Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Склонение Myointimal гиперплазия против атеросклероза у мышей: Введение двух допустимых моделей

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51459

⸱

14 мая 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, Cardiovascular Research Center, University Hospital Hamburg, 2Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK University Hamburg, 3Department of Cardiovascular Surgery, University Heart Center Hamburg, 4Center for Interventional Vascular Therapy, Division of Cardiology, Columbia University, 5Cardiovascular Research Foundation, New York, 6Karolinska Institute, Stockholm, 7Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University School of Medicine, Falk Cardiovascular Research Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это видео показывает две модели развития бляшек интимы в мышиных артерий и подчеркивает различия в myointimal гиперплазии и атеросклероза.

Аннотация

Различные IN VIVO модели лабораторных грызунов для индукции стеноза артерии были созданы, чтобы имитировать заболеваний, которые включают артериальную образование бляшек и стеноза, как это наблюдается, например при ишемической болезни сердца. Два очень воспроизводимые модели мыши - как в результате чего стеноза артерии, но каждый, лежащие в основе другой путь развития - вводятся здесь. Модели представляют собой две наиболее распространенные причины стеноза артерии; а именно одна модель мыши для каждого myointimal гиперплазии и атеросклероз показаны. Чтобы вызвать гиперплазию myointimal, баллонный катетер травма брюшной аорты выполняется. Для развития атеросклеротической бляшки, ApoE - / - модель мыши в сочетании с западной жирной диете используется. Различные варианты модели приспособлены для измерения и оценки результатов названы и описаны в этой рукописи. Введение и сравнение этих двух моделей обеспечивает информаион ученым выбрать подходящий артерии стеноз модель в соответствии с научной вопрос, заданный.

Введение

В промышленно развитых странах ишемическая болезнь сердца остается основной причиной смертности 1. Причины стеноза коронарных артерий, весьма разнообразны и включают в себя myointimal гиперплазии, а также атеросклероза, с реваскуляризации оставшегося наиболее распространенные стратегии лечения 2. Исследовательских моделей, которые четко отличают между механистической путей гиперплазии интимы и атеросклероз имеют важное значение для расследования патобиологические и патофизиологические процессы в развитии артериальной бляшки. В этом видео две различные модели мыши используются для изучения либо развитие myointimal гиперплазии или атеросклероза вводятся.

Myointimal гиперплазия постулируется, чтобы сформировать с помощью "ответ-на-травмы" парадигмы первоначально описанной для атеросклероза 3. Механическое разрушение эндотелиальный слой приводит к интенсивному ремоделирования усиливается паракринных эффектов. Есть несколько диразличны х животных моделях обычно используется для изучения myointimal гиперплазии. Некоторые группы используют металлические устройства в восходящей аорты крыс 4. Аорты оголение модель выполнена с баллонного катетера также широко используется в лабораторных крыс 5,6. Гиперплазия интимы модель выполняется в лабораторных мышей 7 реализует лигирование сонной артерии и вызывает myointimal поражений 8. В нашей лаборатории, брюшной аорты модель оголение - изучить развитие myointimal гиперплазии, - а также модель гуманизированный рестеноза стента 9 обычно используются. Это видео подчеркивается, что выбор надлежащего экспериментальную животную модель имеет решающее значение для механистической или патофизиологических исследований стеноза артерии.

Myointimal модели гиперплазия следует отличать от моделей атеросклероза. Что касается последнего, аполипопротеина Е-дефицитных (ApoE - / -) мышей в сочетании с западной диеты, как правило, используется, чтобы вызвать atherosclэротические поражения 10,11,12,13. Примеры индукции оба из этих типов myointimal заболевания у мышей показано здесь, вместе с различных модельных адаптированных вариантов для анализа сосудов стеноз 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные работа должна проводиться в соответствии с соответствующими руководящими принципами по уходу за животными. Получить институциональной разрешение на животных работе до протоколу начало.

1. Myointimal гиперплазия Модель (А)

Для гиперплазии модели интимы, приобрести C57Bl/6J (инвентарный номер 000664, C57BL/6J) мышей в возрасте 8 недель с массой тела около 25 г. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышей стандартное чау-чау мыши и предоставить воду по желанию.

