Методическая статья

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

DOI:

10.3791/51114

⸱

17 января 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем фенотипическое анализ, применимый к высокой пропускной способности / высокое содержание экранов малых помех синтетической РНК (siRNA), химическое соединение, и Mycobacterium туберкулеза мутант библиотек. Этот метод опирается на обнаружение флуоресцентно помечены Mycobacterium туберкулеза в флуоресцентно помечены клетки-хозяина с использованием автоматизированной конфокальные микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на наличие терапии и вакцины, туберкулез (ТБ) остается одной из самых смертоносных и распространенных бактериальных инфекций в мире. На протяжении нескольких десятилетий внезапный всплеск штаммов с множественной и широко лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу для борьбы с туберкулезом. Поэтому необходимо определить новые целевые показатели и пути, критически важные для причинного агента туберкулеза, микобактерий туберкулеза(МТБ),и найти новые химические вещества, которые могут стать противотуберкулезными препаратами. Один из подходов заключается в разработке методов, подходящих для генетических и химических экранов крупномасштабных библиотек, позволяющих искать иголку в стоге сена. С этой целью мы разработали фенотипический анализ, опираясь на обнаружение флуоресцентно помечены Mtb в флуоресцентно помечены принимающих клеток с использованием автоматизированной конфокалипической микроскопии. Этот анализ in vitro позволяет количественно оценить процесс колонизации Mtb в хост и был оптимизирован для формата микроплюса 384-ну, который является правильным для экранов siRNA-, химического соединения- или Mtb мутант-библиотек. Изображения затем обрабатываются для мультипараметрического анализа, который обеспечивает считыв вывод о патогенеза Mtb в клетках-хозяинах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Среди новых и вновь возникающих инфекционных патогенов, зарегистрированных в последние годы, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) занимает видное место, отвечая за 1,4 миллиона смертей и 8,7 миллиона новых инфекций в 2011 году (Глобальный доклад о туберкулезе 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Несмотря на наличие мультимедикаментозной терапии, число инфицированных людей по-прежнему растет, и мультимедикаментозная устойчивость (МЛУ), а также широко устойчивый к лекарственным средствам (XDR) Mtb быстро распространяется по всемумиру 1. Кроме того, принимая во внимание наличие Mtb антигенов, очевидно, что одна треть мирового населения считается скрыто инфицированных Mtb. Статистически, в одном случае из десяти, есть эволюция к активной форме заболевания с последующими клиническими симптомами2. Поэтому срочно нужны новые средства борьбы с МТБ. В этом контексте мы разработали визуальный фенотипический анализ in vitro, опираясь на мониторинг вторжения Mtb и умножения в клетки-хозяина с помощью автоматизированной конфокальные микроскопиифлуоресценции 3. Адаптация анализа в 384-хорошо микротитр пластин в сочетании с автоматизированным приобретением изображений и анализа, позволило высокого содержания / высокой пропускной способности скрининга (HC / HTS) средних библиотек соединений, siRNAs и бактериальных мутантов. Таким образом, скрининг широкой библиотеки РНК генома на этом фенотипической анализе позволил выяснению ключевых факторов, связанных с торговлей Mtb и внутриклеточной репликацией, а также выяснение путей хозяина, эксплуатируемых бактериорной бациллой. Еще одна адаптация этого конкретного фенотипического анализа была для выявления бактериальных факторов, необходимых для Mtb внутрифагосомальной настойчивости. Например, арест фагосомного созревания рассматривается как один из основных механизмов, который облегчает выживание и репликацию Mtb в макрофаге. Мониторинг субклеточной локализации вырубающих мутантов Mtb в флуоресцентно помеченных кислотных отсеках позволил выясовывания бактериальных генов, участвующих в процессевыживания 4. Наконец, высокосодержимая визуализация Mtb также предлагает отличный метод количественной оценки эффективности препарата для ингибирования различных явлений, таких как внутриклеточный ростбактерий 3. В целом, этот тип высокой пропускной способности фенотипического анализа позволяет ускорить открытие препарата против туберкулеза и данные, собранные этими различными подходами способствуют лучшему пониманию хозяина манипуляции, оказываемой Mtb.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Высокой пропускной способностью генома всей siRNA скрининга

Скрининг проводится в человеке Тип-II пневмоцитов модели A549 клеточной линии при инфекции СМТБ H37Rv выражая зеленый флуоресцентный белок (GFP). Эта процедура изложена на рисунке 1A.

