Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сосудистая перенос генов из металлического стента поверхностей Использование аденовирусные векторы ПРИВЯЗНЫХ через ГИДРОЛИЗНОГО сшивателей

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 августа 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

В этих исследованиях сообщается об обратимом прикреплении векторов аденовирусных генов к металлическим поверхностям стентов и модельных сетчатых дисков. Устойчивое высвобождение трансдукционно-компетентных вирусных частиц в зависимости от гидролиза сшивающих агентов, используемых для иммобилизации векторов, приводит к устойчивой сайт-специфической экспрессии трансгена в сосудистых клетках и стентированных артериях.

Аннотация

В рестеноз внутри стента представляет собой серьезную усложнение процедур реваскуляризации стентов на основе широко используемых для восстановления кровотока через критически прищурив сегментах коронарных и периферических артерий. Эндоваскулярные стенты, способные перестраиваемой выпуска генов с анти-restenotic деятельности может представить альтернативную стратегию, чтобы в настоящее время используется стентов с лекарственным покрытием. Для достижения клинического перевод, ген-стенты должны обладать предсказуемые кинетику стента с иммобилизованным гена вектора выпуска и сайт-специфической трансдукции сосудистой, избегая при этом чрезмерного воспалительную реакцию, как правило, связанный с полимерных покрытий, используемых для физического захвата вектора. Эта статья описывает подробная методология без пальто привязывать аденовирусных векторов генов к стентов на основе обратимое связывание аденовирусных частиц полиаллиламин бифосфонат (PABT) -modified поверхность из нержавеющей стали с помощью гидролизуемыми сшивателей (HC). Семействобифункциональное (аминов и тиол-реактивный) ХК со средней т 1/2 части эфира гидролиза в-цепи в пределах от 5 до 50 дней были использованы, чтобы связать вектор с стента. Процедура иммобилизации вектор, как правило, осуществляется в течение 9 ч и состоит из нескольких этапов: 1) инкубации образцов металлов в водном растворе PABT (4 ч); 2) удаление защитной группы тиоловых групп, установленных в PABT с трис (2-карбоксиэтил) фосфина (20 мин); 3) расширение тиол реактивной мощности на поверхности металла с помощью реакции образцов с полиэтиленимина дериватизированных с группами пиридилдитио (PDT) (2 ч); 4) превращение ФДТ групп тиолов с дитиотреитола (10 мин); 5) изменение аденовирусов с HC (1 час); 6) очистка аденовирусных частиц, модифицированных с помощью гель-хроматографии на колонке (15 мин) и 7) иммобилизации тиоловых-реактивного аденовирусных частиц на поверхности стали тиолированного (1 ч). Этот метод имеет широкий потенциал применения вне стентов,путем содействия поверхности инжиниринг биопротезом устройств для повышения их биосовместимость через подложки-опосредованной доставки генов к клеткам, взаимодействующими имплантированный посторонние материалы.

Введение

Эффективность генной терапии в качестве лечебного воздействия затрудняется плохой способности адресности генной терапии векторов 1,2. Отсутствие надлежащих результатов адресности в суб-терапевтических уровней экспрессии трансгена на целевые места и приводит к широкому распространению векторов в нецелевых органов 3, в том числе лиц, ответственных за монтаж иммунный ответ против как вектора и кодируемого терапевтического продукта 4, 5. Одним из потенциальных означает, чтобы компенсировать распущенность трансдукции и содействовать таргетинг является введение генных векторов в нужном месте в форме, исключающей их свободное распространение через кровь и лимфу. Как правило, такие попытки опираться на локально инъекций систем доставки, содержащих либо из вирусных или невирусных векторов в смеси с фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты гидрогелевых матриц 6-10, которые способны временно, выдерживающих генных векторов в месте инъекции, физически улавливания-еEM в полимерной сети.

