доходностью, потеря мух в процессе старения, или случайной потери материала (мухи, головы, или РНК) в одном или нескольких образцам.

Мы обнаружили, что десять крестов (бутылки обозначены буквами AJ) производится достаточно для получения потомства 200 голов / генотип / момент времени. Особая осторожность должна применяться, чтобы избежать путаницы, поскольку большое количество бутылокповторно, необходимых для получения одного Rep (10 бутылок х 3 х 3 генотипов моменты времени = 90 бутылок). Для этого мы обозначили каждую бутылку, используя генотип, момент времени, и бутылка письмо. Например, SCA3-27Q 20E относится к пятой бутылки (из десяти) мух выражения Atxn3-27Q в возрасте за 20 дней. После того, потомство eclose, мухи сохраняются в отдельных флаконах с надписью уникальный идентификатор.

Мы сохранили количество мух, полученные для каждого образца, бутылки, и пункт сбора (утром и вечером) в таблицу Excel. Мы пересмотрели количество мух на флакон до замораживания, чтобы принять во внимание летальности и беглецов. Из тех, окончательный подсчет, флаконы добавлением 200 мух может быть легко расположен перед открытием морозильной камеры, способствуя тем самым сохранению образцов. Так как мухи собраны из одной бутылки может быть использован только в одном Вес, мы максимально их вклад в биологическую повторных, хотя все Репс, содержащихся мух от нескольких бутылок. Мы зарезервировалимух от бутылки не используются в их запланировано Вес для других Репс, в качестве замены образцов, или других связанных с экспериментами (вестерн-блот, КПЦР).

Протокол

1. Создание репликации и морозильной Мухи (осторожно, жидкий азот)

Цель: Сбор по меньшей мере 200 женщин в генотипе / момент времени, и флэш-замораживания.

  1. Генотипы: Gal80 ТС; да-Gal4, штамм для повсеместного выражение Gal4 под контролем daughterless регуляторной области и чувствительные к температуре Gal80. В качестве контрольной линии, мы использовали UAS-LacZ, которое ранее было показано, не вызывают вредные последствия. UAS-Atxn3-27Q и UAS-Atxn3-78Q, не-патогенных и патогенных экспериментальных конструкций, соответственно. (Y, HS-спрятанный строительстве был использован ранее для более эффективного сбора женщины девственница, но мы решили с ним из-за дополнительного времени, необходимого для внедрения Y, HS-HID с Gal80 ТС; да-Gal4 на хромосомах II и III).
  2. Развернуть все акции путем объединения 10 женщин и 5 мужчин в бутылкеа для предотвращения перенаселенности. Все эксперименты проводились в Jazz Mix лету массовой информации, которые легко приготовить и способствует быстрому росту Drosophila и низкой зараженности клещей.
  3. Соберите 50 Gal80 ТС; да-Gal4 мужчин и 100 UAS-Atxn3-78Q девственниц (только один UAS линия будет использована в качестве примера) для каждого момента времени.
  4. Сделайте десять крестов в генотипе / момент времени. Anesthetize мужчин и женщин на диоксид углерода (CO 2) спальное место / площадку. Место десять девственница UAS-Atxn3-78Q мух (не старше пяти дней) и пять мужчин Gal80 ТС; да-Gal4 в каждую бутыль с шипами дрожжей пасты (регидратации сухих дрожжей). Этикетка бутылки с генотипами, моменты времени, и бутылка идентификаторов (буквы AJ), и разместить их на 25 ° C.
  5. После 2 дней, снимите взрослых из бутылки, добавить посыпать сухими дрожжами и струей воды, чтобы способствовать оптимальному роста личинок, и поместить бутылки при температуре 18 ° C (Gal80 активной,Gal4 репрессированных). Не копируйте крестов, так как это может ввести экспериментальный изменчивость потомства, полученных из оплодотворенной против женщин девственница. Кроме того, потомства от каждой бутылке представляет независимой биологической репликации (каждая бутылка производит уникальные потомство), но передается крестов (копий) был бы техническим копирует (дополнительные потомство с такой же генетической конституции).
  6. Когда потомство ecloses при 18 ° C, обезболить на CO 2 спальное место / площадку, собирают девственницы нужных генотипов, и разместить их в небольших флаконах с (11:58 мух в одном флаконе). Этикетка флаконы с бутылкой идентификатор. Не бассейна летит из разных бутылок. Поместить флаконы назад на 18 ° C в течение 24 часов. Для максимального потомство, продолжить сбор на последовательных утрам и вечерам.
  7. При каждом флаконе завершается 24 часов при 18 ° C, переложить их на 29 ° C (Gal80 неактивным, Gal4 активный). Это день 0, отправной точкой эксперимента, когда тОн трансгенов инициировать их выражения.
  8. Передача мух для очистки флаконов каждые 2 дня, пока они не достигнут дней 10 и 20.
  9. Когда мухи достичь желаемого возраста (1, 10, 20 дней), считать и перевести их из пищи флаконов в предварительно помечены криопробирки с помощью небольшой воронки. Не обезболить мух. Переверните флаконов на скамейке запасных.
  10. Подождите 30 минут, чтобы мухи, чтобы оправиться от передачи (стресс), то флэш-замерзают флаконы путем погружения в жидкий азот и хранят в предварительно помечены, предварительно охлажденные морозильной камере окно. Помните: Замораживание мух в том же порядке они были переданы в криопробирку, что делает время, проведенное в криопробирку одинаковы для всех образцов.

