Это видео иллюстрирует способ, с помощью клинического 3 T сканера, для контрастированием МР томографии наивным мыши визуальной проекции и для повторяющихся и продольных естественных условиях исследования в зрительного нерва дегенерации, связанных с острым повреждением зрительного нерва на раздавливание и хронической дегенерации зрительного нерва в нокаут-мышей (р50 КО).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных изображений зрительного нерва волокна целостность контрастным усилением МРТ у мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Грызун визуальная система охватывает ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов, которые формируют зрительный нерв, чтобы войти таламическое и среднего мозга центры и постсинаптические прогнозы на зрительной коре. На основе своего специфического анатомического строения и удобной доступности, он стал излюбленным структура исследований по выживаемости нейронов, регенерации аксонов и синаптической пластичности. Последние достижения в области МРТ позволили визуализации в естественных условиях ретинобластому tectal части этой проекции с использованием марганца опосредованной повышение контрастности (MEMRI). Здесь мы приводим протокол MEMRI для иллюстрации визуальной проекции у мышей, которым резолюции (200 мкм) 3 может быть достигнуто с помощью обычных 3 Tesla сканеры. Мы показываем, как инъекция из одного дозировке 15 нмоль MnCl 2 приводит к насыщенному повышения неповрежденной проекции в 24 час. За исключением сетчатки, изменения в интенсивности сигнала не зависятвмятина от совпадали визуальной стимуляции или физиологического старения. Кроме того, мы применить эту технику для продольно контролировать дегенерацию аксонов в ответ на острый зрительного повреждения нерва, парадигма, по которому Mn 2 + транспорт полностью аресты на месте повреждения. С другой стороны, активное Mn 2 + транспорт количественно пропорциональна жизнеспособности, числа и электрической активности аксонов волокон. Для такого анализа мы примером Mn 2 + транспортные кинетики вдоль зрительной пути в трансгенных мышах (NF-kB р50 KO), где отображаются спонтанное атрофию сенсорные, в том числе визуальных, прогнозов. У этих мышей MEMRI указывает снижается, но не задерживается Mn 2 + транспорт по сравнению с мышами дикого типа, обнаруживая таким образом признаки структурных и / или функциональных нарушений на NF-kB мутаций.
Таким образом, MEMRI удобно соединяет в естественных условиях анализов и послеубойную гистологии для characterizatiна целостности нервных волокон и деятельности. Это очень полезно для продольных исследований по дегенерации аксонов и регенерации, и исследований мутантных мышей для подлинных или индуцибельных фенотипов.
Введение
На основе его благоприятного нервно-анатомические структуры грызун визуальная система предоставляет уникальные возможности для оценки фармакологических соединений и их способность быть посредником нейропротекцию 1 или про-регенеративный эффект 2,3. Кроме того, она позволяет исследования по функциональной и нейро-анатомических характеристик мутантных мышей, как это недавно примера для мышей, лишенных пресинаптического строительных лесов белок Фагот 4. Кроме того, широкий спектр дополнительных инструментов дает дополнительные показывая сетчатки ганглиозных клеток (РГК) и РГК чисел аксонов, а также РГК деятельности, например, путем электроретинографии и поведенческих тестов и определения корковых перестроек оптическим визуализации внутренних сигналов. Новейшие технические разработки в лазерной микроскопии позволяют на месте визуализации регенерации РГК глубокой ткани флуоресцентной визуализации в целых монтирования образцов зрительного нерва (ON) и мозга. В этом histologческих подход, тетрагидрофуран основе ткани очистка в сочетании с легкой листовой флуоресцентной микроскопии позволяет решить одиночных волокон, что повторного ввода в деафферентированной ON и зрительного тракта 5. В то время как такие методы могли бы быть выше в разрешении и определения моделей роста, они не позволяют повторяющиеся и продольные анализ отдельных событий роста, которые особенно желательных оценить процесс долгосрочного регенерации.