Другой общепринятой парадигмой локализованной генной терапии использует иммобилизация генных векторов на поверхности имплантированных протезов 11,12. Постоянные медицинские имплантаты (эндоваскулярные, бронхов, урологические и желудочно-кишечные стенты, кардиостимуляторы, искусственные суставы, хирургические и гинекологические сеток и т.д..) Будут ежегодно использоваться в десятки миллионов пациентов 13. В то время как в целом эффективны, эти устройства склонны к осложнениям, которые неадекватно контролируемых для текущими медицинской практике 14-17. Имплантируемые протезы представляют собой уникальную возможность служить прокси платформ для местной обработки генной терапии. С фармакокинетической точки зрения, дериватизации поверхности медицинских имплантатов с относительно низкими дозами входных векторов гена приводит к достижению как высокие локальные концентрации генных векторов на имплантат / интерфейса ткани и замедление кинетики Theiустранение г из этой папки. Как следствие длительное проживание и повышенной поглощением целевой популяции клеток, вектор иммобилизации сводит к минимуму распространение вектора гена. Таким образом, случайное прививка нецелевых тканях уменьшается.

Поверхность привязывать генных векторов на имплантируемых биоматериалов (также называют как субстрат-опосредованной доставки генов или твердой фазе доставки генов) была реализована в культуре и животных клеток экспериментов с использованием как конкретных (антиген-антитело 18-20, авидин-биотин 21,22) и неспецифическая 23-26 (платно, ван-дер-Ваальса) взаимодействий. Ковалентное присоединение векторов к поверхности имплантированного устройства ранее рассматривать как нефункциональные, так как слишком сильные связи с поверхностью исключает вектор интернализации клетками-мишенями. Недавно было показано, что это ограничение может быть преодолено за счет использования самопроизвольно гидролизуемого сшивающего агента, используемого в качестве Tetу нее между модифицированной металлической поверхности стента и капсида белков аденовирусного вектора 27,28. Кроме того, скорость высвобождения вектора и временной ход экспрессии трансгена в пробирке и в естественных условиях можно модулировать с использованием гидролизуемых сшивающих агентов, обладающих различными кинетики гидролиза 28.

В настоящем документе содержится подробный протокол для обратимого ковалентного аденовирусных векторов в активированной поверхности металла и представляет полезную экспериментальная установка для изучения вытекающие трансдукции события в пробирке в культуре гладкомышечных и эндотелиальных клеток и в естественных условиях в крыса сонной модели стента ангиопластики .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 Подготовка Cy3-меченого аденовируса для Эксперименты по высвобождению

  1. Приостановить 2 х 10 12 частиц объявление пустой (примерно 2 х 10 11 инфекционных единиц) в 650 мкл карбонатного / бикарбонатная (CBB, рН 9,3).
  2. Растворить содержимое флакона 1 (0,2 мг) амина-реактивного флуоресцентным красителем (Су3 (NHS) 2) в 1 мл СВВ до конечной концентрации 0,2 мг / мл.
  3. Добавить 100 мкл раствора красителя к суспензии вируса, вихря в течение 5 сек, инкубировать в течение 1 часа при 28 ° С при встряхивании (100-200 оборотов в минуту).
  4. Равновесие мл сефарозой 6B колонку 20 с PBS. Добавить 750 мкл меченного Cy-3 подвески рекламы по каплям к центру ложа гел.
  5. После вирусную суспензию пронизывает смолы, добавить 5 мл PBS. Откажитесь элюата.
  6. Добавить 0,5 мл PBS и соберите элюат в меченым стеклянной таре. Повторите этот шаг для сбора в общей сложности десять 0,5 мл фракций 10x.
  7. Анализ йэ собраны фракции спектрофотометрически (260 и 280 нм) для вирусного контента ДНК.
  8. Объединяют фракции, содержащие более 10% общего объема (сумма от F1 до F10) оптическая плотность (OD) при 260 нм. Примечание: Обычно фракции F3, F4, F5, F6 и объединяют и смешивают.
  9. Re-анализа смешанные объединенных фракций по спектрофотометрии (260 и 280 нм) и анализа по флуорометрии (550 ЕХ / 570 EM нм) для вирусной содержания ДНК и Cy3 помечены капсидный белок, соответственно. Примечание: Cy3 (NHS) 2 калибровочной кривой охватывающих диапазон 10 -9 -10 -13 моль / л подготовлен и флуориметрически анализировали на той же пластинке как объединенных фракций.
  10. Рассчитайте надписью выход вируса и плотность маркировки. Предположим, что 1,19 х 10 12 вирусных частиц / мл соответствует 1 OD блока для 1 см длины 29 путь. Используйте формулу: Выход = [(OD 260 нм /1.19)*10 12 * количество V / вход рекламы] * 100, где, OD 260 нм является оптический деnsity из объединенного препарата при 260 нм и V представляет собой объем объединенного препарата (мл), чтобы рассчитать выход восстановления рекламы (%). Используйте формулу: Маркировка Плотность = C * 6,02 * 10 23 / ​​(OD 260 нм /1.19)*10 12, где С концентрация Cy3 из объединенного состава (моль / мл) и OD 260 нм является оптическая плотность объединенной постановке на 260 нм для расчета средней Cy3 плотность маркировки. ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный восстановление меченого вируса> 70% вводимой дозы. Плотность маркировка 600-800 молекулы флуорофорные в одной вирусной частицы.
  11. Алиготе Cy3 меченных объявление пустой на более мелкие части (как правило, 5 х 10 11 частиц), пригодных для отдельных экспериментов выпуска. ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол определяет использование Cy3-меченого объявление исключительно в эксперименте релиза. Все исследования трансдукции осуществляются с немеченого векторов.

