Методическая статья

Производство аполипопротеина C-III Knockout Кролики использованием цинковый палец нуклеаз

20.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50957

⸱

18 ноября 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Department of Molecular Pathology, University of Yamanashi

В этой статье

Краткое содержание

Последние события в генного таргетинга инструментов делает производство нокаутом (KO) кролики возможно. В настоящей работе, мы получили пять аполипопротеина (Апо) C-III KO кроликов, используя цинковый палец нуклеаз (ZFN). Эта работа показала, что ZFN является весьма эффективным методом для получения KO кроликов.

Аннотация

Аполипопротеина (Apo) C-III (ApoCIII) находится на поверхности плазменного хиломикронов (СМ), очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов высокой плотности (HDL). Было признано, что высокие уровни плазмы ApoCIII фактор риска constitutea для сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Повышение уровня плазмы ApoCIII часто коррелирует с резистентностью к инсулину, ожирения и гипертриглицеридемии. Неоценимая знания о роли ApoCIIIin липидов и сердечно-сосудистых заболеваний метаболизма, была получена из трансгенных мышиных моделей, включая ApoCIII нокаутом (KO) мышей, однако, следует отметить, что метаболизм липопротеинов у мышей отличается от людей во многих аспектах. Это не известно до сих пор ли повышен в плазме ApoCIII прямо атерогенными. Мы работали для разработки ApoCIII KO кроликов в настоящем исследовании, основанной на гипотезе, что кролики могут служить reasonablemodelfor изучения человеческого метаболизма липидов и атеросклероз. Цинк палец нуклеазы (ZFN) Наборы ориентации кролик АрoCIIIgene были подвергнуты проверке в пробирке эмбриона до микроинъекции. МРНК вводили в цитоплазму 35 кроликов пронуклеусов эмбрионов на стадии, и оценили частота мутаций у государства бластоцисты. Из шестнадцати бластоцисты, что были проанализированы, удовлетворительная скорость мутации 50% (8/16) по поводу ударов сайте был достигнут, поддерживая использование набора 1 для естественных условиях экспериментов в. Далее, мы микроинъецировали 145 эмбрионов с Set 1 мРНК, и передал эти эмбрионы до 7 кроликов получателей. После 30 дней беременности, 21 комплектов родились, из которых пять были подтверждены как ApoCIII KO кроликов после ПЦР секвенирования анализов. Скорость животных КО (# KO комплекты / общее родился) составила 23,8%. Общая эффективность производства составляет 3,4% (5 kits/145 эмбрионов). Настоящая работа показала, что ZFN является весьма эффективным методом для получения KO кроликов. Эти ApoCIII KO кролики являются новыми ресурсы для изучения роли ApoCIII в липидных метаболизма.

Введение

Аполипопротеина (Apo) C-III (ApoCIII) представляет собой небольшую O-гликозилированный секреторный белок, который синтезируется главным образом в печени и кишечнике. Он находится на поверхности плазменного хиломикронов (СМ), очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеинов высокой плотности (HDL). ApoCIII была признана как фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний 1. Пациенты с наследственным дефицитом ApoCIII имеют низкую триглицеридов в плазме (ТГ) уровней и снижение субклинический атеросклероз коронарной артерии 2,3. Повышенные уровень в плазме ApoCIII, с другой стороны, часто коррелирует с резистентностью к инсулину, ожирение и гипертриглицеридемии (HTG) 4,5.

Джин нокаутом (КО) является мощным средством для изучения функции гена. В соответствии с наблюдениями в мутантных популяций человека, нокаут гена ApoCIII у мышей привело к снижению ТГ в плазме и защиты от приема пищи ГТГ 6. Появились Такая положительная роль ApoCIIIне зависит от аполипопротеина Е (ApoE), как мыши, дефицитные обоих ApoE и ApoCIII также защищены от приема пищи гиперлипидемии 7. Хотя эти модели ApoCIII KO мыши предоставили ценную информацию о возможных функций ApoCIII у человека, следует отметить, что метаболизм липопротеинов у мышей отличается от людей во многих аспектах. Например, мышь не хватает плазмы холестерил белка-переносчика эфиров (CETP), крупный фермент, участвующий в транспортировке ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП 8. Поэтому, необходимо разработать соответствующую животную модель для более глубокого понимания физиологической роли ApoCIII в естественных условиях.