С контрастным усилением МРТ был использован для минимально инвазивной визуализации проекции ретино-tectal у мышей и крыс 6,7. Это может быть достигнуто путем непосредственного внутриглазной доставке парамагнитных ионов (например, Mn 2 +) к клеток сетчатки. В аналоговых кальция, Mn 2 + включен в РГК somata через напряжения закрытого кальциевых каналов и активно транспортируется вдоль аксонов цитоскелета неповрежденной ON и зрительного тракта. В то время как он накапливается в ядрах мозгавизуального проектирования, т.е. латерального коленчатого тела (LGN) и верхний бугорок (SC), transsynaptic распространения в первичной зрительной коре появляется незначительным 8,9, хотя это может произойти 10,11. Под MR последовательности, парамагнитного Mn 2 + увеличивает MR контраст в основном за счет сокращения T 1 спин-решеточной релаксации 12. Такое Mn 2 + МРТ с (MEMRI) успешно применяется в различных нервно-анатомических и функциональных исследований крыс, в том числе оценки регенерации аксонов и дегенерации после ON травмы 13,14, точное анатомическое отображение ретино-tectal выступа 15 , а также определения аксонов транспортных характеристик после медикаментозного лечения 16. Последние уточнения в лекарственных, токсичности и кинетики нейронных Mn 2 + поглощение и транспорт, а также усовершенствованных протоколов МРТ расширили свое применение в исследованиях по трансгенныхмышей 9 с использованием 3 Tesla сканеры, обычно используемые в клинической практике 17.
Здесь мы представляем MEMRI протокол, подходящий для продольное естественных изображений мыши ретино-tectal проекции и примером его применения на основе оценки Mn 2 + в зависимости усиление сигнала в наивных и различных условиях нейродегенерацию. Наш протокол ставит конкретную акцент на сбор данных MR в умеренном 3 T магнитного поля, что, как правило, более доступны, чем выделенных сканеров животных. В наивных мышей, мы проиллюстрируем, как интенсивность сигнала тракта конкретных может быть существенно и воспроизводимо стать увеличилось после стекловидное тело (ivit) Mn 2 + приложения. Количественно, Mn 2 + распространения вдоль зрительной проекции происходит независимо от нормального процесса старения (измеряется от 3 до 26-месячным мышам) и приумножение не поддается визуальной стимуляции и адаптации к темноте. В противоположность этому, Mn 2 + обогащение таламуса и среднего мозга центров уменьшается после острого НА травмы раздавить 18, а также в nfkb1 нокаут-мышей (р50 KO) страдает от спонтанного апоптоза РГК смерти и ПО дегенерации 19. Таким образом, в расширении к обычной гистологического анализа, продольный MEMRI анализ отдельных животных позволяет профилирование уникальных кинетики нейродегенеративных процессов. Это должно оказаться полезным для исследований по нейропротекции и регенерации аксонов, связанных с фармакологическими или генетических вмешательств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все вмешательства животных проводятся в соответствии с Европейской конвенцией по уходу за животными и использованию лабораторных животных и Заявление о ARVO для использовании животных в офтальмологической и Vision Research. Все эксперименты одобрено местным комитетом по этике. Порядок НА травмы у мышей описан в другом месте 9.
1. Интравитреальных Марганец впрыска
- Выполните Mn 2 + инъекции через 24 часа перед МР сканирование с помощью ассистента. Обезболить животных путем внутрибрюшинной инъекции 5% раствора хлоралгидрата (420-450 мг / кг массы тела в стерильном PBS). Для получения дополнительной местной анестезии, применить одну каплю жидкого conjuncain (гидрохлорид оксибупрокаина 0,4%) к роговице до глаз прокол. Чтобы придать 15 нмоль Mn 2 + в глазу подготовить мМ MnCl решение в 7,5 2, например, путем разбавления 1 л 1 М MnCl 2 маточного раствора в 132 LH 2 </ Суб> О. Нагрузка 5 мкл окончательного решения в шприц 5 мкл Hamilton, подключенного к 34 G небольшой ступицы съемной иглой (РН иглы).
- При запуске с правого глаза, поместите курсор левосторонней под бинокулярным микроскопом и осторожно открытия и исправления правый глаз между большим и указательным пальцами левой руки. Возьмите шприц в правой руке и завладеть иглы недалеко от чаевых. Для атравматичной прокола глаза лампой, осторожно вставьте иглу в стекловидное тело в InFero-временной окружности около 1 мм дистальнее лимба, избавив склеры сосуды.
- Далее, заместитель медленно относится общий объем 2 мкл, контролируя при этом масштаб шприца Гамильтона. Во время этой процедуры, следить за оптимальное размещение иглы под микроскопом и избежать пункцию объектив или разлив жидкости. Хранить иглу статически, вставленный в течение дополнительных 30 секунд, а затем вывести его медленно, чтобы минимизировать жидкостиутечки из места инъекции.
