Методическая статья

Поколение новой дендритно-клеточной вакцины с использованием меланомы и плоскоклеточных раковых стволовых клеток

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50561

⸱

6 января 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Оцененная в сингенетических иммунокомпетентных хозяев, рак стволовых клеток (CSC) на основе дендритных клеток (DC) вакцина продемонстрировала значительно более высокий противоопухольный иммунитет, чем традиционные вакцины DC пульсировал с неоднородными навалом опухолевых клеток.

Аннотация

Мы определили раковые стволовые клетки (CSC)-обогащенные популяции от муриной меланомы D5 syngeneic до C57BL/6 мышей и плоскоклеточного рака SCC7 syngeneic к C3H мышей с использованием ALDEFLUOR/ALDH в качестве маркера, и проверили их иммуногенность, используя лизат клеток в качестве источника антигенов для пульса дендритических клеток (DCs). DCs пульсировал сALDH высокой CSC лизатов индуцированных значительно выше защитный противоопухольсийный иммунитет, чем ДК пульсировал с лизатами несортированных целых опухолевых клеток лизатов в обеих моделях и в легких метастазы настройки и s.c. настройки роста опухоли, соответственно. Это явление было связано с CSC вакцины индуцированной гуморальной, а также клеточных анти-CSC ответов. В частности, спеноциты, изолированные от хозяина, подвергаемого вакцине CSC-DC, производят значительно большее количество вакцины ИФНЗ и ГМ-CSF, чем спеноциты, изолированные от хозяина, подвергаемого несортированной опухолевой клетке лизат импульсной вакцины DC. Эти результаты поддерживают усилия по разработке аутологичной терапевтической вакцины на основе CSC для клинического использования в адъювантной обстановке.

Введение

Раковые стволовые клетки относительно устойчивы к обычной химиотерапии илучевой терапии 1,2. С другой стороны, эта популяция клеток может быть клетки, ответственные за рецидив и прогрессирование рака после традиционнойтерапии рака 1-4. Из-за отсутствия выражения дифференцированных опухолевых антигенов на раковых стволовых клетках, раковые стволовые клетки могут избежать текущих иммунологических вмешательств терапии рака, которые в основном предназначены для целевой антигенов на дифференцированных опухолевых клеток. Таким образом, разработка новых стратегий, конкретно ориентированных и уничтожение раковых стволовых клеток может провести обещания по повышению терапевтической эффективности текущего лечения рака. С этой целью мы выделили раковые стволовые клетки (CSC) обогащенные популяции из двух опухолей животных (меланома D5 и плоскоклеточный рак SCC7), и использовали их в качестве источника антигена для импульсных антигенных клеток (дендритных клеток, DC) для подготовки вакцины CSC-TPDC. Затем мы оценили противоопухольный иммунитет, вызванный вакциной CSC-TPDC, в сингенных иммунокомпетентных организмах, мышах B6 и C3H соответственно. CSC-TPDC индуцированной противоопухолятельной эффективности был по сравнению с традиционной вакциной DC пульсировал с лизатом из несортированных неоднородных опухолевых клеток (H-TPDC), который ранее был использованнашей группой 5,6, а такжедругими следователями 7 как в доклинических исследованиях и в клинических испытаниях.

Протокол

1. АЛДЕФТОР Окрашивание

  1. Подготовка образца клетки: Подготовка одноклеточной суспензии опухолевых клеток, либо из культурных опухолевых клеток, либо из свежесобранной опухолевых образцов. Подсчитайте клетки и отрегулируйте подвес клетки к концентрации 1 x 106 клеток/мл в буфере анализа ALDEFLUOR.
  2. Этикетка четыре 12 мм х 75 мм полистирол пробирки в качестве контрольных труб следующим образом: #1: Unstained, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR плюс DEAB, и #4: 7AAD.
  3. Для этих контрольных труб, место 1 мл клеточной подвески в #1 и #4, но 2 мл в трубку #2. Добавьте 5 МКЛ DEAB (ингибитор ALDH) в трубчатые #3 и держите на льду. Затем добавьте 10 мкл активированного субстрата ALDEFLUOR в трубку #2, перемешайте и немедленно перенесите 1 мл смеси в трубчатую #3.
  4. В то же время, добавить 2 мкл активированных ALDEFLUOR субстрат на миллион клеток для остальных клеток (образцы труб) также на 1 х 106 клеток / мл в ALDEFLUOR Анализ буфера.
  5. Инкубировать как 4 контрольных труб и пробных труб в течение 30 мин в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
  6. После инкубации добавьте 5 мкл 7AAD в контрольную трубку #4, и 1 мкл 7AAD 1 х 106 клеток в образец трубки. Инкубация 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  7. Центрифуга все трубки в течение 5 мин при 250 х г и удалить супернатант.
  8. Повторное приостановление ячеек в ALDEFLUOR Assay Buffer.
  9. Выполняем сортировку на основе цитометрии потока.
  10. Установите ворота сортировки с использованием ALDEFLUOR-окрашенных клеток, обработанных DEAB как отрицательный контроль и йодидный пропидий (PI) 7AAD- окрашенные клетки для контроля жизнеспособности. На основе этих элементов управления были установлены ворота для различения ячеек ALDEFLUOR/ALDH высокой, D5 и SCC7. Эти ворота будут затем использоваться для сортировки всех образцов ячеек, подготовленных выше для ALDEFLUOR/ALDHвысоких D5 и SCC7 клеток.