  1. Подготовка Мышь: Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру.
    1. Снимите брюшной волосы с помощью волос триммер, лежал мышь на спину и покрыть его нос и рот маски для лица для обеспечения анестезии.
    2. С Прово-йод, дезинфекции области живота универсально, а затем 80%-ного этанола, в двух циклах.
    3. Убедите отсутствиерефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
    4. Отделите кожу и мышцы вдоль белой линии в два этапа по разоблачению органы брюшной полости.
    5. Положите кишечник в солевом увлажненной перчатки. Оберните перчатку вокруг кишечника, чтобы держать их влажными.
    6. Внимательно убрать жировую ткань листового материала брюшной аорты. Expose инфраренальной аорты вплоть до ее бифуркации, стараясь не травмировать любом отделении суда.
    7. Во-первых, разместить микрохирургической зажим на проксимальных, инфраренальной аорты закрыть кровоток. Теперь, нанесите второй дистальный зажим рядом с бифуркации аорты.
    8. Когда кровоток прерывается, сделать небольшой разрез в аорту, близкой к проксимального зажима.
    9. Вставьте воздушный шар наконечником катетера, который был увлажненной 0,9% солевой раствор, и продвигать по направлению к дистальному зажима аорты.
    10. Для повреждение эндотелия, оголять аорту, раздувая Ballooн осторожно и медленно вытягивать катетер в направлении проксимального зажима.
    11. Повторите денудации маневр дважды.
    12. Снимите катетер и закрыть аорты разрез с помощью 10-0 PROLENE эксплуатационные швов.
    13. Осторожно открывают дистальный зажим. В случае кровотечение в aortotomy сайта, закройте зажим снова обнаружить кровотечение и разместить дополнительные прерванные швы, по мере необходимости.
    14. Если нет кровотечения не наблюдается, медленно откройте ближний зажим.
    15. Аортальный импульс должен быть виден в дистальном направлении от разреза. Теперь кишечник могут быть организованы назад на месте.
    16. Промойте брюшной полости с использованием подогретого стерильного физиологического раствора.
    17. Закройте брюшная стенка начиная с мышечного слоя с использованием 6-0 проленовой эксплуатационные швов.
    18. Следующая адаптировать кожу под использование 5-0 PROLENE выполнения текущих швов.
    19. Во время мышь все еще под наркозом, применять 4-5 мг / кг Carprofen через подкожной Injeводств.
    20. Добавить метамизол к питьевой воде (50 мг метамизол на 100 мл) для контроля боли и продолжают в течение 3 дней после операции. Монитор животное в течение восстановления.
      Примечание: Период наблюдения для этой модели составляет 28 дней.

2. Атеросклероз модели (B)

Для модели атеросклероза, приобрести недостатком алипопротеина (ApoE - / -) мышей (инвентарный номер 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) в возрасте 4 недель, а затем подается в течение 4-6 месяцев. Мышей Дом на этих экспериментов в обычных условиях; кормить мышам высокую липидный западную диету по прибытии (Харлан лаборатории TD.88137) и обеспечить воду без ограничений в течение от 4 до 6 месяцев.

  1. Подготовка Мышь:
    1. Поток ApoE - / - мыши с западной диеты, начиная с 4-недельного возраста. Диетические манипуляции следует начинать непосредственно по прибытии.
    2. Поддерживать западную диету в течение продолжительности эксперимента.

