Сотовые Co-культуре Создание массивов с использованием водных двухфазных системах

Краткое содержание

Водные двухфазных системах были использованы для одновременного картина несколько популяций клеток. Это быстрый и простой способ для сотовых паттерна использует преимущества фазового разделения водных растворов декстрана и полиэтиленгликоля и поверхностное натяжение, которое существует между двумя растворов полимеров.

Аннотация

Сотовые паттерна технологий, которые являются быстрый, легкий в использовании и доступным будут необходимы для дальнейшего развития высокой пропускной способности ячейки анализы, платформы для изучения межклеточных взаимодействий и тканей инженерных систем. Это подробный протокол описывает метод для создания совместных культурах клеток с использованием биосовместимых решения декстрана (DEX) и полиэтиленгликоля (PEG), что поэтапный отдельные сочетании выше пороговых концентраций. Клетки могут быть узорными в различных конфигурациях, используя этот метод. Структурирование сотовых исключение может быть выполнена путем печати каплями DEX на подложке и покрывая их решения PEG, содержащий клетки. Поверхностного натяжения образуется между двумя растворов полимеров заставляет клетки падают вокруг внешней капли DEX и образуют круговую очистки, которые могут быть использованы для миграции анализов. Сотовые острова могут быть узорными по выдачи ячейки богатых DEX фазы в раствор ПЭГ или путем покрытия DEXкапли с раствором ПЭГ. Co-культур может быть сформирована непосредственно путем объединения ячейки исключения с структурирование DEX острова. Эти методы являются совместимыми с различными подходами обработки жидких, в том числе руководство micropipetting, и может быть использован практически с любым приверженцем типа клеток.

Введение

Водные двухфазные системы (ATPSs) форме, когда решения двух несовместимых полимеров смешиваются при достаточно высоких концентрациях. Разделение фаз зависит от целого ряда факторов, которые включают молекулярный вес и полярности полимеры, температура решений, рН и ионной содержание водного растворителя ^{1, 2.} Точка, в которой два полимерных растворов отдельные определяется физико-химическими свойствами выбранных фаз системы, но обычно происходит при низких концентрациях полимера (менее 20% вес / вес) в неденатурирующих условия, позволяющие ATPSs, которые будут использоваться для биотехнологии приложениям ^3-9.

До сих пор наиболее широко изучены ATPS является полиэтиленгликоля (ПЭГ) / декстран (DEX) системы. ATPS, образованных этими недорогими и биосовместимых полимеров был впервые описан для очистки биомолекул путем молекулярного разбиение ^{2, 10.} Разметкапроисходит, когда дополнительные молекулы или частицы, которые не способствуют фазная система смешивают с ПЭГ и DEX. На основе их относительного сходства либо DEX или PEG, молекул или частиц будет преимущественно находиться в одном из двух фаз или в интерфейсе. Еще одно свойство PEG / DEX ATPS является наличие поверхностного натяжения между двумя фазами полимера. ATPSs образована PEG и DEX обычно проявляют поверхностного натяжения, что значительно ниже, чем у других жидкостей двухфазных систем, таких как масло и вода, однако, поверхностное натяжение силы все еще ​​оказывают влияние на мелкие частицы, такие как вирусы, клетки и белковых агрегатов ^{2 , 11-13.} Наконец, с более высокой молекулярной массой ПЭГ и DEX отдельной при низких концентрациях (менее 5% вес / вес для высокого молекулярного веса полимеров сортов) в присутствии физиологических концентраций солей, есть мало, если вообще вредное воздействие на клетки млекопитающих включены в эти системы^14-16.