2. Подготовка рака стволовых клеток лизировать-пульс Дендритической клетки (CSC-TPDC) Вакцина

  1. Эвтанизируйте мышей (сингенеические B6 и C3H, соответственно) с использованием CO2 и изолируйте кости бедренной кости и голени.
  2. Положите кости в 75% этанола в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем мыть кости с помощью HBSS.
  3. Отрежьте голову кости и используйте 21 G иглы и 10 мл шприца, чтобы подтолкнуть клетки в блюдо.
  4. Аспирировать и взорвать клетки с помощью шприца, чтобы сделать одноклеточную подвеску.
  5. После центрифугации в 1500 об/мин в течение 5 минут, отбросить супернатант. Затем добавьте 5 мл буфера лиза РБК в лиз РБК в течение 1 мин в водяной бане 37 градусов по Цельсию.
  6. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте подвесную клетку до концентрации 1 миллиона клеток/мл в полной среде (CM), содержащей 10 нг/мл GM-CSF и 10 нг/мл IL-4.
  7. Культура клеток и компенсировать CM плюс IL-4 и GM-CSF 3 дня спустя.
  8. На5-й день, урожай незрелых дендритных клеток (DCs) и подготовить DC изоляции среды, содержащей 4,2 мл раствора C плюс 1 мл OptiPrep плотность градиента среды.
  9. Приостановить ячейки гранулы в 5 мл CM. Добавить подвеску клетки на изоляцию среды медленно. Центрифуга при температуре 2000 об/мин при комнатной температуре.
  10. Соберите DCs между CM и изоляционные среды. Подсчитайте номер клетки и отрегулируйте подвеску клетки к концентрации 1 миллиона клеток/мл в среде культуры содержа 10 ng/ml GM-CSF и 10 ng/ml IL-4.
  11. Подготовка опухолевых лизатов путем приостановки ALDHвысокой или несортированной D5 или SCC7 клеток в среде культуры и при условии быстрого замораживания оттепели воздействия четыре раза с последующим спина на ∼ 100 х г в течение 5 мин для сбора мембранной части лизатов.
  12. Для подготовки CSC-TPDC, импульсные DCs с лизатом аутологичной ALDH высокихклеток. Для подготовки H-TPDC, импульсные DCs с несортированной неоднородной лизации опухолевых клеток. Соотношение DC к ликату опухолевых клеток то же самое.

3. Вакцинация и оценка эффективности

  1. Вакцинировать нормальных мышей B6 соответственно с 2500 D5 CSC-TPDC или D5 H-TPDC опухолевых клетокподкожно ( s.c.). Вакцинировать нормальных животных C3H s.c. с 5000 SCC7 CSC-TPDC или SCC7 H-TPDC опухолевых клеток, соответственно.
  2. После вакцинации, вызов B6 мышей с неоднородными опухолевыми клетками D5 i.v. Euthanizeмышей с использованием CO 2 20 дней спустя. Урожай легких и перечислить метастазы легких.
  3. В модели SCC7, вызов C3H мышей с несортированной SCC7 опухолевых клеток s.c на противоположной стороне вакцины DC. Мониторинг размера опухоли.
  4. В конце экспериментов усытворяют мышей B6 и C3H с использованием CO2. На 34-й день после первой вакцины, усыпнять мышей с CO2, и в то же время собирать селезенки каждой группы с асептической процедурой.
  5. Активировать селезенку Т и/или В-клеток с обездвиженным анти-CD3 плюс анти-CD28 mAbs в CM, содержащих hrIL-2 или LPS плюс анти-CD40 (FGK45) mAb ascites.
  6. После активации собирайте супернатанты и используйте для анализа ELISA.
  7. Для анализа ELISA пластины пальто с антителами к ИФНЗ, ГМ-CSF и IgG при 4 градусах по Цельсию.
  8. После применения блокирующего буфера добавьте образцы и стандарты и инкубировать при комнатной температуре.
  9. Вымойте пластину и добавить антитела обнаружения HRP и TMB субстрат для инкубации.
  10. Измерьте абсорбанс на считыватель пластины ELISA на 450 нм в течение 30 минут после остановки реакции.