  1. Resuspend высушенной библиотеки siRNA, которая хранится в материнских пластин (96-хорошо пластин) с 1x siRNA буфера для достижения концентрации 4 МКМ, а затем передать 10 мкл смеси в 384-ну дочь пластины (дочь пластины 1).
  2. Добавьте 10 мкл буфера 1x siRNA в дочери пластины 1, чтобы разбавить siRNA в 2 раза. После повторного сиУСПЕНЗИЯ пластины запечатываются очищенным алюминиевым уплотнением и могут храниться при -20 градусах цельсия не менее 6 месяцев и до 2-3 лет, но время хранения может варьироваться в зависимости от рекомендаций производителя библиотеки siRNA.
  3. Разбавить siRNAs в дочери пластины 1 в дочь пластины 2 для достижения концентрации 500 нМ. После повторного сиУСПЕНЗИЯ пластины запечатываются очищенным алюминиевым уплотнением и могут храниться при -20 градусах цельсия не менее 6 месяцев и до 2-3 лет, но время хранения может варьироваться в зависимости от рекомендаций производителя библиотеки siRNA.
  4. Перед использованием оттаивать дочку пластины 2 при комнатной температуре.
  5. Возьмите 2,5 мкл siRNA из дочери пластины 2 и поместите в 384-ну анализ пластины.
  6. В той же 384-хорошо анализ пластины в шаге 1,5, добавить 2,5 мкл отрицательной и положительной siRNA контроля в своих соответствующих скважин.
  7. Разбавить реагент трансфекции в 1x D-PBS, чтобы дать достаточное решение, чтобы обеспечить 0,1 мкл трансфекции реагент в каждой хорошо и preincubate разбавленного раствора трансфекции при комнатной температуре в течение 5 мин.
  8. Добавьте 7,5 мл смеси раствора трансфекции/PBS в каждую хорошо в анализной пластине и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
  9. Добавьте 40 мкл клеток A549 (1500 клеток/хорошо), подвешенных в rpMI 1640 средних, дополненных 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS). Поддерживайте клетки в течение 3-дневного инкубационный период при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% CO2. Эти клетки делятся каждые 24 часа, таким образом, около 12000 клеток находятся в колодцах через три дня после трансфекции.
  10. Вымойте двухнедельный GFP-выражение Mtb H37Rv культуры с D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2) центрифугации на 4000 х г в течение 5 минут и отказаться от моет. Повторите этот шаг 3x. (Для GFP-Mtb H37Rv условия культуры см. Протокол 3).
  11. Приостановить бактериальные гранулы в 10 мл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и декант в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы бактериальные агрегаты в осадок.
  12. Соберите бактериальный супернатант иизмерьте OD 600 (OD600 должно быть между 0.6-0.8) и GFP-флуоресценцией (значение РФС) с помощью микроплемента для определения бактериальной концентрации. Рассчитайте тариф подвески с помощью эталонной регрессионные линии, отображающие значение RFU q f (CFU value), которое было создано до эксперимента по другой культуре, которая была подготовлена в тех же условиях. Подготовка бактериальной суспензии, содержащей 2,4х 10 6 бактерий / мл, что соответствует множественности инфекции (МВД) 5.
  13. Удалите среду в 384-хорошо анализ пластины и добавить 25 мкл свежеприготовленной бактериальной суспензии.
  14. Инкубировать 384-хорошо анализ пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 5 часов в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  15. Удалите среду и аккуратно промыть клетки с RPMI среды дополняется 10% FBS 3x.
  16. Чтобы убить оставшиеся внеклеточные бактерии, обработать клетки с 50 мкл свежей среды RPMI-FBS, содержащей 50 мкг/мл амикацина при 37 градусов по Цельсию в течение 1 часа в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  17. Удалите среднесодержащие амикацин и добавьте 50 мкл свежей среды RPMI, дополненной 10% FBS. Инкубировать 384-хорошо анализ пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 5 дней в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  18. Перед приобретением изображения добавьте 10 мкл свежеприготовленных 30 мкг/мл ДАПИ в PBS (окончательная концентрация 5 мкг/мл) и инкубировать в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
  19. Загрузите пластину в автоматизированный конфокальный микроскоп.
    figure-protocol-1
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  20. Установите параметры экспозиции. Запись DAPI флуоресценции с использованием возбуждения лазер 405 нм с фильтром выбросов 450 нм и GFP флуоресценции с помощью возбуждения лазер 488 нм с фильтром выбросов 520 нм.
    figure-protocol-2
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-3
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  21. Выберите скважины и поля в каждой скважине, которые будут приобретены, что затем называется параметрами планировки и сублейла.
    figure-protocol-4
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-5
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  22. Создайте файл эксперимента, используя параметры из шагов 1.20 и 1.21, и запустите автоматическое приобретение.
    figure-protocol-6
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-7
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  23. Передача изображений на удаленный сервер.
    figure-protocol-8
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  24. Оценка изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Обнаружить ядра клеток из канала DAPI с помощью алгоритма обнаружения ядер и бактериальной области канала GFP с помощью алгоритма интенсивности пикселей(рисунок 4A).

