Method Article

Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать Эпидермальный стафилококк И Mycobacterium Marinum Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

DOI:

10.3791/51649

⸱

June 26th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это видео статье описывается высокую пропускную трубопровода, которая была успешно создана, чтобы заразить и анализировать большое количество эмбрионов рыбок данио, обеспечивающих новый мощный инструмент для соединения тестирования и лекарственных препаратов с использованием целый животных позвоночных организм.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио становятся ценным инструментом в доклинической фазе показы новых лекарственных препаратов в целом животной модели с высокой пропускной возможности скрининга. Они могут быть использованы для преодоления разрыва между сотовыми основе анализов на ранних стадиях и в естественных условиях проверки в моделях млекопитающих, уменьшая, таким образом, число соединений, проходящих через к тестированию на гораздо более дорогих моделях грызунов. В этом свете, в настоящем рукописи описывается новый высокую пропускную трубопровода с использованием данио, как в естественных условиях модельной системы для изучения эпидермального стафилококка и микобактерий Marinum инфекции. Эта установка позволяет поколение и анализ большого количества синхронных эмбрионов равномерно инфицированы. Кроме того, гибкость трубопровода позволяет пользователю легко реализовать другие платформы для улучшения разрешающей способности анализа при необходимости. Сочетание данио вместе с инновационной высокой пропускной TEchnologies открывает поле проверки на наркотики и открытия новых возможностей не только из-за прочности с помощью целого животную модель, но также из-за большого количества трансгенных линий, доступных которые могут быть использованы, чтобы расшифровать механизм действия новых соединений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сегодняшний день данио (Danio рерио) было успешно установлено в качестве эффективной модели для изучения различных инфекционных заболеваний 1. Данио эмбриона предлагает уникальный возможностей в естественных изображений из-за их прозрачности и большого количества существующих трансгенных репортерных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки. Это мощное сочетание позволяет отслеживать различные типы иммунных клеток во времени при взаимодействии с патогенов, таких как микобактерии Marinum, ближайшего родственника М. туберкулез 2 или эпидермальный стафилококк, главный причинным биоматериала, связанной инфекции 3-5. Различные маршруты инфекции могут быть использованы в эмбрионов данио рерио в зависимости от целей исследования 6.

Один из этих инфекционных маршрутов желток инъекции бактерий. Главное преимущество этого метода по сравнению с другими является то, что желток Infectiна может выполняться автоматически с помощью роботизированной инъекции, значительно уменьшая время впрыска и позволяет высокую воспроизводимость инфекции 7, 8.

Предыдущая работа, с использованием данио как высокой пропускной в естественных условиях модельной системы для изучения S. эпидермальный и М. Marinum инфекции показали, чтобы быть успешным 7, 8. Эта система способна для выявления прогрессирования заболевания через робота инъекции желтка из ранних эмбрионов и с помощью флуоресцентной считывания в качестве меры для бактериальной нагрузки. В соответствии с этим понятием, эта установка была оптимизирована и создана высокоэффективная высокую пропускную трубопровода с потенциалом генерировать большое количество равномерно инфицированных эмбрионов и отслеживать прогрессирование инфекции во время после лечения ряда соединений. Установленном установки можно генерировать до 8000 синхронных эмбрионов на экрандля прогрессирования заболевания, обработка таким образом до 2500 эмбрионов в час. Эмбрионы сортируются в зависимости от их бактериальной нагрузки с помощью автоматизированной системы, обеспечивая однородных групп инфицированных личинок. Кроме того, для проверки настройки, эффекты ссылкой известные предотвратить прогрессирование туберкулеза у млекопитающих были протестированы на эмбрионах, инфицированных M. штамм Marinum E11 или более опасной М штамм 9.

