ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

Краткое содержание

Описание того, как для калибровки Ферстер резонансный перенос энергии интегрированных биологических сенсоров (FIBS) для на месте метаболического профилирования представлена. В FIBS может быть использован для измерения внутриклеточные уровни метаболитов неинвазивно, помогающих в развитии метаболических моделей и высокопроизводительного скрининга условий биотехнологических.

Аннотация

В эпоху вычислительной биологии, новых высокой пропускной экспериментальные системы необходимы для того, чтобы заполнить и уточнения модели, чтобы они могли быть подтверждено для целей прогнозирования. В идеале такие системы будет низкий объем, что исключает отбора проб и разрушительные анализы, когда данные время курс должны быть получены. Что необходимо, так это в мониторинг Ситу инструмент, который может сообщить необходимую информацию в режиме реального времени и неинвазивного. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации. Один конкретный класс естественных условиях биосенсоров в том, что нашла свое применение в метаболита количественного основана на Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET интегрированных биологических сенсоров (FIBS) конститутивно производимые в клеточной линии, они имеют быстрое время отклика и их спектральную чаracteristics меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. В данной работе метод построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для глюкозы и глутамина и калибровки ФИБС в естественных условиях в культуре пакетном клеток, с тем чтобы в будущем количественную оценку внутриклеточной концентрации метаболита описывается. Данные из подпиткой СНО клеточных культур показывает, что FIBS смог в каждом случае, чтобы обнаружить изменения в результате внутриклеточной концентрации. Использование флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, внутриклеточная концентрация была точно определена как подтверждена независимым ферментативного анализа.

Введение

Мониторинг метаболитов имеет различные применения в биотехнологической, в том числе развития процесса, СМИ и дизайна корма, и метаболической инженерии. Имеются различные методы для измерения концентрации с использованием ферментативных ^1, химического ² или ³ анализах связывания. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации ключевых метаболитов. В ультра-низких анализов объема, флуоресценция является удобным инструментом как миниатюризация действительно улучшает отношение ^4,5 сигнал-шум и датчики на основе белков могут быть генетически закодированы смысл, что никакие внешние реагенты не являются необходимыми для анализа метаболитов. Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) биосенсоры состоят из двух флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET является безызлучательный передача энергии от фотовозбужденной донора к нахо молекулы флуоресцентного акцепторной ред в непосредственной близости (<100). Лиганд расщепление или связывание вызывает конформационное изменение в датчике, который, в свою очередь, вызывает изменение в непосредственной близости от флуорофоров, что приводит к изменению эффективности FRET, измеренной по изменению спектра излучения. FRET интегрированные биологические датчики (ФИБС) конститутивно производимые в клеточной линии и их спектральные характеристики меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. ФИБС имеют быстрое время отклика делает их идеальными для проведения измерений для динамических моделей ^6. Предыдущие применения включают мониторинг одиночные ^7-9 и несколько ¹⁰ метаболитов и предоставление данных о пространственно-временного распределения ^11. ФИБС могут быть созданы в двух конфигурациях: Апо-Max, где обязательным лиганд нарушает близость флуорофорами понижающей передачи энергии и APO-Мин, где обязательным лиганд приносит два флуорофоры в более тесный контакт (рис. 1).

_content "> В этой работе, протокол представлен для построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для метаболита, глюкоза или глутамина. Методология устанавливается для калибровки датчика в естественных условиях, с тем чтобы в будущем количественные измерения внутриклеточной концентрации метаболитов, как представлено на рисунке 2. Исходя из этого, внутриклеточная концентрация глюкозы или глутамина может быть определена в подпиткой СНО клеточных культурах, к которым были добавлены два питательных веществ в высоких концентрациях в процессе. Результаты демонстрируют, что с помощью флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, точно предсказание внутриклеточной концентрации можно, как это было подтверждено независимым ферментативного анализа. Этот метод дает значительные преимущества по сравнению с текущим аналитических технологий, поскольку он является неинвазивным и недорогой и быстро, давая в реальном времени сигнал FIBS, которые могут быть ПНотслеживаться по всей культуре.