Примечание: Этот протокол оптимизирован для изучения влияния глушиния генов на внутриклеточный рост Mtb. Mtb является медленной бактерией роста, которая делит каждые 20 часов в оптимальных условиях. После 5 дней после заражения количество внеклеточного Mtb по-прежнему низко при отсутствии клеточного лиза и не влияет на качество анализа. Этот протокол должен быть оптимизирован с точки зрения продолжительности лечения антибиотиками и инкубации время, которое будет адаптировано для siRNA экранов с использованием быстрорастущих бактерий, таких как Mycobacteria smegmatis и Escherichia coli, которые широко освобождены и могут инфицировать новые клетки.

2. Высоко пропускной состав скрининга

Скрининг проводится на Mtb H37Rv инфицированных клеток-хозяина. Эта процедура изложена на рисунке 1B.

  1. Оттепель 384-ну матери пластин, содержащих соединение библиотеки solubilized в DMSO 100%. Передача 0,5 мкл соединений в 384-ну дочери пластин, содержащих 10 мкл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS.
  2. Вымойте двухнедельный GFP-выражение Mtb H37Rv культуры с D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2) центрифугации на 4000 х г в течение 5 минут и отказаться от моет. Повторите этот шаг 3x (для GFP-Mtb H37Rv условия культуры см. Протокол 3).
  3. Приостановить бактериальные гранулы в 10 мл RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и декант в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы бактериальные агрегаты в осадок.
  4. Соберите бактериальный супернатант иизмерьте OD 600 (OD600 должно быть между 0,6-0,8) и GFP-флуоресценцией (значение РФС) с помощью микроплемента. Рассчитайте тариф подвески с помощью эталонной регрессионные линии, отображающие значение RFU q f (значение CFU), которое было создано до эксперимента. Типичная концентрация 1 х 108 бактерий/мл.
  5. Урожай 6-дневный первичный человеческий макрофаги на 4 х 105 клеток / мл в RPMI 1640 среды дополняется 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 50 нг / мл рекомбинантных человека M-CSF (Для человека периферической крови моноцитов клетки очистки и макрофагов дифференциации см. Протокол 4).
  6. Инкубировать разбавленные первичные клетки с бациллы в различных МВД, начиная от 1-5, в подвеске с легкой тряской при 90 об / мин в течение 2 часов при 37 градусов по Цельсию.
  7. Вымойте инфицированные клетки центрифугированием при 350 x g, чтобы удалить внеклеточные бактерии. После каждого шага центрифугации, повторно гранулы в RPMI 1640 среднего дополняется 10% FBS. Повторите этот шаг 2x.
  8. Приостановить инфицированные клетки в RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и амикацин на 50 мкг /мл и инкубировать подвеску с легкой тряски в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
  9. Удалите клеточно-культурную среду, содержащую амикацин путем центрифугации на уровне 350 х г, и промыть инфицированные клетки с полным RPMI 1640 среды дополняется 10% FBS и 50 нг / мл рекомбинантных человека M-CSF. Повторите один раз.
  10. Добавьте 40 мкл инфицированной подвески макрофагов в ту же ассную пластину в шаге 2.1, которая уже содержит 10 мкл разбавления соединения. Окончательная концентрация ДМСО в каждой из них в настоящее время достигла 1%.
  11. Инкубировать анализ пластин в течение 5 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  12. Пятно живых клеток с клеточной проницаемой далеко-красный флуоресцентный краситель.
  13. Загрузите пластину в автоматизированный конфокальный микроскоп.
    figure-protocol-9
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  14. Установите параметры экспозиции. Запись далеко-красной флуоресценции с использованием возбуждающей лазера 640 нм с эмиссионным фильтром 690 нм и флуоресценцией GFP с использованием возбуждающей лазера 488 нм с эмиссионным фильтром 520 нм.
    figure-protocol-10
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-11
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  15. Выберите скважины и поля в каждой скважине, которые будут приобретены, что затем называется параметрами планировки и сублейла.
    figure-protocol-12
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-13
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  16. Создайте файл эксперимента, используя параметры из шагов 2.14 и 2.15 и запустите автоматическое приобретение.
    figure-protocol-14
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
    figure-protocol-15
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  17. Передача изображений на удаленный сервер.
    figure-protocol-16
    Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.
  18. Оценка изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Обнаружить область ячейки от дальнего красного канала с помощью алгоритма интенсивности пикселей и бактериальной области от канала GFP с помощью алгоритма интенсивности пикселей(рисунок 4B).