В последнее время межфазных свойств и разделения эффектов ATPSs были применены нашей лаборатории для сотовых паттерна ^{14, 16-20.} Это было достигнуто путем micropatterning решение плотнее DEX на подложках культуре клеток в присутствии ПЭГ. Когда клетки встраиваются в фазу PEG, они исключаются из входящих DEX капель в связи с PEG / DEX поверхностное натяжение ^20. Когда клетки образцу в фазе DEX, они сохраняются на поверхности подложки культуре клеток поверхностного натяжения и перегородки ^{16, 17, 19.}

В отличие от других методов для сотовых рисунка, ATPS ячейки паттерна проста в освоении и требует лишь элементарные знания о полимерах себя, и способность выполнять культуре клеток и использовать микропипетки. Другие методы для сотовых паттерна часто включают в себя специализированное оборудование и обучение, которые не легко переводятся в гоэлектронной науках о жизни. Например, некоторые методы (микроконтактной печати или печати на струйных принтерах) образец клеток косвенным путем применения модели биомолекулы клетки клея на подложку культуры, которые впоследствии служат в качестве объектов для прикрепления клеток ^{21, 22.} Хотя косвенные подходы полезны для некоторых типов клеток, они требуют высокого уровня квалификации пользователя и специализированного оборудования для изготовления паттерна инструмент, и может не хватать специфику в зависимости от конкретного типа клеток / биомолекулы шаблону. Кроме того, клетки могут быть нанесены с высокой специфичностью картина путем прямого подхода паттернов, которые включают ламинарного потока рисунка, трафарету и струйной печати ^23-26. Однако, эти методы также требуют опыта пользователя и специализированного оборудования, и может привести к повреждению клеток во время процесса печати. Хотя эти подходы обычно производят точные модели клетки, клетки рисунок, чтобы быть полезным инструментом в науках о жизни, оно должно быть экономически эффективнымя прост в реализации.

Здесь мы приводим подробный протокол для создания узорной использованием клеточных культур ATPSs описаны в наших ранее опубликованных приложений. Используя только micropipettors, пользователи могут создавать ячейки запретных зон или сотовый островов для миграции анализов. Это достигается путем PEG / DEX поверхностное натяжение, что либо сохраняет клетки в фазе DEX или исключает клетки на хранение в PEG фазы от DEX. По расчесывание этих двух основных методов структурирования, можно быстро генерировать совместных культурах клеток, таких как печень фибробластов со-культуры. Создание массивов методами, ATPS параметры и ожидаемые результаты описаны в деталях.

Протокол

1. Фазная система Характеристика: Определение пороговых значений для разделения фаз

1. Подготовка растворов, содержащих ПЭГ и DEX в нужную ячейку буфера или культуральной среде, как показано на рисунке 1 (фиолетовые точки) в 15 мл или 50 мл конические пробирки. Далее, PEG и DEX будет относиться к 35 PEG кДа и 500 кДа DEX, однако, критическая концентрация будет меняться в зависимости от двух полимеров. Запись массы ПЭГ и DEX в каждом решении. Высокие концентрации растворов полимеров может занять несколько часов, чтобы раствориться. Встряхивания может быть использован для бессывороточной решений. Для сред, содержащих белки или сыворотку, поместите труб на этапе качалки, пока оба полимеров полного растворения. Запишите вес носителя, используемый для растворения полимеров и принять к сведению начальных концентрациях.
2. После того, полимеры полностью растворяется, решения должны появиться облачность. Это первый признак того, что фазовое разделение произошло. Чтобы убедиться в этом, позволяющиеполимерные растворы, чтобы отдохнуть в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 20 мин. Центрифугированием при 1000 XG может быть использован для ускорения процесса разделения фаз. Фазой плотной нижней будет DEX-богатых и верхней фазы будет PEG-богатых.
3. Медленно добавить дополнительный буфер или средств массовой информации труб. Малый шаг должен быть использован, чтобы не промахиваться точки фазового разделения.
4. Когда раствор станет прозрачным и не поэтапный отделяется после центрифугирования, порог для разделения фаз была достигнута. Запишите окончательный вес трубки.
5. Используя предыдущие записанные весов для полимеров, наряду с конечной массы после добавления средства массовой информации, определить вес% / вес каждого из двух полимеров, при котором разделение фаз не возникает.
6. Сюжет этих значений в% вес / вес PEG на оси у и% вес / вес DEX на оси х. Этот участок, известный как бинодальной кривой, может быть использована для определения пороговой концентрации для разделения фаз для различных concentratiДополнения ПЭГ / DEX в определенной среде для культивирования клеток.