Протокол

1. Сотовый Возрождение линия и обслуживание

1. Оживление клеток СНО в 9 мл CD-СНО среде с добавлением 8 мм L-глутамина и 10 мл / л 100x гипоксантин / тимидина дополнения (полной среды роста).
2. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют клеток в 10 мл свежей полной среды роста.
4. Снять образец 1 мл и определения концентрации жизнеспособных клеток с помощью световой микроскопии с использованием трипанового метод исключения синий краситель в гемоцитометре.
5. Инициирование культуры при плотности посева от 3 ​​х 10 ⁵ клеток / мл в 125 мл колбы трясти.
6. Поддерживать культуру в инкубаторе при температуре 37 ° С, влажной атмосфере 5% CO _2, на орбитальном платформы шейкера, вращающейся со скоростью 120 оборотов в минуту.
7. Субкультура каждые 3-4 дня в полной среде роста при плотности посева 2 × 10 ⁵ клеток / мл.

2. Трансфекция клеточной линии с плазмиды Containing биосенсора Gene

1. Подготовка ДНК плазмиды с помощью масштабную набора для очистки плазмиды.
2. Поддержание клеток на соответствующих условиях (37 ° C, 5% CO ₂₎ 12-24 ч до трансфекции, чтобы обеспечить клетки активно делятся на момент трансфекции.
3. Граф клеток с использованием трипанового метод эксклюзионной синий краситель, а затем подготовить рабочий объем 20 мл культуры клеток в 125 мл колбу трясти при концентрации 1 × 10 ⁶ клеток / мл.
4. С помощью подходящего набора для трансфекции для клеточной линии при использовании. Плазмидную ДНК в соотношении реагентов трансфекции будет зависеть от клеточной линии и вектора. Рекомендуется, чтобы это оптимизирован путем тестирования диапазон отношений в диапазоне указанных изготовителем до проведения окончательных трансфекций. Также сохранить хотя бы одно отрицательное культуру управления, содержащий клетки, но нет ДНК.
5. Выдержите в течение 4 дней в статическом режиме, а затем передать в Шекинг платформа вращается на 125 оборотов в минуту.
6. Добавить соответствующий антибиотик для выбора плазмиды до подходящей концентрации, как определено кривой убивать. В этом исследовании зеоцину был добавлен в конечной концентрации 400 мкг / мл для отбора трансфицированных клеток.
7. Изменение носитель в соответствующем временном интервале для клеточной линии, добавив к антибиотикам каждый раз, пока клетки в контрольной лунке, не умерли.
8. Используйте самые сливные колодцы, чтобы прогрессировать до встряхивания культур.
9. Создание банка клеток путем замораживания клеток в криогенных флаконах, содержащих 10 ⁷ жизнеспособных клеток в 1 мл смеси вымораживанием. В этой работе, он состоит из 92,5% ростовой среде и 7,5% диметилсульфоксида.

3. Пакетная и подпиткой Кривая роста клеток

1. Соблюдайте правила эксплуатации, клеток выше, чтобы установить трех экземплярах культуры клеток трансфицированных клетках СНО в 250 мл встряхнуть колбы с рабочим объемом 50 мл.
2. Поддерживать Cultuразрешением в увлажненном инкубаторе клетки при 37 ° С, с 5% CO _2, на орбитальной платформы шейкера, вращающейся со скоростью 125 оборотов в минуту, и удалить 4,1 мл пробы из каждой растущей культуры в 24 час интервалами.
3. Используйте 100 мкл образца для определения жизнеспособного концентрации клеток и клеток жизнеспособность с трипановым синим методом исключения красителя.
4. Повторяйте, пока концентрация жизнеспособных клеток не уменьшается до нуля.
5. Повторите эти действия для культуры с подпиткой клеток дополняя с соответствующим количеством глюкозы или глутамина на 6-й день, чтобы восстановить их концентрации в своих начальных значений 36 мм и 4 мм соответственно. Рекомендуется, чтобы дополнительный контроль культуры также поддерживается, которые должны быть поданы с таким же объемом 12 мл (в данном случае) чистой воды.

4. FRET побед Измерения

1. Принимать по 2 мл суточных проб, демонтированных в действии 3.2 выше и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
2. Resuspсостава осадок клеток в 2 мл охлажденного льдом фосфатно-буферным раствором (PBS). Перевести это в 6-луночный планшет и добавить пустую выборку, не содержащие клеток одной яме.
3. Измерьте уровни синий и желтый флуоресценции сразу на длине волны возбуждения 430/435 нм и эмиссии длинах волн 465/435 нм (синий) и 520/510 нм (желтый).
4. Рассчитать лад отношения (отношение желтой флуоресценции обнаруженного на синем флуоресценции обнаруженного).