2. Сбор и Лиофилизация Fly глав (Выполните в холодильной камере, Pre-холод Все оборудование, ВНИМАНИЕ, жидкого азота и сухого льда)

Цель: Быстрая разделения, сбора и сублимационной сушки ткани.

  1. AssemBLE сито (крупнейший сетки в верхней палате собирать тела, второй по величине в нижнюю палату собирать головы, крышки на нижней собирать мелкие детали) и предварительное охлаждение при -80 ° С в течение 30 мин.
  2. Соберите 200 мух от криопробирки за счет максимального вклада мух возник из той же бутылки. Чтобы компенсировать различия между мух, собранных в утром или вечером, чтобы каждый образец использует идентичные утро / вечер отношение (мы использовали 47% утро / вечер 53%). Примечание: в результате РНК из двух 100-главы образцы могут быть объединены позже, чтобы создать эквивалент 200 мух в одном сосуде.
  3. Холод кусок парафильмом (~ 9 х 14 см) на сухом льду в течение 5 мин.
  4. Пустые криопробирки с полной мух на парафильмом, несколько за один раз; количество мух с использованием кисти, и в магазине в другом криопробирку на сухом льду до достижения 100 мух.
  5. Опустите сито в жидком азоте, добавить 100 мух в верхнюю chambэ. Встряхните сито энергично в течение 1 мин. Опустите его в жидкий азот снова, и встряхивают в течение 1 мин.
  6. Откройте сито, собрать глав из нижней камеры в микропробирку, и место при температуре -80 ° C.
  7. Откройте микропробирок, оберните вершины в парафильмом, и сделать небольшие отверстия.
  8. Поместите образцы в лиофилизатор в течение как минимум 2 дня.

3. Всего РНК добычи и очистки мРНК (обрабатывать все поверхности RNaseZap Смена перчатки часто)

Цель: однородный ткани максимальной урожайности, извлекать общей РНК и очистить мРНК.

  1. Удалить образцов из стоп-сушилка и добавить три маленьких, стерильный, стальных помольных шаров в каждой микропробирки. Место в Geno / Grinder; запустить в 1500 ударов / мин в течение 1 мин.
  2. Откройте трубы, добавляют 1 мл TRIzol, и запечатать трубы с парафином. Измельчить 1 мин; нажмите трубы вверх-вниз, чтобы выбить стальных шаров в случае необходимости. Измельчить 1 мин.
  3. Нецентрифуге трубки в этой точке (труба, будет хрупкий). Перенесите смесь (кроме стальных шаров) в новой РНКазы микропробирок. Пелле сотовой мусора в настольный микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин при 12000 х г.
  4. Передача супернатант в новую микропробирок. Добавить 0,1 объемами 1-бром-3-хлорпропана (BCP); энергично встряхивать в течение 15 сек. Выдержите при комнатной температуре в течение 3 мин. Побочные в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 15 мин при 12000 х г Примечание: многие выделения РНК протоколы используют хлороформ на данном этапе; BCP предназначена для максимального выхода РНК путем повышения эффективности разделения фаз.. Хранение образцов при 4 ° С в течение центрифугирования шаг также повышение эффективности разделения фаз и снижения загрязнения белка и геномной ДНК в водной фазе.
  5. Передача верхнего водного слоя в новый микропробирок. Осадок РНК путем добавления 0,5 объемов ледяной изопропанол; инвертный шесть раз, чтобы мильх. Выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин. Побочные в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 10 мин при 12000 х г.

Примечание: В дополнение к восстановлению РНК, белков также может быть извлечен из органического слоя и межфазных TRIzol, так как протеомики и транскриптомику анализы могут быть выполнены на тех же образцах. Хотя мы не выполните этот шаг в нашем анализе, TRIzol добычи дает отличное представление растворимых белков и большей представленности мембран и ядерные белки, чем большинство буфер / моющее средство экстракции. Ли и Ло 17 описывают процедуру для извлечения белков с использованием TRIzol подходит для протеомики анализов, в том числе 2-D гель и LC-MS/MS.