2. Конфигурация 1: Исключение Создание массивов (96-а Формат плиты)

1. Подготовка отдельных растворов 5,0% вес / вес PEG и 12,8% вес / вес DEX в клеточной среде культуры. Используйте ATPS решения, по крайней мере в два раза критической точки, чтобы ATPS остается после полимеров равновесия по отношению друг к другу. Существует небольшое количество потоков DEX в PEG-фазы, обогащенной и наоборот, поэтому, работая слишком близко к критической концентрации может привести к потере фазовой системы, как концентрация падает ниже критической точки. Кроме того, передача блюдо клеточной культуры для влажности и температуры контролируемой инкубатор может изменить двухфазной свойства и сделать два решения смешивается. Примечание: некоторые клетки могут работать лучше с другими составами ATPS. Приемлемые композиции могут быть выбраны на основе бинодали кривых определяется из части 1.
2. Урожай клетки, которые будут использоваться для исключения Patterning. Определите общее количество / концентрация клеток в наличии. Дополнительно: маркировать клетки с CellTracker или других не-цитотоксических этикетки для флуоресцентной микроскопии.
3. Осаждения клеток и ресуспендируют осадок в соответствующем объеме 5,0% PEG для достижения желаемого количества клеток для исключения. Например, в одной из лунок 96-луночный планшет требуется 37500 фибробластов быть суспендируют в 200 мкл PEG производить слияние на следующий день. Масштаб этих цифр по мере необходимости для других типов клеток и размеров культуры субстрата.
4. С помощью микропипетки, не прибегает 0,5 мкл капли DEX на сухой субстрат для культивирования клеток. Увеличенная капли объемом производить большие зоны отчуждения. Капли размером от 0,1 до 1 мкл рекомендуется для исключения micropatterning. Дополнительно: DEX капли могут быть нанесены 24 часов впереди времени и позволила обезвоживают при комнатной температуре. Это может привести чистых моделей.
5. Внесите 200 мкл клеточной суспензии PEG в тОн также чтобы покрыть DEX капель.
6. Место в увлажненном инкубаторе в течение 12 ч при 37 ° C, 5% CO _2. Убедитесь, что антенна не наклонена в процессе обработки и что она находится на уровне полка инкубатор, чтобы избежать нарушения узоры.
7. Снимите PEG раствор и вымыть три раза с 200 мкл культуральной среды.
8. Добавить свежую питательную среду и возвращение в инкубаторе.
9. Мониторинг культур периодически наблюдать клеточного движения в зоне отчуждения.

3. Конфигурация 2: Остров Создание массивов (96-луночный планшет формата)

1. Подготовка решений 5,0% вес / вес PEG и 12,8% вес / вес DEX в культуре клеток среду, как указано выше.
2. Урожай клетки будут использоваться для острова паттерна. Определите общее количество / концентрация клеток в наличии.
3. Гранул и ресуспендируют клеток в соответствующем объеме на 12,8%, DEX, чтобы достичь желаемой концентрации клеток для формирования паттерна острова. Концентрации в 5000 CEООО / мкл или менее рекомендуется для высокой адгезией типов клеток. Для ячеек, которые имеют трудности присоединения или клетки, которые свободно придерживаться, концентрации до 10000 клеток / мкл может быть рассмотрен.
4. Рабочие быстро, чтобы избежать высыхания, пипетка 0,5 мкл капли DEX на сухом субстрате культуры клеток, как описано выше. Не допускайте капель, чтобы высохнуть. Дополнительно: 200 мкл раствора ПЭГ могут быть добавлены к заблаговременно. DEX капли могут быть депонированы в раствор PEG, где они будут опускаться на дно и связаться с культурой поверхности. Это может привести к чистой модели острове.
5. Накройте DEX капли с 200 мкл PEG.
6. Место в увлажненном инкубаторе в течение 12 ч при 37 ° C, 5% CO _2. Убедитесь, что антенна не наклонена в процессе обработки и что она находится на уровне полка инкубатор, чтобы избежать нарушения узоры.
7. Снимите PEG раствор и вымыть три раза с 200 мкл культуральной среды.
8. Добавить свежую культурусредних и возвращение в инкубаторе.
9. Мониторинг культур периодически наблюдать движение и пролиферации клеток наружу из островов.