Примечание: Этот протокол может быть адаптирован для Mtb мутант библиотеки скрининга путем замены соединений мутантов, выражаюющих флуоресцентный белок (один хорошо / один мутант) (Рисунок 1C, см. также Бродин и др. 4). Флуоресцентные мутанты впервые посеяны в скважинах (20 мкл бактериальной суспензии на скважину). Бактерии затем восстанавливаются на 30 мкл клеточной суспензии. После центрифугации при 350 x g в течение 1 мин, пластина инкубируется при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% CO2. Время инкубации и МВД зависят от анализа. Например, для визуализации ранних клеточных явлений, таких как фагосомное подкисление, клетки могут быть инфицированы в течение 2 часов с МВД в диапазоне от 1-20. Лисосомы окрашиваются с помощью красителя Lysotracker при 2 МКМ в течение 1,5 часов при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2, а затем фиксируются либо 10% формалином, либо 4% параформалдегидом (PFA). Конфокальные изображения приобретаются и, наконец, анализируются с помощью скриптов анализа изображений с использованием соответствующих алгоритмов обнаружения лизосом и субклеточнойлокализации 4.

3. Зеленый флуоресцентный белок Экспрессия Микобактерий туберкулеза H37Rv (GFP-H37Rv) Культурные условия

Для длительного хранения, GFP-H37Rv были заморожены в D-PBS (около 1 х10 8 микобактерий на флакон).

  1. Resuspend один замороженный бульон флакон GFP-H37Rv в колбе Erlenmeyer, содержащий 50 мл 7H9 бульон среды дополняется Middlebrook OADC обогащения 10%, глицерол 0,5%, Tween-80 0,05%, и Гигромицин B (50 мкг/мл).
  2. Инкубация 8 дней при 37 градусах Цельсия.
  3. Измерьте OD 600 культуры GFP-H37Rv.
  4. Разбавить GFP-H37Rvкультуры для получения OD 600 и 0,1 в свежем 7H9 бульон среды дополняется Middlebrook OADC обогащения 10%, глицерол 0,5%, Tween-80 0,05% и гигромицин B (50 мкг/мл).
  5. Инкубировать GFP-H37Rv при 37 градусов по Цельсию в течение 8 дней больше, прежде чем использовать для анализа.

4. Человеческие периферические клетки крови моноцитов очистки от цельной крови или Баффи пальто Подготовка

  1. Разбавить мешок крови 2x в 1x D-PBS (без MgCl2 и CaCl2), содержащий 1% FBS.
  2. Изолировать моноциты по градифицации градиента плотности Ficoll на 400 х г в течение 20 мин.
  3. Соберите изолированные моноциты.
  4. Вымойте моноциты 3x с 1x D-PBS (бесплатно от MgCl2 и CaCl2), содержащий 1% FBS центрифугации при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Сосредоточьте клетки до 1 х 107 клеток/мл.
  6. Очистка моноцитов с помощью CD14-магнитных бусин в соответствии с протоколом производителя (см. Материалы).
  7. После очистки CD14-моноцитов, семена клеток на 1,5 х10 6 клеток / мл в RPMI 1640 дополняется 10% FBS и 40 нг / мл человека Макрофаги Колонии Стимулирующий фактор (hM-CSF) и инкубируется в течение 4 дней при 37 градусов по Цельсию в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  8. Через 4 дня замените носитель свежим RPMI 1640, дополненным 10% FBS и 40 ng/ml hM-CSF и инкубированным в течение 2 дней при 37 градусах в атмосфере, содержащей 5% CO2.
  9. Через 6 дней, клетки могут быть использованы для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скрининг siRNA по всему геному с высокой пропускной способностью