  1. Удалить супернатант. Вымойте РНК путем добавления 1 мл ледяного 70% этанола (используется DEPC обработанной воды), и перемешать с коротким вихря. Побочные в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин при 12000 х г.
  2. Удалить супернатант. Воздух сухой осадок наПо меньшей мере 15 мин. Добавить 80 мкл DEPC воды в осадок РНК и поместить его на 55 ° C в течение 10 мин. Оставьте при 4 ° С в течение ночи.
  3. Определить концентрацию РНК с использованием NanoDrop спектрофотометр. Отношение оптической плотности при 260 нм nm/280 должно быть между 1,8 и 2,1, с 2,1 оптимальных.
  4. Принимать по 30 мкг РНК масса, добавить 4 U ДНКазы I, 60 U RNasin, 10 мкл 10х буфера реакции, и DEPC обработанной воды, чтобы довести общий объем до 100 мкл. Инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин.
  5. Очищают РНК с использованием RNeasy Мини комплект. Следуйте инструкциям производителя, за исключением выполнения всех центрифугирования в течение 30 секунд и включать все "необязательные" шаги.
  6. Определить концентрацию РНК с использованием NanoDrop, и оценки качества РНК с использованием "общего пико РНК" анализ на BioAnalyzer.
  7. Для очистки мРНК, передавать 30 мкл Dynabeads для РНКазы пробирке.
  8. Положите трубку на магните в течение 1-2 минут и удалить супернатант. Ресуспендируют бусины в15 мкл буфера для связывания. Повторить.
  9. Начиная с 5 мкг общей РНК, регулировать громкость до 15 мкл использованием DEPC воды. Тепло при 65 ° С в течение 2 мин, и место на льду.
  10. Добавить 15 мкл тотальной РНК в 15 мкл предварительно промытый бисера. Тщательно перемешать с помощью пипетки каждые 5 мин в течение 30 мин для отжига РНК с бисером. Место на магните в течение 1-2 минут и удалить все супернатант.
  11. Добавить 35 мкл Стиральные Mix буфера B. тщательного пипетирования. Поместите на магните и осторожно удалите супернатант. Повторите мыть два раза.
  12. Элюируйте мРНК путем добавления 15 мкл холодного 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5) и нагревание до 80 ° C в течение 2 мин. Немедленно поместите трубку на магните, передает супернатанта РНКазы трубку, и заморозить при температуре -80 ° C. Количественная как в 3,8). Доходность должна быть ~ 1-5% от общего числа РНК.

Для metabolomic анализ, выполняют протоколы 1 и 2), и приступить 4) ниже:

4. Метанол-хлороформ Дополнительныеие метаболитов

Цель: Отдельная полярных и неполярных метаболитов.

  1. Добавить антиоксидант бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) в хлороформе при концентрации 0,1 мг / мл для предотвращения автоматического окисления липидов при добыче. Используйте этот BHT-хлороформ для всех последующих шагов.
  2. Передача 200 голов в охлажденном, предварительно взвешенные конической винтовой крышкой полипропиленовых труб, замораживания при температуре -80 ° С, а lyophilize. Определение сухого веса.
  3. Положите 5-7 бусин циркония в трубах и гомогенизации в шарик-насадка для двух циклов 20 сек каждый на 800 Гц.
  4. На основе сухого веса тяжелых образцов, добавить воду, метанол, хлороформ и в следующих соотношениях: 11,74 х метанола; 10,59 х вод; 11,74 х хлороформ, где х вес самого тяжелого образца в граммах и продукт объем в мл. Добавить все метанола, как рассчитывается и 45% от общего объема воды на борт трубки колотушки, содержащий лиофилизированную головы.
  5. ГомогенизацииZE в шарик для взбивания еще на два цикла 20 сек каждый.
  6. Комбинат объемов хлороформа (100%), а остальная часть воды (55%) в конической стеклянный пузырек на льду. Затем перенесите ткани смесью (с бисером) в стеклянном флаконе. Встряхивают в течение 10 мин. Инкубировать в течение 10 мин на льду.
  7. Вращаться в центрифуге при 4 ° С в течение 5 мин при 2000 х г. Удалить полярных (верхней) фазы с пипетки Пастера (избегать пластмасс) и место во второй трубке микроцентрифуге.
  8. Сохранить неполярных (нижней) фазы в небольшой стеклянный пузырек и заморозить при температуре -80 ° C. Высушите в потоке газообразного азота, убедитесь, что трубы, идущие от бака азота высокой чистоты Tygon, чтобы избежать пластификатора в экстракте.
  9. Увлажняет неполярной фазы с 620 мкл дейтерированного хлороформа. Передача 600 мкл меченых в трубах ЯМР. Хранить в взрывозащищенные -80 ° C морозильнике.
  10. Поместите полярной фазы в Centrivap и работать, пока трубка полностью высохнет при 30 ° C (~ 7 часов).
  11. Rehydrate полярной фазы с 620 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,3) в оксид дейтерия с 1 мМ ТСГУ [3 - (триметилсилил) пропионовой-2 ,2,3,3-d4 кислоты] в качестве внутреннего стандарта. Vortex в течение 30 сек. Побочные в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин при 10000 оборотов в минуту, чтобы осадок пигментов и других крупных молекул, которые будут мешать спектров ЯМР. Передача 600 мкл супернатанта помечены труб ЯМР.