Результаты

ALDEFLUOR/ALDH был использован в качестве единого маркера для изоляции стволовых клеток в нескольких злокачественныхновообразований 8-11. Мы определили популяции раковых стволовых клеток в двух опухолевых моделях D5 и SCC7, используя ALDEFLUOR в качестве маркера. Мы обнаружили клетки ALDEFLUOR в муриновой меланоме B16-D5 и плоскоклеточном раке SCC7. Мы обнаружили, что клетки ALDEFLUOR способствуют примерно 0,5% и 5,2% в культурных линиях опухолевых клеток D5 и SCC7,соответственно (рисунок 1). Свежесобранные опухолевые клетки из установленных опухолей были проанализированы, чтобы подтвердить существование клеток ALDEFLUOR. Как также показано на рисунке 1, было 2,5% и 4,2% клеток ALDEFLUOR из in vivo созданы D5 и SCC7 опухолей, соответственно. Опухолевые и самообъемляемость этих отсортированы D5 и SCC7 ALDEFLUOR/ALDH высоких популяций были оценены в сингенеических иммунокомпетентных хост, C57BL/6 и C3H мышей,соответственно 8.

Мы использовали неоднородные несортированные опухолевые клетки лизировать импульсных DCs (H-TPDC) как в исследованиях на животных и вклинических испытаниях 5,6. Для изучения иммуногенности CSCs, мы выделили ALDH высокой CSC и импульсный DC с лизатом CSCs для генерируемых CSC-TPDC ( Рисунок2) и использовали H-TPDC в качестве обычного контроля вакцины против рака, чтобы проверить, если CSC-TPDC имеет какое-либо благотворное влияние в предотвращении роста опухоли.

Мы оценили иммуногенность КСК, изучив защитный противоопухотьный иммунитет, вызванный CSC-TPDC. В модели D5 наивные иммунокомпетентные мыши были вакцинированы с.c с CSC-TPDC или H-TPDC (при том же лизате: коэффициент DC). Контрольные группы получили солевой раствор (PBS). Через неделю после последней вакцины, мышей были оспорены с несортированной D5 опухолевых клеток внутривенно(i.v.),и легкие были собраны 3 недели спустя, чтобы перечислить метастазы легких. Как показано в таблице 1, по сравнению с группой PBS, мышей, обработанных H-TPDC разработали меньше метастазов легких. Важно отметить, что мыши, обработанные CSC-TPDC, имели значительно меньше метастазов в легких, чем группа вакцин H-TPDC в обоих экспериментах. В модели SCC7, нормальные животные C3H были вакцинированы s.c с SCC7 CSC-TPDC или H-TPDC соответственно на правом фланге, после чего бросая вызов с несортированной SCC7 опухолевых клеток s.c в левый фланг. По сравнению с группой PBS, H-TPDC индуцированных скромный противоопухоло опухолевой иммунитет против роста опухоли. Тем не менее, было значительное ингибирование роста опухоли у мышей, которые лечились cSC-TPDC по сравнению с контрольной группой и группой H-TPDC (p<0.05, Рисунок 3). Эти результаты показывают, что CSCs могут быть использованы в качестве более эффективного источника антигена для загрузки DCs, чем традиционные несортированные опухолевые клетки в индуцировании защитного иммунитета против проблемы опухолевых клеток.

Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе наблюдаемого CSC-индуцированного защитного противоопухольного иммунитета, мы собрали селезенки от животных, подвергающихся прививкам от постоянного тока в конце экспериментов. Клетки селезенки были затем активированы анти-CD3/CD28/IL-2 или анти-CD3/CD28/IL-2 и LPS/anti-CD40. Затем были собраны культурные супернатанты для выявления экспрессии цитокинов и антител.  Значительно более высокие производства ИФНЗ и ГМ-CSF клетками селезенки от животных, вакцинированных D5 CSC-TPDC или SCC7 CSC-TPDC(рисунок 4). Кроме того, было значительно (р<0,05) выше IgG производства LPS/anti-CD40 активированных клеток селезенки, собранных из животных, вакцинированных с D5 CSC-TPDC или SCC7 CSC-TPDC по сравнению с D5 H-TPDC или SCC7 H-TPDC. Эти антитела были найдены, чтобы связать с D5 и SCC7 CSCs соответственно, и такая привязка может привести к лизу CSC в присутствиидополнения 8.