Кролик является классическим видов животной модели 9-11. Она имеет короткий период беременности (30-31 дней), большой размер помета (4-12/litter) и могут быть размещены удобно в крытый объект. По сравнению с мышами, кролики филогенетически ближе к людям 10. Важно отметить, что, как хучеловек, но в отличие от мышей, кроликов LDL богатых млекопитающие и имеют существенные уровни ПООППО 10,12. Кроме того, они чувствительны к холестерина диеты, богатой вызванной атеросклерозом с поражением аналогичных тем, которые наблюдаются в человеческом атеросклероза 13. По этим причинам, мы предположили, что ApoCIII KO кролики могут служить лучшей модели, чем их коллеги мыши по расследованию роли ApoCIIIplay в метаболизме липидов и атеросклероз у людей.

Производство гена целевой трансгенных (GTT) кроликов был вызов. В основном это связано с отсутствием зародышевой линии, передающей эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), и крайне низкой эффективности соматической клетки переноса ядра (SCNT) у кроликов. ESC является основным инструментом для создания мышей ГЦГ, в то время как и SCNT успешно применяется для создания KO животных в видов хватает зародышевой линии, передающие ESCs, в том числе свиней, овец и крупного рогатого скота, но не кроликов. Недавно цинковый палец нуклеазы (ZFN), Транлия Активатор-Как Эффектор нуклеазы (Talen) 14, и РНК Руководствуясь Эндонуклеаза (RGEN) 15 появился как мощное средство для редактирования генома. Эти нуклеазы, так называемые «молекулярные ножницы», являются эффективными в создании двунитевых разрывов (ДР) в геноме, которые могут привести к функциональной нокаутом гена-мишени или используемые для интеграции последовательность ДНК в определенном локусе генома в ряд видов 16. В 2011 году в числе первых адаптации технологии ZFN, мы получили активатора пролиферации пероксисом рецептор гамма (PPAR-) KO свиные клетки с помощью этого подхода и успешно генерируемых РАПП KO свиней после использования этих клеток в течение SCNT 17. В том же году, сообщалось эффективным разрушение гена иммуноглобулина и целевой замена у кроликов также с использованием ZFN 18.

В настоящем исследовании, пять ApoCIII KO кролики были получены, что подтверждается ПЦР секвенирования с использованием ZFN Set 1 (см. рисунок 1 . блок-схемы для иллюстрации). Эти животные являются новыми ресурсы для изучения роли ApoCIII в липидных метаболизма.

Протокол

Все процедуры технического обслуживания животных, уход и использование были рассмотрены и одобрены Комитетом университета по по использованию и уходу за животными в Мичиганском университете.

1. ZFN Дизайн и выбор

  1. Предоставления сведений о геномной последовательности интересующего гена (например кролика ApoCIII) к производителю. Выберите ZFN набор (ы) для экспериментов на основе баллов ZFN.

2. Кролик эмбрионов

  1. Superovulate сексуально зрелыми (6-18 месяцев) Новая Зеландия Белый (NZW) крольчихи подкожно (SC) инъекции ФСГ дважды / день с дозировкой 3 мг в течение первых двух инъекций, 5 мг в течение следующих двух инъекций и 6 мг в течение последних двух инъекций.
  2. Администрирование один внутривенного (ВВ) инъекцию 200 МЕ ХГЧ на 72 ч после первого ФСГ инъекций индуцировать овуляцию. Mate в superovulated самок с мужским кролика сразу после ХГЧ инъекции.
  3. Euthaniге в superovulated доноры кроликов с пентобарбитала натрия (150 мг / кг, внутривенно) при 16-18 ч после оплодотворения (фунтов на квадратный дюйм).
  4. Восстановление яйцевода мозоли, тщательно собирая целые Яйцеводы и яичники структуру.
  5. Флеш каждый яйцевод с манипуляции 10 мл среды HEPES буферный TCM 199, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, путем введения в среду с конца матки в маточной трубе. Соберите покрасневшее среду на яичник-концевого отверстия яйцевода в чашке Петри.
  6. Наблюдать и выявлять восстановленные эмбрионов в промываемого среды, мыть эмбрионов три раза в манипуляции среды, держать их в манипуляции среде при 38,5 ° С на воздухе, и наблюдать их под стереомикроскопом для возникновения оплодотворения. Подготовка к микроинъекции на пронуклеусов эмбрионов на стадии 19-21 ч пси