2 Активация металлических образцов

  1. Вымойте нержавеющей секТил сетки диски или нержавеющей стали стенты последовательно в изопропаноле (5 мин х 2) и хлороформ (5 мин х 2) при 55 ° С при встряхивании (100 оборотов в минуту). Растворитель удаляют.
  2. Нагрева образцов в течение 30 мин при 200 ° С.
  3. Растворите полиаллиламин бифосфонат с установленных скрытых тиоловых групп (PABT 27,28,30) в воде (1-2% вес / объем) при 72 ° C при встряхивании (100 оборотов в минуту). Отрегулируйте рН до 4,5-5 с KHCO 3.
  4. Инкубируйте образцы металла в PABT растворе в течение 2-4 ч при 72 ° С с перемешиванием (100-200 оборотов в минуту). ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть приостановлена ​​в этой точке. Образцы стабильны в течение 3 дней при температуре 4 ° С.
  5. Промыть образцы трижды дважды дистиллированной воде (DDW).
  6. Защиту образцы с трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP; 15 мг / мл в 0,1 М уксусной буфере) в течение 15 мин при 28 ° С с перемешиванием (100-200 оборотов в минуту).
  7. Промыть 5x в дегазированном пониженным содержанием дейтерия.
  8. Expose образцы до 2% полиэтиленимине с установленными пиридилдитио групп (PEI PDT 27,28,30) в дегазированной DDW в атмосфере аргона в течение 2 ч при 28 ° С с перемешиванием (100-200 оборотов в минуту). ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть приостановлена ​​в этой точке. Образцы стабильны в течение 2 недель при 4 ° С.
  9. Промыть образцов три раза пониженным содержанием дейтерия.
  10. Защиту образцов до 10 мг / мл дитиотреитола / DDW, чтобы преобразовать пиридилдитио групп тиолов.
  11. Промыть 5x снова в дегазированном пониженным содержанием дейтерия.

3 аденовируса Активация и поверхности металла Иммобилизация

  1. Приостановить 5 х 10 11 частиц либо Ad EGFP или Ad Luc (примерно 5 х 10 10 инфекционных единиц) в 487.5-495 мкл карбонатного / бикарбонатная (CBB, рН 9,3). Примечание: Для исследования высвобождения, использовать 5 х 10 11 из Cy3 помечены объявления пустые частицы (регулировки громкости, чтобы 487.5-495 мкл СВВ).
  2. Растворите HC с разной скорости гидролиза 28 [(быстро (т 1/2 = 5 г), промежуточно (т 1 /2 = 12 г) и медленно (т 1/2 = 50 г) ХК, то есть КПС, IHC или SHC; рисунке 1] или не гидролизуемого сшивающий агент (NHC), сульфо-LC-SPDP в СВВ на 20 мм.
  3. Сразу же добавить 5-12.5 мкл кросс-линкера раствора к суспензии вируса в общем объеме 500 мкл (200-500 мкМ конечной концентрации сшивающего агента), вихря, и инкубируют в течение 1 ч при 28 ° С с перемешиванием (100- 200 оборотов в минуту).
  4. Равновесие мл сефарозой 6B колонку 20 с дегазированной 5 мМ ЭДТА / ФБР (БООС). Добавить по каплям 500 мкл поперечных связей модифицированные подвески Ad к центру слоя смолы.
  5. Добавить 5 мл дегазированной БООС. Откажитесь элюата.
  6. Добавить 0,5 мл дегазированной БООС и соберите элюат в меченым стеклянной таре. Повторите этот шаг 10 раз собирая в общей сложности десять 0,5-мл фракции.
  7. Определите ОП собранных фракций с использованием спектрофотометрии при 260 и 280 нм и конвертировать OD для титров вируса (1,19 х 10 12 / мл соотствует 1 ОД) 29.
  8. Объединяют фракции, содержащие> 10% элюированной вируса (Примечание: Как правило, фракции F3-F6). Повторите спектрофотометрического титр анализа для объединенной подвески.
  9. Трансфер вирусной суспензии во флакон с активированными металлических образцов (как в 2.11). Инкубировать в атмосфере аргона в течение 1 часа при 28 ° C при встряхивании (100-200 оборотов в минуту). Примечание: Ad-привязи металлические образцы, полученные на этом этапе в дальнейшем используются в последующих экспериментах выбросов и трансдукции описанных в секциях протокола 5-7.