4. Конфигурация 3: Исключение со-культур (96-луночный планшет формата)

1. Подготовка решений 5,0% вес / вес PEG и 12,8% вес / вес DEX в культуре клеток среду, как указано выше.
2. Урожай клетки будут использоваться для изоляции и остров паттерна. Определите общее количество / концентрация клеток доступные для каждого типа клеток. Дополнительно: Некоторые сотовые пары может появиться совершенно разные показатели распространения. Для предотвращения исключено клетки от overpopulating острова узорной клеток (особенно для долгосрочных культурах), относитесь клетки, используемые для исключения митомицином С в течение 2 часов или облучить их до уборки урожая. Это позволит предотвратить распространение. Флуоресцентные красители CellTracker могут быть использованы для различать две популяции клеток в случае необходимости.
3. Осаждения клеток и ресуспендируют осадок для exclusioп паттерна в соответствующем объеме 5,0% PEG для достижения желаемого количества клеток, как указано выше. Ресуспендируют гранулы для формирования паттерна острове в соответствующем объеме 12,8% DEX для достижения желаемой концентрации клеток, как указано выше.
4. С помощью микропипетки, не прибегает 0,5 мкл капли суспензии клеток DEX на сухой субстрат для культивирования клеток. Не допускайте капель, чтобы высохнуть.
5. Накройте DEX капли с 200 мкл клеточной суспензии PEG.
6. Место в увлажненном инкубаторе в течение 12 ч при 37 ° C, 5% CO _2. Убедитесь, что антенна не наклонена в процессе обработки и что она находится на уровне полка инкубатор, чтобы избежать нарушения узоры.
7. Снимите PEG решения и мыть три раза в 200 мкл культуральной среды.
8. Добавить свежую питательную среду и возвращение в инкубаторе.
9. Контроль за со-культур наблюдать взаимодействие клеточных популяций. Дополнительно: Элементы управления могут быть получены путем проведения исключения или острова паттерна индивидуумыidually, путем совместного культуре клеток, которые не взаимодействуют или путем блокирования путей интерес в одной или обеих популяций клеток до и после рисунка.

Результаты

Чтобы выбрать соответствующую комбинацию ПЭГ и DEX для сотовых паттерна важно для определения бинодали кривой. Эта кривая очерчивает точки, в которых ATPS могут образовываться и может варьироваться для данного набора полимеров в зависимости от температуры, рН и ионного состава. Для культивирования клеток, которые требуют настроены составы средних может быть необходимым, чтобы экспериментально определить бинодали кривой. Это достигается путем создания ряда ATPSs, которые далеки от бинодали и различного в их PEG и DEX сод...

Обсуждение

Micropatterning ATPS ячейки метод требует очень мало знаний, помимо знания методов культуры клеток и могут быть быстро освоены. Преимущества этого подхода в том, что он является недорогим, быстрым и совместимы с различными типами клеток и культуры форматов. По этим причинам, наш протокол должен быть легко принята жизни ученых, особенно тех, кто изучает клеточную пролиферацию, миграцию и хемотаксис, и влияние juxtacrine и паракринной взаимодействия между клеточной популяции. Анализы, представленные здесь может быть легко...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	Производитель
Декстран 500000 кДа	Pharmacosmos, Дания
Полиэтиленгликоль 35000 кДа	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури
Hela	АТСС, Manassas, VA
HepG2 C3A	АТСС, Manassas, VA
NIH 3T3	АТСС, Manassas, VA
Сотовые Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Плод бычьего сывороточного	Gibco, Carlsbad, CA