3. Анализ

  1. Myointimal модель гиперплазия (А)
    Область интереса к этой модели является "поражение площадь". Варианты анализа включают в себя просвета облитерации, отношение I / M (отношение интима / медиа), максимальная толщина myointima, myointimal область, Trichrome окрашивание фиброза и H & E окрашивание на мононуклеарных клеток (как показано на фиг.1А-1С). Согласно научным вопросом многие другие окрашивания как Picrosirius красный для коллагена, иммуногистохимии и конфокальной методов могут быть применены.
  2. Атеросклероз модель (B)
    Области интереса к этой модели аортальный клапан, дуги аорты, а также нисходящей аорты. Опции для анализа: Судан красный окрашивания для липидов и трехцветный окрашивания аортального клапана, дуги аорты и нисходящей аорты (как показано на рисунке 1D).
    Эта модель также дает множество других вариантов окрашивания, какнапример нефтяной Red О нейтральных липидов, Picrosirius красный, иммуногистохимии и конфокальной методов.
    1. Красный окрашивание Судан: Выполните красную окраску Судан на свеже собранного аорты ткани.
      1. Снимите диеты 6h до сбора урожая.
      2. Представьте мышь, чтобы анестезирующего государства изофлураном (2%) с использованием индукции камеру. Убедите отсутствие рефлексов, зажимая задней конечности следить за достаточной глубины анестезии.
      3. Откройте сундук; отрезать верхушки сердца и заливать через левый желудочек, сначала насыщенным раствором соли (3 мл), а затем 4% PFA (3 мл) через корня аорты, чтобы зафиксировать аорты.
      4. Освободите аорту от корня к ее бифуркации. Попробуйте удалить жировой ткани как можно больше.
      5. Отрежьте сердце и корня аорты, и хранить их в 4% PFA для гистологии.
      6. Для гистологии корень аорты должен тщательно быть помещены в парафиновый блок в вертикальном положении, чтобы позволить вырубку ЗОтик корень генерирующие слайды, которые отображают все 3 клапанных листовки.
      7. Отрежьте один конец аорты дерева и исправить ее на силиконового слоя с мелкими контактов. Откройте аорты в продольном направлении и зафиксировать аорты ткани.
      8. Промыть ткань с 50%-ным этанолом. Погрузите ткань с Судан III красящим раствором в течение примерно 15 мин.
      9. Промойте слегка с 50% этанола, чтобы удалить избыток Судан III. (Примечание: 50% этанола может вымыть краску прочь.) Промыть дН 2 O, и сделать фотографии для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показаны различные варианты анализа и индуцированное болезненное состояние для обеих моделей. Для модели гиперплазии интимы, анализ представительств сечений в трихромом окрашивания показана. Из этих сечений, результаты, как в / м нормативов, максимальной толщиной бляшек, максимальной толщиной интимы в просвете, просвета уничтожения в процентах, а также площади бляшки могут быть измерены и рассчитаны.

Чтобы оценить результаты модели атеросклероза, все методы, наз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя оба заболевания приводят к похожими симптомами у пациента, основные механизмы развития бляшек и, следовательно, подходы к лечению очень разные 2. В различных формах стеноза артерии клинические результаты у больных, а также временные рамки развития бляшки зависит от базового механизма.

В зависимости от результатов клинического осмотра у пациента, различные методы анализа проб должны быть выполнены 5,15. Необходимо адаптировать анализ с характерными находками в болез...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Кристиана Pahrmann для оказания технической помощи. СС получил финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 и SCHR992/4-2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тиогликоллатный бульон 3%Fluka70157порошок
PFA 4%Электронная микроскопия Науки#157135S20%
раствор для окрашивания Sudan IIISigma AldrichS4131порошок
мыши C57BL/6JJackson LaboratoriesStock # 0006664
мышь ApoE -/-JacksonLaboratoriesStock #002052
Western DietHarlan LaboratoriesTD.88137
машинка для стрижки волосWAHL8786-451A ARCO SE
ForeneAbbottIsoflurane
микрохирургический зажимFine Science Tools18055-04Micro-Serrefine -
4 мм аппликатор зажимаFine Science Tools18056-14
катетер
10-0 проленовый шовный материалEthicon788G
6-0 проленовый шовный материалEthicon8709H
5-0 проленовый шовный материалEthiconEH7229H
РимадилPfizerКарпрофен
Метакам 1,5 мг/млBoehringer IngelheimMetamizol

Ссылки

  1. Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
  2. ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
  3. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
  4. Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
  5. Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
  6. Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
  7. Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
  8. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  9. Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663(2012).
  10. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
  11. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
  12. Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
  13. Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
  14. Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
  15. Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
  16. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
  17. Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель атеросклерозабаллонная катетеризациямыши с нокаутом гена ApoEкормление диетой с высоким содержанием жиров (Western diet)операция по повреждению аортыгистологический анализокрашивание Судан Редкомпьютерная морфометрияизмерение сужения просвета сосуда
Склонение Myointimal гиперплазия против атеросклероза у мышей: Введение двух допустимых моделей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.