Результаты

Чтобы обойти летальность индуцированных повсеместное выражение расширенного Atxn3 под контролем да-Gal4, мы ввели временное регулирование Gal4 с Gal80 TS. Но прежде чем приступить к сбору и замораживание большого количества мух, мы хотели определить выражением динамики наших трансгенов под контролем Gal80 ТС и да-Gal4. Чтобы сделать это, мы получили кресты, оставил потомство при 18 ° C, собранных взрослых мух, и поддерживать их в течение 24 ч при температуре 18 ° C. Затем мы поместили мух на ограничительные температуры (29 ° C) и выдерживают их на 0, 6, 12, 24, 36, 48 и 72 час. Далее, мы обнаружили скопление расширенных аллелей polyQ по вестерн-блот с одной мухи после опубликованных протоколов 10. Выражение было впервые обнаружено, но слабый 6 часов после сдвига температуры и продолжали расти до 48 часов, когда она достигла уровня насыщения (рис. 2A). Интереспокалывание, высокий молекулярный вес группы нерастворимых polyQ появились после 48 часов, что свидетельствует о времени, которое требуется для белков с образованием крупных агрегатов. Мы также расчлененные лету мозг в каждый момент времени для определения распределения расширенной аллель polyQ с помощью иммунофлуоресценции (рис. 2В). Белок был впервые обнаружен 24 часа после сдвига температуры, хотя и с неравномерным распределением. Между 24 и 48 час уровни белка продолжает расти, делая несколько мозговых центров отчетливо видны, в том числе усиков долей и грибов проекции тела (рис. 2В). Между 48 и 72 час выражения расширенного аллель polyQ достигли максимальных уровней, предполагая, что Gal4 система была полностью активирована в данный момент. Основываясь на этих результатах, мы выбрали 24 часа после сдвига температуры как первый момент времени (день 1) для последующих экспериментов. Коллекции мухи 10 и 20 дней от роду были также обнаружены начиная с температурным сдвигом (TIМне 0), который является временем, когда эксперимент начинается с нового выражения патогенных и контроля трансгенов.

Как только мы убедились, что Atxn3 был обнаружен после того, как 24 часа в сутки под контролем Gal80 ТС и да-Gal4 при 29 ° C, интересно ли это мухи будут показывать признаки нейродегенерации в течение 20 дней. Так как эти мухи начнут выражать патогенные белки, как взрослые, мы боялись, что они, возможно, потребуется длительное время инкубации, чтобы показать нейродегенеративных фенотипов. Для определения токсичности Atxn3-78Q в этих условиях, мы собрали мух выражения LacZ, Atxn3-27Q, и Atxn3-78Q, и записал их долговечность. В то время как мухи выражения LacZ и Atxn3-27Q отображаться более 90% жизнеспособность после 20 дней, летит выражения Atxn3-78Q показал низкую выживаемость в день 20 (30%) (рис. 3). В самом деле, Atxn3-78Q мух начали умирать в день 10 (7% смертности) и на 15 день потеря была значительной (20%), которое ускорилось в последние пять Dн я. Таким образом, эти результаты показывают, что взрослые выражение патогенного гена привело к сокращению продолжительности жизни, ключевым признаком нейродегенеративных фенотипов индуцированных Atxn3-78Q.

Одним из наиболее важных аспектов этого протокола была обработка и сохранение образцов после замораживания для обеспечения качества материала извлечены. Мы извлекли между 15-80 мкг общей РНК на 200 голов (в зависимости от возраста и генотипа) до ДНКазы лечение в соответствии с NanoDrop. Приблизительно одна треть (6-25 мкг) были обнаружены в высшей степени чистой РНК после лечения ДНКазой на отношение поглощения при 260 нм nm/280. Тем не менее, мы обнаружили, что лучший способ определить качество РНК для получения кДНК библиотеки для РНК-след был анализ общей РНК на BioAnalyzer. К счастью, лишь небольшое количество РНК (5 нг) был использован на BioAnalyzer, так что это не повлияет на способность производить несколько библиотек на образец. В качестве примера, мы провели два образца от общего числаРНК до ДНКазы лечения на чипе BioAnalyzer, один из них подозревается в деградирует (рис. 4A-C). Высокое качество РНК (образец № 1) подготовила три резких полос РНК, два чуть ниже 2000 нуклеотидов (нт) в размере и меньшей шириной менее 200 NT, представляющий рибосомальной РНК (рис. 4а). Две полосы около 2000 нуклеотидов соответствует 18S рРНК (меньший пик) и два фрагмента из 28S рРНК (больший пик), который представляет собой уникальный аспект биологии рРНК у дрозофилы (рис. 4В). Эти качества были также обнаружены в след BioAnalyzer (рис. 4В). В отличие от деградированных образцов РНК (образец 2) не производить резких пиков рибосомной РНК, и накопленный несколькими полосами менее 500 нуклеотидов (рис. 4а). Это распределение по размерам было легко отличить от следов BioAnalyzer (рис. 4в), в которой широкие пики меньшего размера отмечено не было. Также важно отметить, Wкак разница в единицах оси у двух образцов РНК, которая показала, что деградированных образцов было меньше РНК. Только РНК отображать максимальное качество (NanoDrop отношение поглощения при 260 нм nm/280 между 1,8 и 2,1, с 2,1 оптимальной, см. протокол шагом 3,8) будет использоваться для генерации библиотек.