3. Подготовка ZFN мРНК

  1. Очищают полученный мРНК перед ресуспендирования в РНКазу 0,1 X TE (1 мМ Трис-Cl рН8,0, 0,1 мМ ЭДТА). Измерение концентрации и хранить мРНК при -80 ° С до использования.
  2. Подготовьте мРНК, кодирующие ZFN пару (4-10 нг / мкл в 1 mMTris-Cl, 0,1 мМ ЭДТА при рН 7,5), Алиготе в 10 мкл флаконах. Храните их при температуре -80 º С до готовности к использованию. Перед микроинъекции, оттепель РНК флакон (ы), и держать его на льду.

4. Эмбрион Микроинъекция

  1. Подготовьте микроинъекции платформу, помещая каплю 5 мкл манипуляции среды на ночном слайде 1-а, который имеет медиа-камеру удалены. Накройте среднего падение с минеральным маслом и места на нагревательный столик микроскопа.
  2. Наведите холдинг пипетку (диаметр 120 мкм) в держатель кронштейна микроманипулятора и расположить его в каплю манипуляции среды.
  3. Изготовление инъекции микропипетки путем нагревания и вытягивания из боросиликатного стекла капилляров в микропипетка ПУЛЛЕРА. Загрузите мРНК, который будет введен в инъекционной пипетки.
  4. Включите подачи сжатого воздуха, который подключен к microinjector.
  5. Наведите впрыска пипетки в держатель инъекции, поставить его на микроманипулятора и располагать его во капле манипуляции среды.
  6. Установка microinjector, со следующими предложенными параметрами: holdP = 2 фунтов на квадратный дюйм, InjP = 20 фунтов на квадратный дюйм, ClearP = 60 фунтов на квадратный дюйм, Injtime = 1 сек, что приведет к объему впрыска 1-5 пл.
  7. Откройте кончик инъекционной пипетки, осторожно нажав на него против проведения пипетки.
  8. Передача эмбрионов (30-50) к падению микроманипуляции на платформе. Используйте удержания пипетку, чтобы захватить эмбриона и выровняйте инъекционной иглы, эмбрион и проведение пипетки вдоль оси х.
  9. Под 400-кратном увеличении, продвижения инъекционной пипетки через эмбриона. Будьте осторожны, чтобы избежать ядро. После того, как плазматическая мембрана прокалывается, нажатие на педаль ногой вводить. После инъекции, извлеките иглу, отпустите эмбрион. Повторите этот процесс для всех остальных EMbryos.
  10. Вымойте вводили эмбрионы три раза в эмбриона культуральной среде, которая состоит из сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) с добавлением несущественные аминокислот (NEAA), незаменимых аминокислот (EAA), 1 мМ L-глутамина, пирувата 0,4 ммоль натрия и 10% FBS.
  11. Инкубируйте эмбрионов на 38,5 ° С в 5% СО 2 в воздухе в течение 1-2 часов, прежде чем они будут переданы хирургическим путем в яйцеводах синхронизированной женской получатель NZW кролика (см. шаг 5.1). С другой стороны, культура эмбрионы пока они не достигнут стадии бластоцисты, прежде чем они используются для проверки в пробирке или анализов.