- Во время процедуры, особое внимание следует уделить, чтобы избежать давления на глаза. Кроме того, избегать резких или многочисленные попытки проколоть глаз лампу. С Mn 2 + поглощение в РГК и транспорта вдоль ON уже насыщен на 15 нмоль MnCl 2, это сводит к минимуму изменения сигнала на несколько неточных объемов закачки. Для двустороннего усиления сигнала визуального проектирования, повторите процедуру инъекции для левого глаза.
- Применение офлоксацин, содержащих (3 мг / мл) и глазные капли, содержащие пантенол мазь один раз после процедуры, чтобы предотвратить глазные инфекции и сушку глаза. Возвращаемое мышей в их клетки в нормальных жилищных условий до начала MR сканирования.
2. Животное Подготовка к МРТ
- Обезболить мышь администрацией 2% / 98% газовой смеси в изофлюран / кислорода. Установите курсор на держателе мыши в почти горизонтальном, раскрученного положении. InsERT она в МР катушку, которая затем доводили внутри МР-томографа. Монитор дыхания и частоты сердечных сокращений по соответствующих систем. Технические подробности см. Херрманн и др. 20.
- Во время МРТ, поставка анестезии путем непрерывного вдувания первоначально 1,5% / 98,5% смеси изофлуран / кислород газа через испаритель, подключенного к держателю головной мыши с помощью интегрированного трубки. Во время сканирования, настроить глубину анестезии в соответствии с записанными жизненно важных параметров (то есть стремиться к стабильной частоты дыхания около 40 вдохов в минуту). Использование нагревательного устройства поддерживать температуру поверхности тела стабильную между 35 и 37 ° С, как измерено датчиком температуры, расположенным в брюшной сайта мыши. Технические подробности см. Херрманн и др. 17.
- После сканирования, освободить мышь из держателя и поставить с чистым кислородом, чтобы ускорить восстановление после анестезии. Кроме того, поддерживать температуру тела стабильным с помощьюкрасный свет источник нагрева.
3. МРТ протокол
- Протокол проверяется для Tesla сканера 3, оснащенной специальной, SNR-эффективной, небольшой катушкой животных (линейно поляризованным Литцендрат катушки) с эффективным поле зрения 35 мм × 38 мм в диаметре. Используйте катушку в приемопередающей режиме.
- С животного в конечное положение, отрегулировать настройки и матч катушки с помощью частотного анализатора. Ручная регулировка опорного напряжения передатчика и прокладка токи для оптимизации однородности и качества изображения.
- Приобретать T 1, взвешенных изображений 2D TSE с разрешением 0,5 мм × 0,5 мм × 2 мм в сагиттальной и поперечной зрения планирования. Используя планирования МР сканирование, приобрести изображения МЭМР в корональной направлении измерения, поворачивается, чтобы быть параллельным головы животного с фазовым кодированием вдоль влево-вправо. Чтобы свести к минимуму время приема, использовать прямоугольную поле зрения доводят дофактические размеры головы. Применять испорченный последовательность 3D FLASH (VIBE 3D), используя следующие параметры: базовой матрицы 256, поле зрения 54 мм × 50,65 мм × 14,08 мм, с использованием 93,8% прямоугольную поле зрения в фазовом направлении кодирования, и 128 ломтики 0,11-мм толщина среза с разрешением среза установлен в 61%.
- Активируйте интерполяции в плоскости для создания окончательного изображения с 512 × 480 × 128, обеспечивая эффективное разрешение 0,21 мм × 0,21 мм × 0,18 мм (0,1 мм × 0,1 мм × 0,09 мм с интерполяцией), эхо времени T E = 6,51 мс, время повторения Т R = 16 мс, пропускная способность = 160 Гц / PX, флип угол = 22 °. Нанесите два средних и три повторения для достижения общего времени приобретения (Т A) около 30 мин.
4. МРТ Анализ данных
- Анализ данных с помощью программного обеспечения Syngo fastView. Для количественного усиления сигнала, выберите определенные регионы ое интерес к 2D плоских МРТ записей и определения интенсивности сигнала (SI) из расширенной структуры (СИ MEMRI), ткани фоне (СИ предпосылка) и стандартное отклонение шума (SD N). В случае необходимости, использовать мышь мозга атлас для облегчения нервно-анатомические ориентацию для LGN и SC структур. Рассчитать отношение контраст-шум (CNR), используя формулу:
- CNR = (СИ MEMRI - С.И. предпосылка) / SD N
- Количественная три последовательных изображений для среднего расчета CNR для каждого образца. В двустороннем порядке вводили животных, анализировать каждое полушарие самостоятельно.