Для экстракции метаболитов, мы следовали классическим вода / метанол / хлороформ (2.0:2.0:1.8) добыча процедуру 3 разделилась на два шага, чтобы максимизировать добычу как полярные, так и неполярные метаболитов 35. После разделения полярных и неполярных фазах, мы восстановленного им в дейтерированном вода или дейтерированного хлороформа, соответственно, и добавил, внутренние стандарты для анализа методом ЯМР. ЯМР-спектры, полученные с помощью этого метода извлечения были также решены с плоским исходных данных и узких линий (рис. 5), что указывает на очистку высококачественных экстрактов, подходит как для метаболического профиляг идентификация большого числа метаболитов. рисунке 5 показана идентификация несколько знаменитых пиков, соответствующих весьма обильные метаболиты, такие как глюкоза и сахароза, и два ключевых метаболических кислот, лактата и ацетата, в соответствии с химическим сдвигам в литературе 7. Химический сдвиг (в частях на миллион) представляет собой электромагнитное экранирование молекулы по отношению к стандартной молекулой (TMS, первый пик справа). Более shieldedmolecules имеют более высокую плотность электронов вокруг ядра и появится в правом спектре, в том числе алкилы. Deshielded молекулы, такие как амид и ароматических атомов водорода появятся в левой части спектра. Заняты средней секции (3-4 промилле) обогащен молекулами сахара.

figure-results-1
Рисунок 1. Экспериментальный процесс. Во-первых, мы устанавливаем кресты для сбора мух желаемого генотипа (верхний ряд). Затем мы переходим девственницами до 29 ° C, чтобы активировать экспрессию гена, возраст их на 1, 10 и 20 дней, а флэш-заморозить их (второй ряд). Далее мы собираем замороженные главы использовании microsieve (третья строка). Головки лиофилизированный, земля, и лечение для извлечения РНК (четвертая строка) или метаболиты (нижний ряд).

figure-results-2
Рисунок 2. Выражение кинетики (A) Вестерн-блот показывает Atxn3-78Q выражении (Gal80 ТС; да-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). Мух инкубировали при 29 ° C от 0 до 72 часов. Слабая группа впервые обнаружен в 6 часов и насыщение достигается 48 часов после индукции. (B) иммунофлуоресценции целого мозга в той же мухи. Мозги были вскрыты, фиксированной,D окрашивают антитело, которое распознает расширенный белка polyQ. Этот белок обнаружен в теле гриба (MB) прогнозы и усиков долей (AL). Между 48 и 72 часов, выражение достигает максимального уровня и хорошо видна в мозговые центры, с обильной иннервации. Уровень экспрессии на нейрон является слабым, как видно в оптический доли (ПР), за исключением нескольких крупных нейронов между ПР и центрального мозга.

figure-results-3
Рисунок 3. Atxn3-78Q сокращает продолжительность жизни мух выражения LacZ, Atxn3-27Q, и Atxn3-78Q повсеместно во взрослой стадии (Gal80 ТС; да-Gal4). Наблюдали за их долговечность при 29 ° C. Мухи выражения LacZ (синий) и Atxn3-27Q (зеленый) показали низкий уровень смертности на 20-й день. В отличие от мух выражения Atxn3-78Q (красный) отображаетсявыраженной смертности, начиная с 10-й день. К 15-й день они показали 20% снижение жизнеспособности, которое ускорилось в течение следующих пяти дней, достигая 70% смертность на 20-й день.

figure-results-4
Рисунок 4. РНК оценки качества. РНК из высокое качество и деградированных образцов проводилось на чипе BioAnalyzer. (A) BioAnalyzer работать с высоким качеством РНК (образец 1) и деградированных РНК (образец 2) рядом с размером маркера (левая полоса). Обратите внимание на три резких пиков, соответствующих рибосомальной РНК в центральной полосе. (B) BioAnalyzer трассировки для образца № 1, с двумя характерными сильными пиками чуть ниже 2000 NT, а другая ниже 200. (C) BioAnalyzer трассировки для образца 2, который состоит в основном из деградированных РНК. Обратите внимание на разницу в единицах по оси ординат между панелями B и C.