5. Эмбрион Трансфер

  1. Выберите женский NZW кролика 5-12 месяцев, в добром здравии, весом ок. От 4,0 до 5,0 кг, как животного-реципиента. Администрирование гонадотропин высвобождающий гормон (GnRH) инъекции внутримышечно (IM, 50 мкг / мл, 0,3 мл / животное) к получателю в тот же момент времени, что с ХГЧ инъекции в животного-донора (ов) (см. шаг 2.2).
  2. После завершения микроинъекции, подготовить кролика получателей для переноса эмбрионов (обычно 16-24 ч после ГнРГ инъекций). Обезболить кролика с 10-40 мг / кг кетамина (IM), и / или испаряется изофлуран (2-4%) при вдыхании. Защита глаза кролика от чрезмерного высыхания применением стерильной глазной мази. Соблюдайте животное, пока он не полностью без сознания, то есть. не реагирует на педаль рефлексов; сжимая ноги коврик используется для проверки отсутствия педали рефлекс, который является показателем адекватной анестезии.
  3. Бритье живот кролика, мыть с антисептическим скраб, а затем раствором антисептика, и протрите бритая зона с стерильных марлевых губок.
  4. Выполните операцию в стерильных условиях, записывать важные признаки кролика-реципиента примерно каждые 15 мин на протяжении операции.
  5. Передача 10-25 эмбрионов на одного животного-реципиента, в зависимости от доступного количества зародышей.
  6. В концехирургические процедуры, закрыть мышечного слоя с покрытием рассасывающиеся нити. Шовный кожу либо субкутикулярных шва с помощью рассасывающиеся нити или с простыми узловыми швами кожи с использованием nonabsorable шов (например мононити нейлона или подобное).
  7. Держите животное в тепле и контролировать его, пока его грудины лежачее положение не достигается.
  8. Daily Monitor животное. Следуйте инструкциям ветеринара по уходу за животным. Администрирование мелоксикам (SC 1,0 мг / кг), чтобы уменьшить боль и / или уменьшить лихорадка ежедневно сообщению операцию, если установлена ​​необходимость ветеринаром.
  9. Удалить nonabsorable швы кожи около 10-14 дней после операции.

6. Обнаружение ZFN индуцированного разрушение гена

  1. Для проверки в пробирке, выполнять генотипирование на в пробирке культивируемых эмбрионов. Лизируют отдельные эмбрионы, которые разработаны для морула / бластоцисты этапах в 5 мкл NP40 раствора (1% NP40 плюс 1 мкг / мл протеиназы К в Taq буфер) В течение 0,5-1 ч при 55 ° С и 10 мин при 95 ° С.
  2. Для генотипирования потомства, собирать образцы кожи уха от новорожденных комплектов, извлечь геномной ДНК, и использовать их в качестве шаблонов для ПЦР секвенирования. Применить Kwik-Stop в район выборки после сбора, чтобы остановить кровотечение и уменьшить дискомфорт.
  3. С помощью лизиса с шагом 6,2 или 6,3 в качестве матрицы для ПЦР с использованием LA-Taq и ПЦР пары праймеров, которые расположены выше по течению (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ') и ниже по течению (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3') целевого сайта ZFN .
  4. Очищают продуктов ПЦР и секвенирования их секвенирования грунтовки (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ').
  5. Определить образцы мутантные, глядя на двойной кривой на диаграмме последовательности вокруг Ориентация на сайты. Этикетка те, с двойными кривыми как "позитивный".
  6. Клонировать "положительных" продуктов ПЦР в ТА вектора клонирования, забрать 10-20 клоны, последовательность вставок, и подтвердите мутации вокруг тargeting сайт.

Результаты

В пробирке проверки ZFN пар
Шестнадцать ZFN пары были первоначально предназначены. Целенаправленное разрушение последовательность набора 1 расположен в экзоне 2 кролика ApoCIII (рис. 2А). Три пары (набор 1, 2 и 3, рис. 2а) были отобраны и подвергнуты дрожжей MEL-1 репортерного анализа для определения действия ZFN (рис. 2б). Установите 1 имеет счет ZFN из 224,2%, что выше, чем у серии 2 (196,9%) и установилась 3 (177,8%), гораздо более высокую, чем выбор порога (то есть 50% от внутреннего положительного контроля). Поэтому набор 1 был выбран для лабораторного экспериментов проверки.

Конкретный набор должен привести к положительным ставкам в зародышах 10% или выше, чтобы пройти в пробирке проверку эмбриона, на основе внутренних критериев оценки. МРНК (5 мкг / мл) Сета 1, микроинъекции в цитоплазму 35 пронуклеусов эмбрионов этап кролика (рис. 3А </ STRONG>). Промываемое эмбрионы без микроинъекции лечения (N = 31) были использованы в качестве контрольной группы. Восемнадцать эмбрионы в микроинъекции группы разработаны для BL стадии на D5, из которых шестнадцать были секвенированы, и восемь (BL # Apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 3В, красный подчеркнуты) отображается мутированный последовательности в месте таргетинга (черно-коробку, рис. 2В, верхний ряд, apoC3wt.seq). Скорость BL из микроинъекции группе (51,4%) ниже, чем в контрольной группе (77,4%), что свидетельствует слегка нарушенной компетентность с развитием эмбрионов из микроинъекции. Положительный частота мутаций из микроинъекции эмбрионов 50,0% (8/16), что намного выше, чем пороговое значение отбора (т.е. 10%). Эти результаты показали, что набор 1 является эффективным набор ZFN чтобы вызывать мутации в ориентации на сайты кролика ApoCIII. Поэтому набор 1 была выбрана для производства в естественных условиях ApoCIII KO кроликов.