Это исследование подробно описывает высокую пропускную трубопровод, который был создан, чтобы быть в состоянии генерировать большое количество инфицированных эмбрионов и последующий анализ бактериальной прогрессии во время развития и после обработки соединением.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Штаммы бактерий и условия роста

  1. Подготовьте С. эпидермальный Инокулят
    1. Возьмите несколько отдельных колоний от S. штамм эпидермальный O-47, содержащий pWVW189 получены mCherry вектор экспрессии (De Boer L. не опубликовано) от Luria Bertani (LB) агаром с добавлением 10 мкг / мл хлорамфеникола и культуры в течение ночи при 37 ° С в 25 мл LB среды с добавкой 10 мкг / мл хлорамфеникола, чтобы midlog этап.
    2. Центрифуга 1 мл культуры при 12000 х г в течение 1 мин и впоследствии мыть их 3x с 1 мл стерильной фосфатным буферным раствором (PBS) с 0,3% (объем / объем) Твин-80.
    3. Измерение оптической плотности при 600 нм (OD 600), и разбавленный бактериальной суспензии к OD 600 0,3 в 2% (вес / объем) поливинилпирролидона 40 (ПВП 40) в PBS. Примечание: OD 600 0,3 соответствует 1,0 х 10 8 колониеобразующих единиц / мл (КОЕ / мл).
  2. Подготовка М. Marinum Инокулят
    1. Возьмите несколько отдельных колоний от М. Маринум штамм M или E11, содержащая вектор pSMT3-mCherry, стабильно экспрессирующих mCherry 10 из чашки с агаром Миддлбрук 7H10 с 10% (об / об) Миддлбрук OADC обогащение с добавлением 50 мкг / мл гигромицину и культуры в течение ночи при 28 ° С в 10 мл Миддлбрук 7H9 бульона с добавлением 10% (объем / объем) Миддлбрук АЦП обогащения, дополненной 50 мкг / мл гигромицину.
    2. Центрифуга 1 мл культуры при 12000 х г в течение 1 мин и впоследствии мыть 3x с 1 мл стерильной PBS с 0.3% (объем / объем) Твин-80.
    3. Измерить OD 600, и разбавленный бактериальной суспензии к OD 600 0,3 в 2% (вес / объем) ПВП 40 в PBS. Примечание: OD 600 из 1 соответствует 1,0 х 10 8 КОЕ / мл.

2. Подготовить рыбок данио яиц

  1. Поместите максимум 70 мужских и 50 женских дикого тире данио отдельно в большой племенной судна. Примечание: Поместите женского рыбу в нижней части толстой размножения судна.
  2. Снимите разделитель на следующий день утром, чтобы позволить данио начать размножение.
  3. Сбор яйца в нижней части толстой размножения судна через яйцо коллектора в 50 мл трубки, заполненной водой яиц (60 мкг / мл мгновенного океан морской соли).

3. Инъекционных игл

  1. Получение коммерчески доступные на заказ стеклянных капилляров иглы с внутренним диаметром 10 мкм.

4. Экспериментальная План инъекций

  1. Кипятите 100 мл 1% (вес / объем) агарозные в яичном воды и прохладный примерно до 40 ° С. Налейте агарозы в автоматизированной microinjectors пластины и поместите на себе печать 1024-а в агарозы. Примечание: пластина готова использовать при охлаждении.
  2. На автоматизированной microinjector операционной программного обеспечения нажмите на кнопку "Калибровка этап ',затем нажмите на сетке а '1024 'и поместите агарозном пластину в microinjector и откалибровать пластину, нажав на экране на центральной позиции хорошо.
  3. К «меню иглы» и нажмите на кнопку "держателя калибровку иглы».
  4. Заполните инъекционной иглы с помощью чаевые microloader либо 10 мкл ПВП 40, содержащего 100 КОЕ / NL S. эпидермальный или 30 КОЕ / NL М. Marinum или использования пвп 40, как макет инъекции.
  5. Поместите иглу в автоматизированной микро-форсунки и калибровки X, Y позиции за счет снижения или перемещении иглой вверх и нажав на экране в положении иглы. Затем калибровки положения г иглы, нажав на экране в положении кончика иглы.
  6. Распределите яйца на агарозном сетке, используя пластиковую передачи пипетки, и удалить излишки яиц воду. Поместите агарозном сетку в автоматизированной microinjector.
  7. Перейти в "Injectioн меню 'и отрегулировать "давление впрыска" настройки до 200 гПа,' Время впрыска "0,2 сек и« давления Компенсация '15 гПа, который коррелирует с 1 NL, в меню настроек FemtoJet.
  8. Нажмите на 'Введите все ", чтобы придать всю тарелку.
  9. Собери яйца после инъекции, вымойте их в чашку Петри (92 х 16 мм), максимум по 70 эмбрионов в чашке Петри, и инкубировать при 28 ° С