figure-results-5
Рисунок 5. Представитель 1D спектров ЯМР полярных метаболитов. Представитель 1D протонного ЯМР-спектр полярных метаболитов из Drosophila и дополнительных 2D COSY (корреляционной спектроскопии) и HSQC (гетероядерных одной квантовой корреляции) экспериментов для пиковых назначения. Метаболиты определены в соответствии с известным химическим сдвигам-1: сахароза; 2: Глюкоза, 3: бета-аланин; 4: ацетат; 5: лактат.

Обсуждение

Опираясь на наш опыт в 11 транскриптомику, 12, метаболизм 15, и нейродегенеративные заболевания, 6, 8, приведем здесь новый протокол для сбора тысячи лету головы взрослой конкретное выражение патогенного гена и очистки мРНК и метаболитов для РНК- след и ЯМР-спектроскопии, соответственно. Характер этих экспериментов требует включения нескольких нововведениях до лету коллекции, в том числе выбор повсеместно Gal4 линии и использование временной регуляции экспрессии генов. Что касается Gal4, повсеместное выражение трансгенов было важно по двум причинам. Во-первых, большое количество генов, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, в том числе ATXN3, Huntingtin, белка-предшественника амилоида, и супероксиддисмутазы 1, среди прочих, широко экспрессируется в нейронах и глиальных клетках, а также в другие типы клеток за пределами нервной системы. Мы хотелиправильно смоделировать этот аспект биологии этих патогенных генов, анализируя последствия повсеместного выражение, а не сосредотачиваясь только на нейронные выражение. Во-вторых, это не представляется возможным собрать лету мозга в большом количестве, но мы можем сделать это с лету глав (более 200 в трех экземплярах за состояние) 11, 12. С гомогенизации смеси целые главы нервной и без нервных тканей, повсеместное выражение трансгена становится критическим для получения равномерного РНК и метаболитов из популяции клеток, экспрессирующих же трансгенов. Важно отметить, что да-Gal4 был выбран из-за его достаточно равномерное распределение, а не из-за его высокого уровня экспрессии, хотя в последнее докладе говорится, что да-Gal4 не может быть абсолютно повсеместно 25. Мы ранее рассмотрены и другие повсеместно Gal4 линий, в том числе рука, Тюб-и Закон-GA4, но все они показали сложные паттерны экспрессии во взрослой ЦНС и мышцы, делая их менееdequate для данного исследования. В самом деле, иммунофлюоресценции у взрослого мозга показали, что да-Gal4 вызывает широкое распространение, но слабые выражения, которые только накопленный на высоком уровне в мозговые центры, состоящей из нескольких тысяч аксонов и в нескольких крупных нейронов (рис. 2). Хотя уровни экспрессии конструкции были низкими, эти условия резко сократилось выживания в polyQ зависит от моды. Это выражение динамики выполнены нашими потребностями, сохраняя при этом выражение низкого уровня, что было важно для наблюдения за медленно, прогрессивная сотовая изменения индуцированных нейротоксических белков.

Предсказуемым следствием вызывая повсеместное выражение нейротоксических белков в том, что она вызвала летальность до вылета имаго. К счастью, это осложнение было обойти с помощью Gal80 TS. Как уже говорилось выше, экспрессия генов достигла максимального уровня примерно 48 часов после сдвига температуры, которая хорошо вписывается время FRAМне эксперимента. Еще одно преимущество использования Gal80 TS в том, что, в отличие от экспериментов, в которых нейротоксических белков конститутивно выразил пан-ЦНС, не было никакого выражения во время развития нервной системы. Таким образом, использование Gal80 TS создан "чистый" фона, на котором нервная система не подвергалась токсичных деятельности этих нейротоксических белков в чувствительных стадий развития. На наш взгляд, активации экспрессии гена у взрослых в результате лучшей моделью для этого класса взрослом возрасте патологии. Тем не менее, Gal80 TS также представила несколько осложнений, связанных с изменением температуры. Один из них был, что рост мух при низких температурах (18-20 ° C) задержали жизненного цикла, что делает эксперименты значительно больше. Кроме того, известно, что выращивание мух при высокой температуре (29-31 ° C) ускоряет их метаболизм, как показано на укороченный срок службы по сравнению с мухами возрасте при 25 ° C. Систь транскрипции и метаболические исследования будут проводиться в возрасте от мух при высокой температуре, мы можем ожидать увидеть важные изменения в клеточных путей стресс и энергетического обмена. Вот почему это было так важно ввести два элемента управления экспериментом, один с непатогенные Atnx3-27Q и связанных контроль выразив LacZ. Эти элементы управления будут обеспечивать основу для экспрессии генов и метаболических изменений, связанных с высокой температурой, так что мы можем идентифицировать эти изменения напрямую связаны с выражением токсичных Atxn3. В общем, мы внесли несколько изменений в коллекции мух, которые предоставляют множество преимуществ - и несколько недостатков (температура вопросов и следующий пункт) - для изучения взрослом возрасте, прогрессирующих заболеваний.