Производство ApoCIII KO кроликов
МРНК ое ZFN Набор 1 был микроинъекции в цитоплазму кролика пронуклеусов эмбрионов на стадии, и переданы 145 микроинъекции эмбрионы до 7 псевдо-беременности кроликов получателей (Рисунок 4A). Свежий промываются эмбрионы (N = 75) без ZFN микроинъекции были переданы получателям (N = 6) в качестве контрольной группы. Через 30 дней беременности, 21 комплектов родились в микроинъецировали группы. ПЦР секвенирование определены пять (apoC3-R1, R9, R11, R12 и R16) в качестве позитивных комплектов KO (рис. 4б). Термин ставка рассчитывается как общий термин комплекты / всего эмбрионов составляет 14,5% (21/145), в то время как стоимость 29,3% (22/75) в контрольной группе. КО ставка рассчитывается как комплекты KO / общий срок является 23,8% (5/21). Один КО комплект (АПБО-R16) умер через пять дней после родов (20,0%, 1/5). Indelsat адресности сайте включают две вставки и три удаления, они areΔ1, 1, 1, Δ20 и Δ21, для Кролики # R1, R9, R11, R12 и R16 соответственно (рис. 4В).

БиАнализ oinformatics был использован для выявления потенциальных ZFN вне целей с 7 или менее несоответствия в Набор 1 последовательность, как описано выше 17. Только один предсказал возможное вне целевой сайт, расположенный на хромосоме 14, был отождествлен с 7 несогласованных бит. ПЦР-анализ не выявил мимо ворот события в любой из учредителей животных.

Обсуждение

В настоящей работе, пять ApoCIII KO кролики были получены с использованием технологии ZFN. Ранее единственным доклад производства GTT кроликов также использовали технологию ZFN 18. Настоящая работа подтвердила, что ZFN полезно эффективно генов-мишеней в кроликов.

В настоящем исследовании, трансгенный ставка (положительный комплекты / общее родился) is23.8% (5/21), что сопоставимо с аналогичным показателем предшествующей отчета ZFN у кроликов (30,8%, 16/52) 18, и те, сообщил использования ZFN у других видов животных, в том числе зебры рыбы 19 мышей 20, крыс 21 и свиней 17. Этот показатель фактически выше, чем скоростей многих обычных производственных трансгенных кроликов исследований, которые обычно попадают в диапазоне 5-20%. Например, в стремлении к продукции ApoCIII трансгенных кроликов через обычного микроинъекции ДНК, Динг и др.. Получены 3 положительных учредителей из 54 щенков, рожденных (5,6%) 22.

В соответствии с предыдущими выводами, мутации по поводу ударов сайтов являются переменными, в том числе удалений или вставок, состоящих разное количество баз (в пределах от 1-21 в пяти KO кроликов). На основе конкретной информации о последовательности из учредителей животных, он предсказал, что по крайней мере четыре (то есть., Содержащие Δ1, 1, 1, или Δ20 мутации) будет иметь потери функции ApoCIII. Животное Р-16 с Δ21 может отображаться функциональную потерю, как эта мутация, по прогнозам, только привести к потере семи аминокислот, но не сдвиг рамки считывания. В конечном счете, фенотип анализы необходимы для определения, если эти основатель животные действительно показать потерю функций ApoCIII.

