Нецелевые метаболомика предоставляет гипотезы генерации снимок метаболический профиль. Этот протокол будет продемонстрировать выделения и анализа метаболитов из клетки, сыворотка, или ткани. Целый ряд метаболитов опрошенных с использованием жидкостной экстракции жидкой фазы, микропотока UltraPerformance жидкостной хроматографии / высокое разрешение масс-спектрометрии (UPLC-HRMS), соединенный с дифференциальным программного обеспечения для анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы представляем рабочий процесс для анализа метаболических профилей для биологических образцов, представляющих интерес, включая, клетки, сыворотка, или ткани. Образец сначала разделяют на полярных и неполярных фракций путем жидкостно-жидкостной экстракции, и частично очищенный для облегчения ниже анализа. Обе водные (полярные метаболиты) и органические (неполярные метаболитов) фазы первоначальной экстракции обрабатываются для обследования широкого спектра метаболитов. Метаболиты отделены друг от различных методов жидкостной хроматографии на основе их свойств раздела. В этом методе, приведем микропотоке ультра-производительность (UP) LC методы, но протокол является масштабируемой более высоких потоков и низком давлении. Введение в масс-спектрометр может быть достигнуто путем общего или соединение оптимизированных условиях источника. Обнаружение широкого спектра ионов осуществляется в режиме полного сканирования как положительные, так и отрицательные режиме в широком м / з диапазон при высоком разрешении на недавно Calibrated инструмента. Без наклеек дифференциальный анализ осуществляется на платформах биоинформатики. Применение этого подхода включают метаболические пути скрининга, биомаркеров и разработки лекарственных препаратов.
Введение
В связи с последними технологическими достижениями в области HRMS, нецелевого, гипотезу генерирующих метаболомика подходы стали осуществимый подход к анализу сложных образцов. 1 Масс-спектрометры, способные 100000 резолюцию облегчения рутинной нижней части на миллион (промилле) масса точности стали широко доступны от различных поставщиков. 2,3 Эта масса точность позволяет более конкретно и уверенность в проведении предварительных работ анализируемого идентичности, изотопного распознавания образов, и аддукт идентификации. 4 В сочетании с соответствующей процедурой добычи и высокопроизводительных LC или UPLC, сложных смесей могут быть п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экстракции образцов из клеток
- Для 10 см пластины клеток: собирают 1,5 мл клеточной суспензии поднимается в средствах массовой информации в предварительно меченных 10 мл центрифужную пробирку стекла. Для прилипшие линии, клетки должны быть сняты с нежным соскоб в 1,5 мл среды выдерживали на льду Необязательно. Если внутренний используются стандарты, добавляют соответствующие аликвоты на этом шаге.
Комментарий: Тушение клеточный метаболизм имеет решающее значение для определенных метаболитов. Для анализа срочных метаболиты, такие процедуры, как холодного отжима метанола должны быть рассмотрены. 17 - Добавить 6 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Приведенные результаты показывают, выбранные данные из 6-часового лечения SH-SY5Y клеток глиобластомы с пестицидами и митохондриального комплекса I ингибитор ротенон. Для краткости только органическую фазу положительные данные режима представлен. Образцы были обработаны и проанализированы, как описано выше (рис. 1, таблица 1, таблица 2) и наносили на двух платформах дифференциального анализа для наклеек количественное, сито и Xcms онлайн. Несмотря на большое количество хитов (рис. 2, рисунок 3)<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нецелевые метаболомика предлагает мощный инструмент для исследования или эндогенных ксенобиотиков биотрансформациях, или захвата метаболический профиль из образца интерес. Выход техники весы с разрешением и чувствительностью от технологии, используемой для разделения и анализа образца, способность иметь дело с большими наборами данных генерируется, а также возможность добывать набора данных за полезную информацию (например, поиска по базе данных точной массы). В последнее время это была облегчена благодаря прог.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы признаем поддержке грантов NIH P30ES013508 и 5T32GM008076. Мы также благодарим Thermo Scientific для доступа к SIEVE 2.0 и доктора. Евгений Ciccimaro и Марк Сандерс Thermo Scientific за полезные обсуждения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>реагент | |||
| фосфатный буферный физиологический раствор | Mediatech | 21-031-CM | |
| Вода (H2O) | Fisher | Scientific W7-4 | (optima) |
| Ацетонитрил (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Метанол (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Изопропанол | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Хлороформ (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | опасности |
| Дихлорметан (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | Для замены хлороформа |
| Диэтиловый эфир | Sigma-Aldrich | 346136 | Для замены хлороформа |
| муравьиной кислоты (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Формиат аммония (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Пипетки | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Стеклянные центрифужные пробирки 10 мл | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Пластиковые центрифужные пробирки 10 мл | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC флаконы (стеклянные) | Воды | 60000751CV | |
| LC Вкладыши (стеклянные) | Воды | WAT094171 | |
| LC флаконы (пластиковые) | Воды | ||
| 0,22 m Фильтры | Corning | 8169 | нейлон |
| 2 мл Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| Масс-спектрометр высокого разрешения | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Передовое | |
| Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | ||
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Воды | 186003546 | 1.7 μ размер частиц m, 150 мм x 100 μ m |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μ размер частиц мкм, 15 см х 200 мкм; м |
Ссылки
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