Mtb способен колонизировать иммунные клетки в пробирке, а также несколько других клеток эпителия легких. Например, Mtbспособен инфицировать и повредить эпителиальные клетки A549, которые обычно используются в качестве модели для пневмоцитов типа ЧЕЛОВЕКА II5-7. Dectin-1 было сообщено как рецептор клетки хозяина, участие в поглощении Mtb, провоспалительный ответ и антибактериальное возде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь методы, необходимые для фенотипического анализа с помощью GFP-экспрессинг Mtb H37Rv штамм заразить флуоресцентно помечены клетки-хозяина, что делает его подходящим для высокого содержания / высокой пропускной способности экранов. Этот протокол может быть применен к широкому кругу соединений, флуоресцентных зондов и Mtb мутантов. Для каждого описанного выше протокола можно было бы выработать шаги по фиксации и иммунолабелям до получения изображений. Мы используем автоматизированный флу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не заявлен.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансовую поддержку этой работе оказали Европейское сообщество (ERC-STG INTRACELLTB Grant n' 260901, MM4TB Grant n' 260872), Национальное агентство Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и регион Норд Па-де-Кале. Мы с благодарностью признаем техническую помощь Гаспара Делойсона, Элизабет Веркмайстер, Антонино Бонджованни и Фрэнка Лафонта с платформы BICeL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
&микро; прозрачная пластина черная, 384-луночнаяGreiner Bio-One781091127,8/86/15 MM с крышкой, обработанная TC
CellCarrier 384-луночная пластинаPerkinElmer6007550черная, прозрачное дно, с крышкой, обработанная
TC V-образным дном белая, 384-луночная пластинаGreiner Bio-One781280 
уплотнительная лента, дышащая, стерильнаяCorning3345 
Липофектамин RNAiMaxLife Technologies13778150реагент для трансфекции
диметилсульфоксидSigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010Среда для культивирования клеток
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco' s Фосфатно-салиновый буфер
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco' s Фосфат Салин Буфер
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll для периферической очистки моноцитарных клеток крови
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi130-050-201Очистка CD14+ моноцитов
человека M-CSF, премиум гр. (1000 μ g)Miltenyi130-096-493Макрофагальный колониестимулирующий фактор
LS КолонкиMiltenyi130-042-401Колонки для выделения CD14+ моноцитов
Tween 80Euromedex2002-AКультура микобактерий
Глицерин высокой чистоты Euromedex50405-EXКультура микобактерий
  Обогащение Middlebrook OADCBecton-Dickinson211886Культура микобактерий
7H9Becton-DickinsonW1701PКультура микобактерий
Versene 1xLife Technologies15040033Раствор для неферментативной диссоциации клеток
DAPILife TechnologiesD1306Ядра красителя
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Ядерный краситель
Syto60Life TechnologiesS11342Краситель для ядер/цитоплазмы
ФормалинSigma-AldrichHT5014Раствор для фиксации клеток
миРНК, нацеленный на Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* Нецелевой пул миРНК ДхармаконD-001206-14 
РифампицинСигма-ОлдричR3501антибиотик
Изониазид (INH)Сигма-ОлдричI3377-50Gантибиотик
Гигромицин BLife Technologies10687-010антибиотик
АмикацинSigma-AldrichA1774антибиотик
Автоматизированный конфокальный микроскоп OPERAPerkinElmerПолучение изображений
Columbus 2.3.1 Серверная база данныхPerkinElmerПередача, хранение и анализ данных
Acapella 2.6 Программное обеспечениеPerkinElmerАнализ на основе изображений
GraphPad Программное обеспечение Prism5GraphPadСтатистический анализ
Excel 2010MicrosoftStatistical analysis

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Intracellular Mycobacteria QuantificationHigh throughput ScreeningConfocal MicroscopyGFP expressing MycobacteriumHost Cell InfectionsiRNA Library ScreeningChemical Compound ScreeningAutomated Image AnalysisBacterial Area Per CellDose Response Curve

Похожие статьи