- Для изображением горизонтальных, фронтальной и сагиттальной изображений, рассчитать многоплоскостной реконструкции из исходного набора данных 3D МРТ. Эти обработанные изображения не рекомендуются для количественного анализа. Для создания анимированных 3D реконструкции (максимальные прогнозы интенсивности, MIPS) на Retino-Tectal проекция, использовать пост-обработки программный модуль ангиографии.
5. Mn 2 + Autometallography (TIMM Окрашивание)
- Для Тимм окрашивания Mn 2 + прослеживается структур мозга следующей MEMRI, придать дозировку 15-150 нмоль Mn 2 + ivit 24 часа в сутки до визуализации.
- После того, как MR сканирования, заливать животных с 30 мл ледяной 0,325% Na 2 S в PBS (рН 7,4). Проанализируйте сетчатки и образцы заморозить в ледяной разделе.
- Вырезать последовательные, экваториальные участки 15 толщиной мкм на замораживающий микротом.
- Выполните Тимм окрашивание 21 при отсутствии фиксатора и криозащиты согласно Angenstein др. 22.
6. Статистический анализ
Выполните статистический анализ с использованием Т-теста Стьюдента для отдельных сравнений, а затем постфактум ANOVA. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Отдельные номера N являютсядаются отдельно для каждого эксперимента. Результаты идущие P ≤ 0,05 считаются статистически значимыми (р ≤ 0,05, *, р ≤ 0,01, **, р ≤ 0,001, ***).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Способность этого метода воображения, чтобы точно оценить жизнеспособность и функциональность визуального проектирования опирается на точного применения нетоксичной Mn 2 + дозировке в стекловидное тело и его поглощением РГК. Этот крупный предположение проверяется на рисунке 1, где слой конкретных Mn 2 + поглощение чем свидетельствует autometallography (окрашивания TIMM) 21. Retina разделы были проанализированы в 24 часов после ivit применения либо 15 нмоль или 1...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
MEMRI зрительной системы распространяется обычные нейробиологические методики для оценки функциональности под наивных и патологических состояний. Помимо предоставления уникальную возможность заглянуть в целостности изолированной ЦНС волокна тракта, MEMRI может быть легко дополнен поведенческих тестов, например, оптометрии и задач воды визуально основе, для расследования непосредственных последствий данной парадигмы для зрительного восприятия. Он также связывает электрофизиологических и гистологических исследова...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
АК поддерживается Oppenheim фонда и относительной влажности поддерживается Фондом Velux. Мы благодарим I. Krumbein технической и К. Будер для гистологического поддержки, Дж. Гольдшмидт (Лейбниц Институт нейробиологии, Магдебург, Германия) для технических консультаций по окрашиванию Тимм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Раствор хлорида марганца (II) 1 M | Sigma Aldrich, Тауфкирхен, Германия | M1787 | MEMRI контрастный реактив |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Берлин, Германия | PZN 7617666 | 0,4% оксибупрокаина гидрохлорид |
| Флоксаль глазные капли | Dr. Mann Pharma, Берлин, Германия | PZN 3820927 | 3 мг/мл офлоксацина |
| Мазь пантенол | Jenapharm, Йена, Германия | PZN | |
| Хлорал гидрат | Sigma Aldrich, Тауфкирхен, Германия | C8383 | 420-450 мг/кг массы тела |
| Шприц Hamilton | Компания Hamilton, Рино, Невада, США | 7634-01 | SYR 5 &микро; l, 75 RN, без иглы NDL |
| 34 G (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Рино, Невада, США | 207434/00 | съемная игла RN, 34 G, длина 38,1 мм, тип острия 4 |
| Бинокль Stemi-2000 | Zeiss, Оберкохен, Германия | ||
| 3 Т МРТ сканер Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Эрланген, Германия | ||
| Катушка для крысиной головы | Doty Scientific Inc., Колумбия, Южная Каролина, США | ||
| Держатель | на заказ | ||
| Лампа | |||
| Замороженный профиль средний NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия | 6502 | встраивание ткани для криосекций |
| Моногидрат дигидрофосфата натрия (2PO4· H2O) | Merck, Darmstadt, Германия | 106346 | для сульфидной перфузии |
| Нонагидрат сульфида натрия (Na2S· 9H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Германия | 208043 | |
| Gum arabic | Roth, Arlesheim, Швейцария | 4159 | для окрашивания гидрохинона TIMM |
| (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Лимонная кислота (C6H8O7)Roth | , Arlesheim, Швейцария | 6490 | |
| Дигидрат цитрата натрия дигидрат (C6H5Na3O7· 2H2O) | Merck, Darmstadt, Германия | 106448 | |
| Нитрат серебра (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 |
Ссылки
- Kretz, A., et al. Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo. Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).