Несмотря на временное регулирование с Gal80 TS был полезным Кроме того, он также внес неожиданные осложнения. При генерации мух проведения как Gal80 TSой да-Gal4 конструкций в стабильной складе, мы заметили, что летает дважды гомозиготных по обе конструкции были жизнеспособными, но стерильно. С гомозиготных Gal80 ТС и да-Gal4 штаммы были жизнеспособными и плодородные сами по себе, не ясно, почему комбинация отображается низкой рождаемости. Это было известно в течение некоторого времени, что Gal4 немного токсичны для тканей Drosophila 22. Возможно, то, что гетерологичной экспрессии дрожжей транскрипционный репрессор Gal80 вклад в токсичность Gal4, вмешиваясь, возможно, с эндогенным транскрипционной машины. Это токсичности может быть усилено повсеместное распространение Gal4 под контролем да, ген, который играет ключевую роль в раннем развитии и сексуальной детерминации. Независимо от причины бесплодия, мы расширили Gal80 ТС; да-Gal4 мух, поддерживая балансировки хромосомы более-да-Gal4, сохраняя при этом хоmozygosity для Gal80 T S, предполагая, что Gal4 является более важным фактором бесплодия. Это решение было ключевым, потому что мы использовали сотни таких мужчин каждую неделю, чтобы пересечь с каждым из трансгенов БАС. Тем не менее, пересекает проведения балансировки созданы дополнительные работы при выборе соответствующего потомства. Только четверть (25%) потомства была собрана (женщины, не балансировки), который добавил выбора и снижает доходность за бутылку, и увеличить количество бутылок, необходимые для получения по меньшей мере 200 мух в генотипе / копировать / время точка. В целом, хотя коллекция мух стала много времени из-за больших наборов необходимости, мы уверены, что изучение клеточных изменений, только через несколько часов после включения выражение патогенного гена повсеместно будет идентифицировать новые и интересные процессы вовлечены в прогрессивную потерю нейронов.

После того, генетическая конструкция была на месте, мы уделили особое вниманиеэкспериментальных манипуляций, которые могли бы ввести биологической изменчивости. Во-первых, мы только собрали девственной женщины для обеспечения однородности образцов, хотя это означало, выбрасывая мужчин и проверка на потомство дважды в день. Во время старения, не более 12 мух были сохранены в том же флаконе, чтобы избежать перенаселенности и стресса. Кроме того, перед замораживанием, мухи были переданы криопробирки без анестезии и было разрешено, чтобы оправиться от передачи в течение 30 мин. Эти, казалось бы тривиальная факторы могут влиять на экспрессию генов и обмена веществ, представляя изменчивости в конечном счете, что бы не иметь отношение к эксперименту.

Для обеспечения качества замороженных материалов (глав, РНК и метаболитов), мы уделили особое внимание к каждой детали, которые могут способствовать деградации ткани. Так как мухи переносят в криопробирки в небольшом количестве (до 12 мух в одном флаконе), мы должны были получить много флаконов для сбора 200 голов. Эти манипуляции были годин с крайней осторожностью в холодном помещении с сухой лед и жидкий азот. Коллекция мух, отделение головы, и очистка информационные молекулы слишком много времени, чтобы обнаружить, что материал был деградировали в конце этого длительного процесса. В дополнение к обеспечению того, чтобы материал сохраняет свои качества, этот протокол описывает несколько шагов, чтобы максимизировать выход РНК и метаболитов, в т.ч. сублимационной сушки и шарика избиение. Эти шаги не требуется для нормальной экстракции для RT-PCR или количественный ПЦР из целого мух, но они имеют важное значение для последовательного очищения от небольших образцов, таких как мухи головы. Мы определили, что другие меры влияют на выход РНК. Например, пожилые мух производится значительно меньше, чем у более молодых РНК мух, независимо от генотипа. Это наблюдение предположил, что старение при высокой температуре вызывает серьезные изменения. Кроме того, извлечение РНК из 100 голов было на самом деле более эффективно, чем из 200 голов, так что мы приступили к очистке в двух бatches 100 в образце, только чтобы объединить их после проверки качества с BioAnalyzer. Кроме того, колонки для очистки мРНК, казалось, насытить легко, поэтому количество общей РНК использовали в колонке должна быть оптимизирована.