4 Количественная оценка Настенный связано Vector Ad методом ПЦР

  1. Подготовка сетки, сформулированные с поверхности с иммобилизованным Ad EGFP привязал через НХК, SHC, IHC и КПС (п = 3 для каждого типа), как описано в разделах 2 и 3.
  2. Использование комплекта QIAamp ДНК Micro изолировать вирусной ДНК. Поместите сетки по отдельности в 1,5 мл пластиковые пробирки, содержащие 200 мкл смеси, состоящей из 180 мкл ATL бuffer и 20 мкл протеиназы К (оба из комплекта). Добавить известное количество рекламы EGFP частиц (в качестве стандартов для калибровочной кривой) в отдельные пробирки, содержащие ту же смесь. Выдержите при 56 ° С в течение ночи без встряхивания.
  3. Добавить 200 мкл буфера (AL из набора), перемешивают на вортексе, добавьте 200 мкл 100% этанола, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Передайте смесь из каждого тюбика на отдельного столбца MinElite (из комплекта) и спина при 8000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Промойте сетки, содержащие трубки 180 мкл свежего буфера ALT, добавить на соответствующих столбцов и спина при 8000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Откажитесь от элюаты.
  5. Добавить 500 мкл AW1 буфера (из комплекта) в колонки и спина при 8000 оборотах в минуту в течение 1 мин. Откажитесь от элюаты.
  6. Добавить 500 мкл AW2 буфера (из комплекта) в колонки и спина при 8000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
  7. Откажитесь от элюаты.
  8. Вращение при 14000 оборотах в минуту в течение еще 3 мин Унтил столбцы полностью высохли. Откажитесь от элюаты.
  9. Добавить 50 мкл MilliQ класса воды в колонки. Отжим при 14000 оборотах в минуту в течение 5 минут. Соберите 50 мкл элюата из каждого столбца в индивидуальной пробирку (из комплекта).
  10. Приготовьте раствор ПЦР Master Mix путем объединения размножается в следующем (12,5 мкл питания SYBR Green ПЦР Master Mix, 0,63 мкл 10 мкМ EGFP смыслового праймера [5'ACG ТАА ACG GCC ACA AGT TC-3 '], 0,63 мкл 10 мкМ EGFP анти-смысловой праймер [5'AAG TCG ТГК ТГК TTC ATG TG-3 '], 6,3 мкл MilliQ-вода). Умножьте эти объемы по количеству запланированных реакций, включая "нет ДНК" управления.
  11. Нагрузка 5 мкл Ad EGFP ДНК (от этапа 4.8) и 20 мкл ПЦР Master Mix в трех лунках одного MICROAMP Optical Reaction 96-луночного планшета. Печать тарелку с MICROAMP Optical клейкой пленкой. Вращайте пластину на 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
  12. Место пластины в гнездо на 7500 Real-Time PCR двигателя. В главном меню 7500 System SDS Software (v1.4 или выше) выберите «Создать новый эксперимент". Нажмите "Далее". На экране «Мастера нового эксперимент" выберите SYBR Green из меню прокрутки вниз и нажмите кнопку "Добавить". Нажмите "Далее", чтобы получить формата таблички. Выделите все скважины должны быть проанализированы, выберите SYBR Green. не Выделите последовательно никакого контроля ДНК скважин, рекламы EGFP стандартов ДНК и неизвестных, и отмечать их с помощью соответствующих обозначений из меню прокрутки вниз.
  13. Переключитесь на вкладку приборов. Выберите "добавить диссоциации фазу», изменить громкость а от дефолта 50 мкл до 25 мкл. Нажмите кнопку Пуск.
  14. Проанализируйте результаты ПЦР с использованием после проверки резюме QC для выбросов и других нарушений.