- Lima, S., et al. Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice. Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).
- Lima, S., et al. Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).
- Goetze, B., et al. Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons. Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).
- Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
- Pautler, R. G., et al. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Magn Reson Med. 40, 740-748 (1998).
- Watanabe, T., et al. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn2+-induced contrast. Magn Reson Med. 46, 424-429 (2001).
- Pautler, R. G. In vivo, trans-synaptic tract-tracing utilizing manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). NMR biomed. 17, 595-601 (2004).
- Haenold, R., et al. Magnetic resonance imaging of the mouse visual pathway for in vivo studies of degeneration and regeneration in the CNS. Neuroimage. 59, 363-376 (2012).
- Lindsey, J. D., et al. Magnetic resonance imaging of the visual system in vivo: transsynaptic illumination of V1 and V2 visual cortex. Neuroimage. 34, 1619-1626 (2007).
- Bearer, E. L., et al. Role of neuronal activity and kinesin on tract tracing by manganese-enhanced MRI (MEMRI). Neuroimage. 37, Suppl 1. S37-S46 (2007).
- Mendonca-Dias, M. H., et al. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Semin Nucl Med. 13, 364-376 (1983).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the optic visual pathway and optic nerve injury in adult rats. J Magn Reson Imaging. 22, 492-500 (2005).
- Sandvig, I., et al. In vivo MRI of olfactory ensheathing cell grafts and regenerating axons in transplant mediated repair of the adult rat optic nerve. NMR biomed. 25, 620-631 (2012).
- Chan, K. C., et al. In vivo retinotopic mapping of superior colliculus using manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Neuroimage. 54, 389-395 (2011).
- Chan, K. C., et al. In vivo chromium-enhanced MRI of the retina. Magn Reson Med. 68, 1202-1210 (2012).
- Herrmann, K. H., et al. Possibilities and limitations for high resolution small animal MRI on a clinical whole-body 3T scanner. Magma. 25, 233-244 (2012).
- Villegas-Perez, M. P., et al. Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats. J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).
- Takahashi, Y., et al. Development of spontaneous optic neuropathy in NF-κΒ50-deficient mice: requirement for NF-κΒp50 in ganglion cell survival. Neuropathol Appl Neurobiol. 33, 692-705 (2007).
- Herrmann, K. H. P., et al. MRI compatible small animal monitoring and triggering system for whole body scanners. Z Med Phys. 24, 55-64 (2013).
- Danscher, G., Zimmer, J. An improved Timm sulphide silver method for light and electron microscopic localization of heavy metals in biological tissues. Histochemistry. 55, 27-40 (1978).
- Angenstein, F., et al. Manganese-enhanced MRI reveals structural and functional changes in the cortex of Bassoon mutant mice. Cereb cortex. 17, 28-36 (2007).
- Thuen, M., et al. Manganese-enhanced MRI of the rat visual pathway: acute neural toxicity, contrast enhancement, axon resolution, axonal transport, and clearance of Mn(2). J Magn Reson Imaging. 28, 855-865 (2008).
- Lehmann, K., et al. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restor Neurol Neurosci. 30, 161-178 (2012).
- Takeda, A., et al. Manganese transport in the neural circuit of rat CNS. Brain Res Bull. 45, 149-152 (1998).
- Nairismagi, J., et al. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging of mossy fiber plasticity in vivo. Neuroimage. 30, 130-135 (2006).
- Smith, K. D., et al. In vivo axonal transport rates decrease in a mouse model of Alzheimer's disease. Neuroimage. 35, 1401-1408 (2007).
- Berkowitz, B. A., et al. Noninvasive and simultaneous imaging of layer-specific retinal functional adaptation by manganese-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2668-2674 (2006).
- Schnapf, J. L. B. D. A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am. 256 (8), (1987).
- Yu, X., et al. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Sun, S. W., et al. Noninvasive topical loading for manganese-enhanced MRI of the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 3914-3920 (2011).
- Sun, S. W., et al. Impact of repeated topical-loaded manganese-enhanced MRI on the mouse visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 4699-4709 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