Метаболиты представляют собой разнородную смесь из малых молекул, поэтому контроль качества гораздо сложнее, чем с ДНК, РНК и белков. К сожалению, нет полного каталога метаболитов для любой модели животных в это время, то, что может измениться в ближайшие несколько лет, благодаря применению ряда технических новшеств, в том числе ЯМР-спектроскопии и расширенное использование жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии ( LC-MS). Несмотря на то, ЯМР менее чувствительна, чем MS, это показывает, что многие перспективные преимущества, в том числе не разрушения образцов, нет аналитических процедур, которые систематической ошибки (LC), и высокая воспроизводимость, что позволяет статистическое сравнение Репс и несколько экспериментальных условиях 24. Таким образом, выборка может бытьповторное тестирование для проверки замечания или повторно проанализированы LC-MS для проверки данных ЯМР. Здесь мы показали предварительные данные ЯМР от мух, которые мы используем, чтобы составить каталог метаболитов у дрозофилы. Эта информация будет иметь решающее значение для определения того, как выражение патогенного гена изменяет нормальный обмен веществ, открытие нового окна для дальнейшего понимания клеточных механизмов, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний.

Вновь возникающие ЭКОНОМИЧЕСКОЕ технологии предлагают лучшие возможности для изучения нейродегенеративных заболеваний на уровне детализации, которые ранее не были достигнуты. Возможно, самым большим препятствием на пути преодоления этих высокой пропускной исследований является верным коллекции воспроизводимые образцы, которые могут быть проанализированы с высокочувствительными методами. Процедуры представленные здесь предоставляют способ для достижения этой последовательности, и приведет к результатам, которые можно легко сравнить между наборами данных. Хотя наша основная научных интересов участвующих изучения изменений гена экспрессионов и метаболитов, мухи генерируется также может быть подвергнут протеомных или эпигеномном анализа. Proteomic и эпигеномном изменения, происходящие во время нейродегенерации также, вероятно, имеет первостепенное значение для процесса болезни. Когда научное сообщество в конечном счете, определяет полный спектр молекулярных изменений, влияющих на процесс болезни, истинный уровень систем понимания болезни будет невозможно. На этом уровне, иммуномодулирующим терапии, наконец, превратиться в реальность.

Раскрытие информации

Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарны Дженис Сантьяго, Габриэль Фигероа, и Хосе Эррера для оказания технической помощи и Блумингтон дрозофилы со центра при Университете Индианы на лету запасы. DH и CW были поддержаны за счет средств NSF-IOS-1051890. PF-F и БПРМ были поддержаны фондом возможностях семенной из Университета Флориды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент Компания Кат. Номер Комментарии
Джаз смесь Drosophila еды Fisher Scientific AS-153
Криогенная Флаконы Corning, Inc 430658
Микропробирок Axygen MCT-175-CS
RNaseZap Ambion AM9786 Относитесь ко всем поверхностям
5/32 "мелющие шары из нержавеющей стали OPS диагностики GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-бром-3-хлорпропана Сигма B9673-200ML
ISOPROpanol Fisher Scientific A416-500
DEPC обработанной воды Fisher Scientific BP561-1
ДНКазы I Promega M6101
RNasin ингибитора рибонуклеазы Promega N2111
RNeasy Мини комплект Qiagen 74104
Dynabeads очистки мРНК комплект Invitrogen 610-06
Конических труб Винт с головкой Fisher Scientific 02-681-344
Колпачки W / O-кольца Fisher Scientific 02-681-364
2,0 мм циркония бисера BioSpec продукты 11079124zx
Метанола, HPLC-класса Fisher Scientific A4524
Хлороформ, HPLC-класса Acros Organics AC39076
Акции Drosophila
да-Gal4 Блумингтон фондовый центр 5460
Gal80 [TS] Блумингтон фондовый центр 7108
UAS-MJD-27Q Блумингтон фондовый центр 8149
UAS-MJD-78Q Блумингтон фондовый центр 8150
UAS-LacZ Блумингтон фондовый центр 8529
Оборудование
Inject + МатIC Sleeper Инжект + MATIC
Microsieve Set Fisher Scientific 3410531 Используйте два крупных сетках
Geno / Grinder 2000 SPEX пробоподготовки SP2100-115
Sorvall Legend Микроцентрифуга ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2,5 л Каскад замораживания системы сухого Labconco 7670041
BioAnalyzer против 2,6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 123-21D
NanoDrop спектрофотометр ThermoScientific
Быстрый Prep шарик для взбивания ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

Ссылки

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507(2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361(2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Перепечатки и разрешения

Теги

Экстракция транскриптовочистка метаболитовсбор голов мухлиофилизация тканейизоляция РНКэкстракция хлороформоманализ на BioanalyzerЯМР-анализизмельчение тканей
Очистка стенограммы и метаболитов из
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.