5. Анализ потока-цитометр

  1. Подготовьте большой поток частиц цитометр в соответствии с инструкциями изготовителя и заполнить чашку образца и оболочки контейнер жидкости с яичным воды.
  2. В операционной программного обеспечения, перейдите в меню «PMT» и использовать следующие параметры: 650 V для канала 'красный' и 0 В для «зеленых» и каналов «желтый». Затем перейдите в меню 'пороги' и использовать следующие параметры: 'Оптикал плотность 'порог сигнала: 975 мВ (значение Copas XL: 50) и "временем пролета" (TOF) минимум до 320 мкс (значение Copas XL: 800) для того, чтобы уменьшить влияние мусора.
  3. Для анализа без сортировки эмбрионы перейдите к шагу 5.4, для анализа и сортировки эмбрионов в чашку Петри перейдите к шагу 5.5 или для анализа и сортировки эмбрионов в 96-луночный планшет перейдите к шагу 5.6.
  4. Наведите эмбрионов в кювету для образца и нажмите на кнопку "Пуск", чтобы начать анализ. Когда все эмбрионы анализируются остановить анализ, нажав на "стоп". Сохраните данные, нажав на "хранить все '. Примечание: Все данные хранятся в виде TXT, LMD, DAT, CSV и BSRT файлов. Следуйте протокол на этапе 5.7.
  5. Наведите эмбрионов в кювету для образца и определяют максимум 70 эмбрионов на чашку для сортировки, введя 70 в меню "Сортировка". Поставьте пустую чашку Петри под сортировщика и нажмите на кнопку "Manual Сортировать". Когда ди-Петри ш заполняется, сохранить данные, нажав на "хранить все '. Примечание: Все данные хранятся как TXT, LMD, DAT, CSV и BSRT файлов. Следуйте протокол на этапе 5.7.
  6. Наведите эмбрионов в кювету для образца и определяют максимум 1 эмбриона на лунку для сортировки, введя 1 в меню "Сортировка". Поместите пустую тарелку 96-а в левую держателе и нажмите на кнопку "Заполнить тарелку". Когда 96-луночный планшет заполняется, сохранить данные, нажав на "хранить все '. Примечание: Все данные хранятся как TXT, LMD, DAT, CSV и BSRT файлов. Следуйте протокол на этапе 5.7.
  7. Получить файл TXT обработать исходные данные, используйте следующие настройки фильтра данных: 'Статус выбрать': 40, и если с помощью модуля сортировки "Статус сортировки ':. 6 Тогда использовать цифры от общего сигнала флуоресценции от' Красный 'канала для вычисления среднего и стандартную ошибку среднего. Участок эти наборы данных в бар или рассеяния графиков.
ve_title "> 6. наркологическая

  1. Анализ и рода на 3 дня после инъекции (точек на дюйм), М. Marinum инфицированных эмбрионов в две равные группы, используя большой частиц проточного цитометра (шаг 5.5). Лечить одну группу с соединением интерес к его несущей растворителей и других с растворителя-носителя только (контроль). Применить подобные процедуры издеваться вводят контроль испытанию для антибиотиков побочных эффектов.
  2. Повторите на 4 и 5 руб анализ (шаг 5.5) и обновите яйцо воду или яичный воды, содержащей соединения.