Ни один из пяти KO кроликов, полученных в данном исследовании не содержат биаллельных модификации. Интересно, что это также имеет место в предыдущем докладе кролика ZFN. В противоположность этому, когда ZFNs ориентации α1 ,3-галактозилтрансферазу были применены к свиньиКлетки, частота ориентации одну аллель колебалась от 7-46%, при этом около одной трети мутаций, создающих одним шагом биаллельных нокаутом 23. В соответствии с этим, когда Talen был применен к свиньи фибробластов, то биаллельных модификации были найдены в примерно 15-40% от общего объема позитивных клонов 14. Вполне возможно, что неспособность генерировать биаллельных кроликов KO в настоящем исследовании может указывать разницу виду (например, кроликов против свиней) для такой мощностью нуклеазной основе генного таргетинга. Это, однако, более вероятно, что это просто потому, что количество КО кроликов, генерируемых в этом проекте является относительно небольшим. Мы считаем, что ZFN способен генерировать bialleic мутации в кроликов, которые должны быть рассмотрены в качестве еще одного потенциального преимущества, основанного ZFN GTT производстве кролика. Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы подтвердить такую ​​способность ZFN у кроликов.

В заключение, данная работа показывает, что ZНа основе FN генного таргетинга подход эффективен в производстве KO кроликов. В частности, мы получили пять ApoCIII KO кроликов с удовлетворительной скоростью трансгенных 23,8%. Эти животные, как полагают, чтобы обеспечить более существенную информацию о роли этого белка на липидных метаболизма в организме человека, чем соответствующие модели мыши. Мы прогнозируем, основанный ZFN таргетинг гена, а также другие нуклеазам основе таких технологий, как Talen и RGEN, в nonmurine животных значительно облегчит разработку новых моделей на животных для изучения различных человеческих заболеваний.

figure-discussion-1
Рисунок 1. Блок-схема производства нокаутом кроликов с использованием технологии ZFN. Производство KO кроликов с использованием технологии ZFN начинается с выбором интересующего гена. Информация о последовательности обеспечивается, наборы ZFN предназначены, и Subjected дрожжей на основе проверки на месте. В пункте пропуска (СР) 1 (СР-1), только те наборы проходили в доме валидацию (50% или выше внутреннего положительного контроля) будет предоставлена ​​пользователям для выбора. Если нет комплекта не пройти CP-1, дополнительная последовательность могут быть необходимы для разработки эффективных наборов ZFN. Проверка эмбриона в пробирке следует обеспечить выбранный ZFN набор может вызывать мутации на отдельных участках (CP-2). ZFN набор (ы) будет использоваться только тогда, когда она проходит БО-2 (> = 10% ставки мутация эмбрионов в пробирке). Отказ в КП-2 понадобится доработка наборов ZFN. Эмбрион доноры будут подготовлены и пронуклеусов эмбрионов на стадии будет микроинъекции с проверенных массивов ZFN. Эти микроинъекции эмбрионы будут переведены на синхронизированных реципиентов эмбрионов. После периода один месяц беременности, новорожденные будут генотипированы (СР-3). Если ни один из новорожденных не являются положительными, дополнительная микроинъекции будет выполнена. Это займет 2-3 месяца от начала проекта до КП-2, предполагая, по недостаточности во время процесса. Он принимает дополнительные 2-3 месяцев с СР-2 к СР-3. Поэтому можно генерировать нокаутом кролика в 4-6 месячного срока с использованием технологии ZFN. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-discussion-2
Рисунок 2. ZFN дизайн. Три комплекта ZFN (Set 1, 2 и 3) были разработаны в интересах различных последовательностей на экзоне 1 или экзона 2 кролика ApoCIII (А). Все три комплекта были подвергнуты дрожжей MEL-1 репортерного анализа для определения действия ZFN. Согласно протоколам ми изготовител, ZFNs, которые показывают> 50% деятельности, что внутреннего положительного контроля завода-изготовителя, считаются полезными для в пробирке и в естественных генома экспериментов редактирования.Деятельность ZFN были 224,2% за 1-м сете, 196.9% для серии 2 и 177,8% для Set 3 (В), поэтому указан 1 был выбран в настоящем исследовании. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-discussion-3
Рисунок 3. Экстракорпоральное эмбрион проверка ZFN. МРНК (5 мкг / мл) Сета 1, микроинъекции в цитоплазму 35 пронуклеусов эмбрионов этап кролика (А). Промываемое эмбрионы без микроинъекции лечения (N = 31) были использованы в качестве контрольной группы. Темпы развития BL был 77,4% в контрольной группе. В микроинъецировали группы, скорость BL составила 51,4%. Из 16 БЛ подвергали ПЦР секвенирование, 8 (50%) были идентифицированы как положительные, указывающий Set 1 является эффективным набор ZFN, чтобы вызвать мутации в щитомсайт тин (B, apoc3wt.seq, черно-коробке) из ApoCIII у кроликов. БСТ, содержащие мутации, BL # Apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 и 17 (B, красный подчеркнуты). Остальные НД (# Apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 и 16) не имеют мутации в ориентации на сайты. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