5. Метаболитов Анализы

1. Принимать по 2 мл суточных проб, демонтированных в действии 3.2 выше и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
2. Ресуспендируют клеточный осадок в 3 мл охлажденного льдом PBS и центрифуги снова при 100 х г в течение 5 мин.
3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл охлажденного льдом PBS, как описано выше. Разрушать ультразвуком образца 5x в течение 3 мин каждый на импульсе 15 сек на и 15 сек выкл. В этот момент клетки дополнительныйк.т.н. могут быть заморожены при желании.
4. Используйте соответствующий комплект анализа глюкозы в соответствии с инструкциями изготовителя на образцах клеточных экстрактов для определения внутриклеточной концентрации глюкозы (см. таблицу материалов).
   Примечание: Используйте соответствующие стандарты для построения стандартной кривой. В этой работе, концентрация стандартов колебалась в пределах 0-100 мМ.
5. Используя показания для стандартов, построить стандартную кривую и найти линейное уравнение наилучшего соответствия (в данном случае: у = 1310.51x - 723,43 где у показание поглощения и х является концентрация глюкозы).
6. Вычислить концентрацию глюкозы с использованием стандартной кривой и принимая во внимание разбавление. Внутриклеточная концентрация глюкозы может быть рассчитана с использованием этого уравнения:
   
   Для клеток СНО, объем одной клетки были рассчитаны на диаметр ячейки 12 мкм ¹²
7. Используйте соответствующий комплект глютамин анализа в соответствии с инструкциями изготовителя на образцах клеточных экстрактов для определения внутриклеточной концентрации глутамина (см. таблицу материалов).
   Примечание: Используйте соответствующие стандарты для построения стандартной кривой. В этой работе, концентрация стандартов колебалась между 0-2 мм.
8. Как и в 5,5 выше, построить калибровочную кривую (в данном случае у = 203.1x + 17,1, где Y является чтение поглощение и х представляет собой концентрацию глюкозы)
9. С помощью стандартной кривой, рассчитать концентрацию глютамина образцов, принимая во внимание разбавление. Внутриклеточная концентрация глутамина может быть рассчитана с помощью уравнения 1 выше.

Результаты

Обзор методологии представлена ​​на рисунке 2. В работе, представленной в данном документе, клетки СНО, трансфицированных вектором FIBS и стабильных клеточных линий были выбраны при давлении антибиотиками 400 мкг / мл зеоцина. Два отдельных стабильные клеточные линии конституитивно выражающие глюкозы и глютамина датчики поэтому были созданы. На рисунке 1 представлены конфигурации двух биосенсоров, используемых в данном исследовании. Датчик глюкозы на основе Apo-Max принципе и соответств...

Обсуждение

В ФИБС включить в естественных условиях и на месте количественного ключевых молекул, в данном случае ограничивающим рост питательных веществ, удаление неопределенности, вытекающие из закалки и добыча методы. Полученные данные свидетельствуют, что существует хорошая корреляция между FIBS сигнала и внутриклеточных концентрациях в диапазоне 1-5 мм для глюкозы и 0,3-2 мм для глутамина. В пакетном СНО клеточной культуре, эти концентрации встречаются в экспоненциальной, стационарных и ранних фаз упадка. Пока...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Клеточная линия будет варьироваться в зависимости от целей исследования
pCDNA4/TO вектора	Life Tecnologies
TransIT-PRO Реагент для трансфекции	Mirus Bio	MIR 5700	Трансфекция может быть выполнена с использованием любого метода, подходящего для исследуемой клеточной линии
Zeocin	Invivogen
CD-CHO среда	Life Technologies	10743-011	Клеточная среда роста зависит от исследуемых клеток
100x HT Supplement	Life Технологии	11067-030
L-глутамин 200 мМ (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 планшетный ридер	Tecan	FLx800TBI	Любой 96-луночный флуоресцентный планшетный ридер, который может получить доступ к требуемым длинам волн, может быть заменен
Фильтры для планшетного ридера	Tecan	30000463
Maxiprep Набор для очистки плазмид	Qiagen	12163	Любой подходящий набор может быть заменен
Amplex Красный набор для анализа глюкозы/глюкозооксидазы	Invitrogen	A22189	Любой подходящий набор может быть заменен
EnzyChrom  Набор для анализа глютамина	BioAssay Systems	EOAC-100	Любой подходящий набор может быть заменен
Улучшенный гемоцитометр Neubauer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Инкубатор	Nuaire	NU-5510E