5 выпуска Кинетика ГИДРОЛИЗНОГО сшивающий агент-привязал векторных частиц от модели стальной сетки

  1. Вымойте образцы сетки дериватизирован Cy3-меченого объявление через RHC, IHC, SHC и НХК (по 3,9) в 1% BSA / PBS (1 час х 3) при встряхивании (100-200 оборотов в минуту).
  2. Использование стерильных тонких щипцов, место сетки на отдельные лунки 96-луночного планшета предварительно заполненные с 200 мкл буфера для элюции (0,1% BSA / 0,1% Твин-20 / PBS).
  3. Возьмите флуоресцентные изображения центральной части каждой сетки. Запишите настройки микроскопа и CCD камеры, используемой для получения изображения.
  4. Анализа тарелку флуориметрически (550 ЕХ / 570 EM) в режиме хорошо сканирования с максимальным сокращением. Используйте скважин с недериватизированного сеток как фонового контроля.
  5. Инкубируйте планшет при 37 ° C при встряхивании (50 оборотов в минуту).
  6. В заранее определенное время (диапазон 1-30 дней) аспирации буфер элюирования, не нарушая сетки и добавить 200 мкл свежего буфера для элюции. Повторите шаги 4.3-4.5 после замены буфера.

6 Трансдукция культивированный CelLs по Mesh-иммобилизованных Ad векторы

  1. Вымойте объявление EGFP - или рекламы Люк -derivatized сетки трижды стерильным PBS в течение 5 мин при встряхивании (100 оборотов в минуту).
  2. Использование тонких стерильного пинцета удалить сетки Дисковые один за другим и по отдельности размещать их в лунки 96-луночного планшета с типом клеток, представляющих интерес в логарифмической фазе роста.
  3. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С, в 5% СО 2.
  4. Используйте соответствующий нетерминальный конечной точки анализа (флуоресцентной микроскопии, флуорометрию для EGFP или биолюминесценции визуализации для люциферазы), чтобы определить степень и пространственное распределение экспрессии генов в скважинах.
  5. При желании, заменой среды для PBS, чтобы увеличить чувствительность анализа флуорометрии (485/535 нм), если низкая экспрессия EGFP, как ожидается. Примечание: Если Флуорометр оснащен возможностью хорошо сканирования, читать пластину в режиме хорошо сканирования для оценки пространственного распределения EGFP-экспрессирующих клеток в лунках. Обмен PBS для среду после завершения флуорометрию.
  6. Изображение Трансдуцированные клетки в скважинах с рекламы EGFP -eluting сетках (как основных и периферийных сетки), используя набор FITC фильтра. Возьмите представительства изображения на 40-200X увеличения. Запишите точные настройки флуоресцентного микроскопа и CCD камеры, используемой для приобретения изображений.
  7. Добавить 5 мкл люциферин складе в PBS (10 мг / мл) непосредственно на скважинах с рекламы Luc -eluting сетки до конечной концентрации 500 мкг / мл и инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 10 мин до изображений биолюминесценции . Аспирируйте СМИ и заменить люциферина среды, свободной после съемки.
  8. Повторите конечных точек анализы в заранее определенное время (до 2 недель) для изучения кинетики экспрессии генов репортера следующие подложки опосредованного переноса генов.

7 Валидация Сохранилось Transduction Емкость на время задержки Points

  1. Подготовьте объявление EGFP деrivatized сетки с использованием RHC, IHC, SHC и НХК для вектора модема (как в 2.1-2.11 и 3.1-3.9) и индивидуально разместить сетки в лунки 96-луночного планшета с 60-80% сливной рогатого эндотелиальных клетках аорты (BAEC ).
  2. Анализ трансдукции культурного BAEC с сеткой-иммобилизованных Ad EGFP на 1 и 2 дня размещения пост-сетка с использованием флуоресцентной микроскопии и флуорометрию (по 6,4-6,5).
  3. 48 ч после начала трансдукции мыть сетки, содержащие скважин с PBS в два раза.
  4. Добавить 200 мкл 0,25% трипсина / EDTA в каждую лунку и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С при встряхивании (100 оборотов в минуту). Вымойте 3x с PBS.
  5. Используйте флуоресцентной микроскопии и флуорометрию констатировать полное удаление всех EGFP-позитивных клеток, связанных с ячеи.
  6. Семя недавно пассируют BAEC в лунки с частично освобожденных сетки на 60-80% начальной плотности посева (2-2.7 × 10 4 клеток / лунку).
  7. Инкубируйте планшет при 37 ° С и 5% CO 2 для заранее определенных периодов времени (1-10 дней) до оценки «новых» трансдукции событий по флуоресцентной микроскопии и флуорометрии.