7. Высокое разрешение изображений

  1. Обезболить эмбрионов с 0,02% (вес / объем) забуференного 3-аминобензойной кислоты (Tricaine) в яичном воды за 10 мин до анализа.
  2. Подготовка системы Скрининг Technology позвоночных автоматики и пробоотборник крупной частицы в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Выберите эталонных изображений, соответствующих возраста эмбрионов от «Imaging - Object211; Меню настройки обнаружения ".
  4. Выберите количество фотографий и ориентацию, которые будут сделаны с помощью системы скрининга технологии позвоночных автоматизированной от «Imaging - Авто хранения изображений" меню.
  5. Поместите 96 лунками, наполненный эмбрионов (из шага 5.6) в левую держателе Большого частиц Sampler, и нажмите на кнопку "Выполнить пластины".
  6. Когда эмбрион обнаружены и в правильном положении; изображение головы и хвост отдельно с CLSM использованием 10X равнина сухой цели и объединить изображения впоследствии с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные результаты показывают, что высокая пропускная способность трубопровода для изучения S. эпидермальный и М. Marinum инфекции было успешно установлено и что может быть распространен и на другие модели инфекции. Во-первых, использование большого разведения сосуда (рис. 1А), на основе опубликованной системе по Adatto и соавт. (2011) 11, дает возможность генерировать большое число синхронных яиц в единичных событий, дающими высокую контроль процесса нереста. Следующая, чтобы иметь возможность вводить большое количество эмбрионов в течение короткого периода времени, был использован улучшенная версия ранее разработанной автоматизированной системы микро-инъекции 7 (рис. 1А). Для ослов, который является лучшим стадия развития для желтка инфекции, инъекции с S. эпидермальный и М. Маринум проводились на всех различных стадий между 1 и 512 клеточной стадии, в соответствии с описанием, сделанного Kimmel и соавт. (1995) 12

Инъекции с 100 КОЕ S. эпидермальный между сценой 16 и 128 клеток обеспечивает лучшую инфекции шаблон (рис. 2). Бактерии распространение внутри желтка течение 3 дней и распространяться в организме из 3 руб годов. Выполнение инъекции до стадии 16 клеток приводило к высокой смертности от 4 точек на дюйм, и после инъекции этап 256 клеток показал, главным образом рост бактерий внутри желтка с трудом любых бактерий, распространяющихся в теле эмбриона. Количественное определение бактериальной нагрузки проводили с помощью анализа интенсивности флуоресценции с использованием большого частиц проточного цитометра как описано Veneman и соавт. (2013) 8 (рис. 3).

Наблюдения показали, что оптимальная стадия развития для инъекций 30 КОЕ M. Marinum инъекции лишь от 16 до 128 клеточной стадии для деформации E11 (Рисунок 4А) и между 16-64 клеточной стадии с более опасную M Straiн (рис. 4В). Эмбрионы вводили на этих этапах показали рост бактерий внутри желтка и распространение бактерий через эмбриона (рис. 7). Заражение обоих штаммов на ранних стадиях представлены неспецифическую обобщенный рост бактерий ведущую эмбрионов умереть после 4 руб. С другой стороны, в эмбрионах, инъецированных на более поздних стадиях бактериальный нагрузка была ограничена желтка.