figure-discussion-4
Рисунок 4. Производство ApoCIII KO кроликов. Сто сорок пять эмбрионов микроинъекции с ZFN набор 1 мРНК были переданы 7 псевдо-беременности кроликов получателей (А). Свежий промываются эмбрионы (N = 75) без ZFN микроинъекции были переданы получателям (N = 6) в качестве контрольной группы. Термин ставка рассчитывается как общий термин комплекты / всего эмбрионов в эксперименте группы 140,5% (21/145), тогда как стоимость 29,3% (22/75) в контрольной группе (А). Из 21 комплектов, рожденных в микроинъекции группы, пять (R1, R9, R11, R12 и R16) были идентифицированы как положительные наборы KO после ПЦР последовательности (B). В индели по поводу ударов сайте включают две вставки (1 как для R9 и R11) и три делеции (Δ1, Δ 20, Δ 21 для R1, R12 и R16, соответственно). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично финансировалось за счет грантов от Национального института здоровья (HL105114, HL088391, NS066652 и HL068878 чтобы YEC), Американской ассоциации сердца (Национальный научный развития 0835237N для JZ). YEC при финансовой поддержке как наделенного Фредерик Huetwell профессор сердечно-сосудистой медицины при Университете Мичигана медицинский центр (УГМК). Эта работа используется Core Services, поддерживаемые Центр перспективных моделей для поступательного наук и терапии (CAMTraST) в УГМК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
APOC3-ZFNSigma AldrichCSTZFNY-1KTЦелевой ген: APOC3, номер партии: 12201118MN
mMESSAGE kitInvitrogenAM1344Mсинтез мРНК
MEGAclear Kit ИнвитрогенAM1908Mочищение мРНК
Фолликулостимулирующий гормонBioniche Life SciencesФоллтропин-VЛечение кроликов-доноров
эмбрионов Хорионический гонадотропин человекаIntervetChorulonЛечение кроликов-доноров
гонадотропин-рилизинг-гормонаProspecbioHOR-255Лечение кроликов-реципиентов
Сбалансированный солевой раствор Earle's (EBSS) Thermo Fisher ScientificSH30029.02Культура эмбрионов, основная среда
MEM (заменимые аминокислоты)Sigma AldrichM7145Культура эмбрионов, добавки
BME AMINO ACIDS растворSigma AldrichB6766Культура эмбрионов, добавки
ГлутаминGibco25030-149Культура эмбрионов, добавки
Пируват натрия Gibco11360-070Эмбриональная культура, добавки
Фетальная бычья сывороткаSigma Aldrich12003CЭмбриональная культура, добавки
HEPES буферизованная TCM 199 Gibco12350039Среда для манипуляций с эмбрионами
ИнкубаторEppendorfGalaxy 170Оборудование для культивирования эмбрионов
Микроманипулятор EppendorfTransferMan NK 2Оборудование для манипуляций с эмбрионами
Съемник микропипетокSutter Instruments Inc.P-1000Оборудование для манипуляций с эмбрионами
Микроинъектор Tritech ResearchMINJ-DОборудование для манипуляций с эмбрионами
, капиллярные трубки из боросиликатного стекла Уорлд Прецизионные Инструменты, Инк.TW100F-6Поставщик для манипуляций с эмбрионами
Эутазол (пентобарбитол натрия)Virbac AH, Inc.ANADA#200-071Эвтаназия кроликов-доноров эмбрионов

Ссылки

  1. Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
  2. Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
  3. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
  4. Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
  5. Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
  6. Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
  7. Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
  8. James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
  9. Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
  10. Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
  11. Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
  12. Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
  13. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
  14. Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  15. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
  16. Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
  17. Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
  18. Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045(2011).
  19. Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
  20. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  21. Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870(2010).
  22. Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
  23. Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).

Перепечатки и разрешения

Теги

ApoCIIIZFN
Производство аполипопротеина C-III Knockout Кролики использованием цинковый палец нуклеаз
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.