8 Ad-элюируя установки стента в Rat сонной модели стента ангиопластики

  1. Все процедуры животных, описанные в данном протоколе соответствовать федеральных правил использования лабораторных животных и были одобрены IACUC Детской больницы Филадельфии. Чтобы придерживаться асептических хирургических условиях все инструменты автоклав стерилизованных. Для обеспечения непрерывного стерильность шарик стерилизатор занятых между использованием инструментов в до пяти последовательных животных.
  2. Подготовьте объявление Люк -eluting стентов в соответствии с 2.1-2.11 и 3.1-3.9. Храните вирус-производные стентов в стерильной PBS при 4 ° С в течение не более чем 24 часа до использования.
  3. Обезболить мужского пола Sprague-Dawley крыс (400-450 г) с IP-инъекции кетамина (100 мг / кг), и ксилазина (5 мг / кг). DeTermine глубину анестезии лапы ответ пинч и мышечного тонуса. Применить глазной ветеринар мазь, чтобы предотвратить сухость роговицы и склеры. Примечание: ингаляции анестезия с 4% и 2% изофлуран (1 л / мин) для стимулирования и поддержания анестезии, соответственно, можно, но препятствует свободный доступ к области шеи животного и, следовательно, не рекомендуется для неопытного пользователя.
  4. Пересмотрите глубину анестезии пальца щепоткой. Бритье и шеи в асептических условиях подготовительные и верхняя область груди. Администрирование антибиотика (цефазолин, 20 мг / кг; IM), обезболивающее (мелоксикам, 0,5 мг / кг; СК) и солевым раствором (10 мл / кг; СК). Катетер хвостовую вену с 24 G катетера и администрирования гепарин (200 МЕ / кг; IV). Примечание: доза 10 мг / кг (IM) энрофлоксацину (Baytril) может быть использован вместо цефазолина. Избегайте использования антибиотиков, не имеющих значительную активность в отношении грамположительных бактерий. 10-15 мг / кг карпрофен (Римадиле) может быть использован вместо мелоксикама в качестве преимущественного анальгетика. Наркотические анальгетики (е.g., морфин, бупренорфин) следует избегать, поскольку их дыхания-удручает свойств.
  5. Выполните срединный разрез через кожу и шеи фасции. Используйте тупые методы рассечение изолировать левую наружную сонную артерию. Закрепка наружной сонной артерии в наиболее дистальной доступным сайта. Применить скользящую временное лигатуры на происхождение внутренней сонной артерии.
  6. Сделайте 2-мм артериотомии разрез в левой наружной сонной артерии.
  7. Вставьте 2-французской Фогарти катетер в общей сонной артерии через разрез в наружной сонной артерии. Накачайте кончик катетера физиологическим раствором и проходят 3 раза от дуги аорты до бифуркации сонной артерии для того, чтобы обнажить эндотелий.
  8. Авто кусок трубы (1,04 мм OD, 0,99 мм ID) над катетера Фогарти и в общей сонной артерии. Вывод катетер Фогарти.
  9. Гора и обжимной Специальную Люк -derivatized стента над баллоном на 1,5мм диаметр ангиопластика катетер. Вставка стента через трубопровод тефлона и продвигать его в средней части общей сонной артерии. Избегайте трения стент против трубки или стенки сосуда.
  10. Развертывание стент в 12 атм в течение 30 сек и отозвать ангиопластики катетер.
  11. Свяжите-офф внешний проксимальных сонной артерии к артериотомии сайте и отпустите временное лигатуры на внутренней сонной артерии.
  12. Устранить операционной раны в слоях с проточной 4,0 викрил шва и скрепить кожу.
  13. не Recover животное на потепления площадку до амбулаторного и вернуться к своей изолированной клетке. В то время как никаких признаков боли или дискомфорта, как правило, не выставлены послеоперационных животных после первого 12 часов после процедуры, рассмотрим расширение мелоксикама терапии (0,5 мг / кг, подкожно ежедневно) в течение 72 часов.