Далее, предварительная сортировка с крупной частицы проточного цитометра (рис. 1В) генерируется большие однородные группы зараженных рыб за исключением не-или сильно зараженных эмбрионов (5А и 6А). После предварительной сортировки, М. Marinum инфицированных эмбрионов лечили рифампицина, первый линия противотуберкулезной препарата. Предыдущие исследования показали, что лечение с рифампицином в дозе 200 мкМ эффективно снижает M. Marinum инфекция у рыбок данио 7, 13. Принимая advantagе большим количеством равномерно инфицированных эмбрионов, полученных с высокой пропускной способностью установки, обработки различными дозами был выполнен. Эмбрионы, инфицированных M. Marinum М штамм и обрабатывали в течение 48 часов с 12, 24 и 200 мкМ рифампицин показал, чтобы уменьшить эффективно микобактерий инфекции в зависимости от дозы (рис. 5б). С учетом эффективного уменьшения инфекции с использованием рифампицин в дозе 200 мкМ эту концентрацию использовали для будущих экспериментов. В соответствии с предыдущим результатом, изучая бактериальной прогрессирование бремени с помощью М. штамм Marinum E11 значительное снижение 24 часа в сутки и далее после обработки 200 мкМ рифампицина наблюдалось (рис. 6Б).

Кроме того, если изображения с большим увеличением, что требуется от этих эмбрионов, они могут быть отображены автоматически в 96-луночных планшетах (фиг. 1С), откуда образцы могут быть проанализированы с помощьюсистема скрининга Технология позвоночных Автоматизированная с крупной частицы Sampler установлен на CLSM.

Система скрининга Технология позвоночных Автоматизированная с Sampler крупной частицы представляет собой систему, которая может быть смонтирована на CLSM или стерео микроскопа. Это устройство позволяет загрузку живых или фиксированных эмбрионов из 96-луночный планшет или контейнер для массовых грузов автоматически через стеклянный капилляр, и ориентирует его в передней части камеры под нужным углом (например, спинной или боковой). Изображения эмбриона в любой ориентации могут быть сделаны с на камеры борту или с внешним CLSM (рис. 7). Эмбрионы будут впоследствии переданы в сборе или контейнер для отходов.