figure-results-1
Рисунок 1. Высокие популяции ALDHFLUOR/ALDH были обнаружены в культурных, а также недавно собранных свежих меланомы мурина D5 и SCC7 плоскоклеточных опухолей. Опухолевые клетки, обработанные 50 ммоль/Л DEAB, специфический ингибитор ALDH, были использованы в качестве отрицательного контроля. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

figure-results-2
Рисунок 2. Поколение дендритных клеточных вакцин против рака стволовых клеток. Для подготовки CSC-TPDC и H-TPDC, дендритные клетки костного мозга были импульсными с ALDH высокой или несортированной лизатами опухолевых клеток, соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

figure-results-3
Рисунок 3. Вакцина CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) может вызвать более эффективный защитный противоопухоотьный иммунитет в .c. Модель опухоли SCC7. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

figure-results-4
Рисунок 4. Более мощные системные клеточные реакции при иммунокомпетентном хосте, вакцинированном CSC-TPDC.  Спеноциты были собраны у животных, подвергаемых вакцинации H-TPDC или CSC-TPDC, и были активированы, как указано. Затем для обнаружения цитокинов с помощью ELISA были собраны культурные супернатанты. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера. 

Обсуждение

Иммунокомпромиссные хозяева, такие как мыши SCID, исключают иммунологические оценки ККС из-за отсутствия адаптивного иммунитета у хозяев. В этом исследовании мы оценили иммуногенность КСК в иммунокомпетентных хозяев, которые могли бы более тесно имитировать настройки пациента. Обогащенные ККС являются иммуногенными и могут вызвать более эффективный защитный иммунитет опухоли, когда их лизаты загружаются в ДК в качестве вакцины по сравнению с невыбранными опухолевыми клетками лизат-пульсом ДК.  Механистически, защита была предоставлена путем селективной индукции CSC-реактивных антител иТ-клеток 8, а также производство цитокинов типа 1, например, ИФНЗ и ГМ-CSF.

Большинство современных иммунотерапии, включая дендритные клеточные вакцины и приемную передачу Т-клеток, предназначены для целевых опухолевых дифференцированных антигенов. CSCs, которые не могут выразить эти дифференцированные антигены могут поэтому избеубежать эти иммунологические пристрелить. В отличие от этого, вакцина CSC предназначена специально для целевых раковых стволовых клеток может уничтожить эту особую популяцию раковых клеток, и тем самым улучшить терапевтическую эффективность вакцины путем предотвращения рецидива опухоли и метастазов.

Как в культурных опухолевых клетках, так и в свежесобранных опухолях мы определили обогащенную CSC популяцию по цитометрии потока на основе высокой активности дегидрогеназы альдегида. Такие ALDHвысокие клетки могут быть изолированы путем сортировки потока, которые будут использоваться в качестве источника антигена для импульса DC для создания CSC-TPDCs. Сравнение с использованием ALDH высоких клеток, изолированных от культурных опухолевых клеток против свежесобранные опухоли показали никакой существенной разницы в срок индукции анти-CSCиммунитет 8. Эти результаты показали потенциал для использования CSCs изолированы либо от культурных опухолевых клеток или от свежесобранных опухолей для клинического применения.

Чтобы быть клинически актуальным, вакцина должна быть рассмотрена в терапевтических условиях. Эти эксперименты сейчас проводятся в нашей лаборатории.

Раскрытие информации

STEMCELL Technologies поддержала сборы за публикацию открытого доступа.

Благодарности

Эта работа была поддержана Уилл и Джин Колдуэлл наделенный научно-исследовательский фонд Мичиганского университета Всеобъемлющего онкологического центра и, в частности, NIH грант CA82529 и Фонд Гиллсона Лонгенбо.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ALDHEFLOUR KITStemcell Technologies1700
Мышь IL-4Pepro Tech214-14
Мышь GM-CSFPepro Tech315-03
Мышь GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Градиент плотности MediumSigma AldrichD1556
BD OptEIA TMB Реагент на основе Комплектоборудования
BD Biosciences BD FACS Aria Cell SorterBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058
для 555214

Ссылки

  1. Shafee, N., Smith, C. R., et al. Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors. Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).
  2. Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells. Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).
  3. Dallas, N. A., Xia, L., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).
  4. Yamauchi, K., Yang, M., et al. Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 68, 516-520 (2008).
  5. Chang, A. E., Redman, B. G., et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer. Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).
  6. Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).
  7. Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy. Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).
  8. Ning, N., Pan, Q., et al. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).
  9. Ginestier, C., Liu, S., et al. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).
  10. Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer. Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).
  11. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ALDEFLUOR

Похожие статьи