9 Биолюминесценция Визуализация Артериальная экспрессии генов

  1. Через определенные промежутки времени (1 день - 3недель диапазон) после установки стента гена-элюируя в общей сонной артерии, обезболить крысу с помощью ИФ ингаляционной анестезии (2-4% изофлуран в кислороде).
  2. Снимите хирургических скобок, в асептических условиях подготовить площадку и снова открыть операционной раны. Использование тупой доступ рассечение, вновь получить на левой общей сонной артерии и отделить его от блуждающего нерва и прилегающей соединительной ткани.
  3. Приготовить смесь из 50 мг / мл в PBS люциферин и 25% Pluronic F-127 в PBS (1: 4 объем / объем) и сохранить его на льду. Примечание: Этот состав представляет в виде вязкого раствора при 4 ° С и сразу же превращается в гель при контакте с тканью при 37 ° С.
  4. Применить 200 мкл охлажденной люциферина / Плюроника смеси непосредственно к открытой сегмента общей сонной артерии и проверить гель прочность.
  5. Место животное в положении лежа на спине в визуализации камеры аппарата в IVIS-Spectrum и поддерживать анестезии изофлураном с лицевой маски.
  6. В acquisitiна окне панели управления (живой образ, версии 4.2 или выше) выбрать положение "B" (6,6 см камера возражать расстояние) и биннинга фактор "среды" от выпадающих меню под названием "поле зрения" и "биннинг", соответственно. Введите в "2,5 см" в поле высоты предметом. Выберите "мин" в качестве единицы времени в поле "время экспозиции", и выберите числовое значение "2".
  7. Три мин после нанесения люциферина / Плюроника геля, начать сканирование изображения, нажав на кнопку "Снимок" на экране. ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение время захвата может варьироваться от 1 до 6 мин в зависимости от ожидаемого уровня сигнала.
  8. После приобретения изображение, мыть гель с физиологическим раствором и промокните периартериального пространство стерильных марлевых и хлопка аппликаторов.
  9. Закройте рану викрил шва и штапельного кожи.
  10. Восстановление животное и вернуть в клетку. Повторите изображений в позднем тIME точки для изучения временной ход артериальной выражения вызвано стентов с иммобилизованным векторов объявлений.
  11. Кроме того, выполнять визуализацию после системного введения люциферина. Обезболить и приготовительный животное как за 9.1-9.2. Катетер хвостовую вену с 24 G катетера и безопасного катетера с хирургической лентой.
  12. Готовят раствор люциферин в PBS (50 мг / мл) и вводят 1 мл раствора через катетер в течение интервала 10 с. Один мин после инъекции начать сканирование изображения в качестве за 9.7-9.8. Примечание: более высокая скорость впрыска (<10 сек) может спровоцировать судорожную активность и остановку дыхания. Животное должно быть умерщвлены, если судороги или остановка дыхания происходит во время съемки.
  13. Следуйте шаг 9,10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эксперименты иллюстрация к выпуску

Модем аденовирусных векторов к поверхности имплантатов, в том числе инвазивных устройств, таких как эндоваскулярных стентов, аппроксимирует вектор к месту заболевания, частично устраняя недостаток физической адресные переносчики. Однако, чтобы быть в состоянии достичь терапевтический эффект через трансдукции ткани-мишени, вектор должен быть освобожден от поверхности (рисунок 2). Использование гидролизуемых сшивающих агентов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный протокол описывает оперативный метод подложки опосредованной доставки генов достигается за счет обратимого присоединения аденовирусных векторов для пиджака поверхностей из нержавеющей стали. В то время как разработаны для конкретной цели стента на основе генной терапии сосудистого рестеноза, этот метод имеет гораздо более широкое применение в таких областях, биоматериалов, биомедицинских имплантатов и генной терапии.