figure-results-1
Рисунок 1. Mainstream экспериментальная OUTLНИС. А) рыбы взрослых ставятся вместе, чтобы сцепиться, яйца собираются, выстраиваются в агарозном пластины и вводят. Б) Инъецированные яйца инкубируют при 28 ° С и будет предварительно отсортированы для возможного лечения наркомании. C) Последующий анализ на большой частиц проточного цитометра и / или большая частиц Sampler / позвоночных Автоматизированная технология Скрининг с CLSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Создание лучшего клеточной стадии для S. эпидермальный желток инъекции. Эмбрионы рыбок данио вводили в желтке на разных стадиях развития от 1 до 512 клеточной стадии с 100 КОЕ S. эпидермальный. Эмбрионы введенные в период с 1 ай 8 клеточной стадии показал рост бактерий в желтке и высокой смертностью от 4 руб. Эмбрионы вводили между 16 и 128 клеточной стадии показал рост бактерий в желтке и внутри тела, начиная с 3 руб. Эмбрионы вводили между этапе 256 и 512 клеток показали многие рост бактерий внутри желтка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Количественное определение бактериального бремени, используя большой поток частиц цитометр. 100 КОЕ S. эпидермальный вводили в желток эмбрионов данио рерио.) до 5 точек на дюйм, каждый день, группы по 10 эмбрионов были гомогенизируют и помещают непосредственно, показывающий среднюю экспоненциальный рост, основанный на биологической два реплик (Столбики ошибок= SEM). Б) Большой поток частиц цитометр анализа показывает среднее сигнала флуоресценции от неинъекционные и S. эпидермальный вводят эмбрионы. Были проанализированы 30-160 эмбрионы в состоянии (планки погрешностей = SEM), разные буквы указывают статистические значимые различия по той ANOVA с последующим после специальной тест Тьюки (P <0,001), нс:. Не существенные различия С) корреляция между КОЕ и средний сигнал флуоресценции групп 10 S. эпидермальный инфицированных эмбрионов (планки погрешностей = SEM). Эта цифра была изменена с Венеман и др.. (2013) 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Establishment из лучших клеточной стадии для М. Marinum желток впрыска. Эмбрионы рыбок данио вводили на всех различных стадиях развития от 1 до 512 клеточной стадии с 30 КОЕ M. Marinum E11 и М штамм. A, B) Эмбрионы впрыскивается из 1-8 клеточной стадии показал аналогичный распространения и смертности с обоих штаммов.) Эмбрионы вводят между 16-128 клеточной стадии с штамм E11 показал образование гранулем и системной инфекции в то время как инъекции от 256 до 512 клеточной стадии хранится бактериальную нагрузку в желток. Б) Эмбрионы вводят между 16-64 клеточной стадии с M штамма показали формирование гранулемы, как структуры и системной инфекции в то время как те, вводят от 128 до 512 клеточной стадии хранится бактериальную нагрузку в желток . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5 Рисунок 5. Лечение М. Marinum острая инфекция с первой линии к противотуберкулезным препаратам. Эмбрионы вводят между 16-64 клеточной стадии с 30 КОЕ M. Marinum М штамм пропускались через крупной частицы проточного цитометра в 3 руб, где они сортируются в две группы после отбрасывания не-и / или высоко зараженных эмбрионов.) флуоресценции отдельных эмбрионов в обеих группах. B) эмбрионов, обработанных с рифампицином (РИФ ) в течение 48 ч при дозах 12, 24 и 200 мкМ были проанализированы на 4 точек на дюйм; их бактериальная нагрузка значительно снижается. в) представитель Copas профили эмбрионов, обработанных с ДМСО и рифампицина в дозах 12, 24 и 200 мкм в течение 24 часов. Бактериальной нагрузки и распределение обозначается красной пиков. Синяя линия представляет профиля элемента отсортированного (4 DPF данио еmbryo) по Copas. Были проанализированы 60-90 эмбрионов в состоянии. Каждая точка данных представляет отдельный эмбрион. Значения указаны как среднее ± SEM. нс: не существенные различия. Анализ статистической значимости различий был выполнен так ANOVA с последующим posthoc теста Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6. Лечение М. Marinum хроническая инфекция с первым линия противотуберкулезной препарата. Эмбрионы вводят между 16-64 клеточной стадии с 30 КОЕ M. штамм Marinum E11 пропускались через большой поток частиц цитометр в 3 руб, где они сортируются в две группы после отбрасывания не-и / или высоко зараженных эмбрионов. A) флуоресценции индивидуальных эмбрионов в обеих группах. B) эмбрионов, обработанных с рифампицином (RIF) при 200 мкМ в течение 4 дней были проанализированы показывает значительное снижение бактериальной нагрузки через 1 день лечения. Были проанализированы 90 эмбрионов в состоянии. Значения указаны как среднее ± SEM. Различные буквы указывают на значительные различия между временными точками одного и того же лечения. * Обозначает значительные различия с контрольной группой. нс: не существенные различия. Анализ статистической значимости различий был выполнен так ANOVA с последующим posthoc теста Тьюки. (P <0,05). Рисунок B) после создания редактировался Spaink соавт. (2013) 13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

hres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Результат М. Marinum E11 впрыска желток отображаемого использованием позвоночных автоматизированной технологии скрининга и КЛСМ. конфокальной Z стек (сшитые 3 изображения) от 5 точек на дюйм FLI1-EGFP 14 эмбриона.) Живой эмбрион показ распространение М. Marinum E11 бактерии (красный) по всему телу. B) Исправлена ​​5 точек на дюйм FLI-EGFP эмбрион показывая М. Marinum E11 бактерии (красный) по всему телу совместно локализации с лейкоцитов (светло-голубой) обнаружены L-пластина иммуноокрашивания 15.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методология высокая пропускная описано в этой статье обеспечивает быстрый и экономически эффективный конвейер на экран большое количество эмбрионов и личинок рыб с различными типами инфекций. Используя большой племенной судно вместо традиционных одно-или семейными танков размножения способствует контроль над процессом нереста и поколение большего числа синхронных яиц. С улучшенной версии автоматизированной системы микро-инъекции 7, можно вводить до 2500 яиц почти все в той же стадии клеточного течение 1 часа. С помощью этих обновлений и улучшенного ПО целесообразно придать больше яиц, чем ранее было возможно, которые могут использоваться для выполнения больших экранов наркотиков с бактериальной пролиферации как зачитал. Однако этот метод по-прежнему ограничивается желток инъекцию, другие маршруты для инъекций, например, описанные Бенара и др.. (2012) 6, мы надеемся, будут включены в автоматизированную систему микро-инъекции в ближайшем будущем.

<р = класса "jove_content"> Хотя эти методы протестированные для скрининга данио, было бы полезно для приложений с других видов рыб, а также. Например, карп было указано иметь преимущества для экранов наркотиков. Как рыбок данио, яйца и эмбрионов ранних стадий, от карпа прозрачны, но с основным преимуществом своих больших размеров икры сотен тысяч яиц и наличия инбредных линий, которые предлагают более постоянный генетический фон 16.

Анализ большого количества зараженных эмбрионов осуществляется с высокой пропускной большого потока частиц цитометра. Это устройство может сортировать проанализированы эмбрионов в нескольких пластин хорошо или чашке Петри делает его особенно подходящим для тестирования большого количества соединений. Если более высокое разрешение изображения необходимо, чем установка приспособлена таким образом, что большой поток частиц цитометра технологии могут быть использованы для предварительного скрининга и последующего анализа проб в среде черезположить с более высоким разрешением. Это может быть сделано с помощью технических средств досмотра позвоночных Automated 17, 18. Это устройство может автоматически собирать живые или фиксированные эмбрионов между 2 и 7 дней после оплодотворения из мульти пластины скважины или контейнер для массовых грузов, изображение 360 ° через капилляр с помощью КЛСМ или стерео микроскопии и распоряжаться снова через 2 контейнеров для массовых грузов, позволяющих ручной сортировки эмбрионов на основе от микроскопических изображений. Дальнейшее совершенствование позволит сортировку эмбриона после съемки в нескольких пластины а, следовательно, делает возможным экран автоматически большое количество отдельных эмбрионов в течение долгого времени с CLSM. Если предположить, что в будущих приложениях система скрининга Technology позвоночных Automated также может быть подключен к большому потока частиц цитометра технологии без необходимости предварительного личинок выдачи в нескольких луночные планшеты, приведет к более продвинутой сортировки.