Хотя представленные исследования исключительно использ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Разработка протоколов и исследования, представленные в этой статье, были частично поддержаны грантами Американской кардиологической ассоциации по развитию ученых (I.F. 0735110N и M.C. 10SDG4020003), грантом Национального института сердца, легких и крови США HL 72108 (R.J.L.) и Национальным институтом сердца, легких и крови США T32 007915 (S.P.F.). Катетеры для ангиопластики были любезно предоставлены компанией NuMED (Хопкинтон, штат Нью-Йорк). Авторы выражают признательность г-же Сьюзан Кернс за ее секретарскую помощь.

Благодарности

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые можно раскрыть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
316 сетчатых дисков из нержавеющей сталиElecton Microscopy SciencesE200-SS
Generic 304-grade нержавеющей сталиLaserageпо индивидуальному заказу
AdeGFPUniversityof Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucof Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversity of Pennsylvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96-луночные планшетыCostar3635
Fluorometry 96-луночные планшетыCostar3915
Клеточная культура 96-луночных планшетовFalcon353072
Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Дитиотреитол (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
СпектрофотометрMolecular Devices SpectraMax 190
СпектрофлуориметрМолекулярные приборыSpectraMax Gemini EM
Орбитальный вибрационный инкубаторVWR1575R
Горизонтальная духовка с воздушным потокомShel Lab1350 FM
Centra-CL2 центрифуга International Equipment Company426
Цифровой вихревой смесительFisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 флуоресцентный микроскопNikon TE300
DC 500LeicaDC-500
7500 Система для ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемынедоступны
Биолюминесцентная станция IVIS SpectrumPerkins-ElmerНедоступна
ЭДТА дикалийная сольSigma-AldrichED2P
Сыворотка крупного рогатого скота альбуминовая фракция V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Пинцы DumontFine Science Tools11255-20
A10 клеточная линия ATCCCRL-1476
Эндотелиальные клетки аорты крупного рогатого скотаLonzaBW-6002
Люциферин, соль калияGold BiotechnologyLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS без кальция и магнияGibco14190-136
Фетальная бычья сывороткаGemini Bio-Products100-106
Пенициллин/стрептомицин растворGibco11540-122
DMEM, с высоким содержанием глюкозыCorning cellgro10-013-CV
0,25% трипсин/ЭДТАGibco25200-056
QIAamp DNA микронаборQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
MicroAmp Оптическая 96-луночная реакционная пластинаПрикладные биосистемыN8010560
Оптическая адгезивная пленка MicroAmpПрикладная биосистема4360954
цефазолин Апотекснедоступен
Loxicom (Meloxicam)Norbrookнедоступен
Heparin sodiumAPP Pharmaceuticalsне доступен
Ketavet (Кетамин)VEDCOне доступен
Anased (Xylazine) Ллоиднедоступен
Форан (Изофлуран) Baxterнедоступен
Изогнутые щипцы Moria irisИнструменты Fine ScienceИнструменты 11370-31
Изогнутые сверхтонкие щипцы GraefeИнструменты Fine Science Инструменты11152-10
Щипцы Dumont #5Инструменты Fine Science11252-20
Пружинные ножницы VannasИнструменты Fine Science Инструменты15018-10
Ножницы Fine Science - ToughCutFine Science Tools14058-09
Хирургические ножницыFine Science Tools14101-14
Викриловый шовный материал (5-0)EthiconJ385
Шовная нить (4/0 шелк) Fine Science Tools18020-40
Шовные зажимы MichelFine Science Tools12040-02
Расширитель раны (зеркало для глаз Ланкастера)KLS Martin34-149-07
Стерилизатор горячих шариковFine Science Tools18000-45
Аппликатор шовных зажимов MichelFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV катетерBeckton-Dickinson381412
2F катетер ФогартиEdwards Lifesciences120602F
Тефлоновая трубкаВентиляция041100BST
КатетерПТА NuMedиндивидуальный заказ
Марлевые салфеткиKendall Healthcare9024
Ватные аппликаторыSolon ManufacturingWOD1003
Физиологический растворBaxter281321
шприц 10 мл (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
шприц 1 мл (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Машинки для стрижки с лезвием #40Oster 78005-314
Транспоровая хирургическая лента3MMM 15271
Ветеринарная мазь PuralubePharmadermотсутствует в наличии
University ПЗС-камера

Ссылки

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Sprague Dawley
Сосудистая перенос генов из металлического стента поверхностей Использование аденовирусные векторы ПРИВЯЗНЫХ через ГИДРОЛИЗНОГО сшивателей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.