Эта статья описывает установлениег оптимизация высокой настройки пропускной изучения S. эпидермальный и М. Marinum инфекции в качестве модели для открытия новых лекарств. Это показывает, что исход этих бактерий, вводимых в желтке зависит от стадии развития яиц во время инъекции. Потребители инъекционных М. Marinum E11 на 16-128 клеточной стадии или штамма M на 16-64 клеточной стадии приводит к тому же инфекции схеме, хвостового инъекции вены 2, 6. Однако эта установка не ограничивается распространением только бактериальных патогенов. Было показано, до этого можно с помощью робота вводить растворы, содержащие ДНК, РНК или Morpholinos для трансгенеза, более-выражения и генной нокдауна исследования, соответственно 13. Кроме того, было показано, что эта установка также полезен для изучения пролиферации раковых клеток и миграции. Поэтому этот трубопровод представляет собой универсальный способ высокой пропускной экраны различных сигнальных механизмов в контекстеврожденного иммунитета, применительно к инфекционных заболеваний и развитии рака. Эти экраны могут быть объединены с другими для открытия медицины, но и с анализом возможных токсических эффектов, определенных применимых препаратов.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JS является владельцем Life Science Методы BV, которая производит инструменты, используемые в этой статье.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Leonie де Бур и Bas Zaat (Академический медицинский центр) за предоставление нам с S. эпидермальный О-47 штамм. Мы благодарим Рико Bongaarts, Фрэнсис Смет и Ангела Comas (Союз Biometrica) за помощью и советом с Copas XL и VAST анализа BioImager. Мы благодарим Дави де Витт, Ульрике Nehrdich и Лаура ван Hulst для рыб заведование и других коллег из Лейденского университета за полезные обсуждения. Это исследование является частью проекта P5.03 IBIZA исследовательской программы в биомедицинских материалов института, совместно финансируемого голландским Министерством экономики и Программы Смарт Mix (NWOA_6QY9BM) Нидерландов Министерства экономики и Нидерланды Министерство образования, культуры и науки. Дополнительная поддержка была получена от проекта ЕС ZF-Здоровье (FP7-Здоровье-2009-242048), и RMJ поддержали Марии Кюри общении как опытного исследователя в начальной подготовки сети FishForPharma (PITN-GA-201 ЕС1-289209). SJR получил финансирование от инновационных лекарственных средств Инициатива совместного проекта по договору грант п ° 115 337, ресурсы которого состоят из финансового участия со стороны Рамочной программы Европейского Союза Седьмой (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в добрые авторов contribution.The дальнейшего подтверждения финансовая поддержка со стороны университета фонда Лейденского (LUF) для робототехники и от Cyttron, в субсидиях программы Besluit Investeringen Kennisinfrastructuur, который в свою очередь при финансовой поддержке Нидерландской организации научных исследований для визуализации объектов. Приобретение системы Copas была частично поддержана Отдела по Земле и наук о жизни (ALW) при финансовой помощи от Нидерландской организации научных исследований (NWO, 834.10.004).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Мидлбрук 7H10 агарBD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США262710
Мидлбрук 7H9 бульонBD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США271310
BBL Миддлбрук обогащение олеиновой кислотой альбумина декстрозы каталазы (OADC)BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США 211886
BBL обогащение альбумин декстрозы каталазы (ADC)BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США211887
LB агарSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАL5542Несколько поставщиков
LB бульонSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАL3022Несколько поставщиков
ХлорамфениколBio-connect, Хёйссен, Нидерланды16785.03Несколько поставщиков
ГигромицинBio-connect, Хёйссен, Нидерланды25966.01Несколько поставщиков
Tween-80Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАP1754Множественные поставщики
Поливинилпирролидон40Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США 529504Несколько поставщиков
Этил-3-аминобензоат метансульфонат соль (трикаин)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАA5040
AgaroseSphaero-Q, Gorinchem, НидерландыS103Множественные поставщики
Растворимая морская сольбыстрого приготовления Sera Marin, Heinsberg, Германия5460
iSPAWNTechniplast, Buguggiate, ИталияiSPAWN
Автоматизированная система микровпрыскаLife Science Methods BV, Лейден, Нидерланды Автоматизированнаясистема
микровпрыскаАнализатор и сортировщик сложных объектов XL (COPAS XL)UnionBioMetrica Inc., Холлистон, Массачусетс, СШАCOPAS XL
Технология автоматизированного скрининга позвоночных BioImager (VAST BioImager)Union BioMetrica Inc., Холлистон, Массачусетс, СШАVAST BioImager
LP SamplerUnion BioMetrica Inc., Холлистон, Массачусетс, СШАLP Пробоотборник
Конфокальное лазерное сканирование микроскопLeica Microsystems, Вецлар, ГерманияTCS SL
Инъекционная игла 10 & микро; м внутренний диаметрQvotek, Миссиссога, Канада

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).">Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).">Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).">Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).">Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).">Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).">Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
  7. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).">Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).">Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).">Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).">Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).">Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).">Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).">Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).">Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).">Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).">Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).">Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).">Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish Embryo InfectionHigh Throughput ScreeningAutomated Micro InjectionLarge Particle Flow CytometryStaphylococcus EpidermidisMycobacterium MarinumConfocal MicroscopyDrug Discovery PipelineBacterial Burden AnalysisEmbryo Sorting

Related Articles