Методическая статья

Биохимические анализы для анализа деятельности АТФ-зависимых ферментов хроматина

DOI:

10.3791/51721

⸱

25 октября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем биохимические анализы, которые могут быть использованы для характеристики АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина на предмет их способности 1) катализировать АТФ-зависимое скольжение нуклеосом, 2) взаимодействовать с нуклеосомными субстратами и 3) гидролизовать АТФ нуклеосомным или ДНК-зависимым образом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Члены семейства АТФаз SNF2 часто функционируют как компоненты мультисубъединичных комплексов ремоделирования хроматина, которые регулируют динамику нуклеосом и доступность ДНК путем катализа АТФ-зависимого ремоделирования нуклеосом. Биохимическое препарирование вкладов отдельных субъединиц таких комплексов в многоступенчатую АТФ-зависимую реакцию ремоделирования хроматина требует использования анализов, которые контролируют продукцию продуктов реакции и измеряют образование промежуточных продуктов реакции. Этот протокол JOVE описывает анализы, которые позволяют измерить биохимическую активность комплексов ремоделирования хроматина или субкомплексов, содержащих различные комбинации субъединиц. Ремоделирование хроматина измеряется с помощью АТФ-зависимого анализа нуклеосомного скольжения, который отслеживает движение нуклеосомы на молекуле ДНК с помощью метода, основанного на электрофоретическом сдвиге подвижности (EMSA). Активность связывания нуклеосом измеряют путем мониторинга формирования ремоделирующих комплекс-связанных мононуклеосом с использованием аналогичного метода, основанного на EMSA, а ДНК- или нуклеосом-зависимую активность АТФазы измеряют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) для измерения скорости превращения АТФ в АДФ и фосфат в присутствии ДНК или нуклеосом. Используя эти анализы, можно изучить функции субъединиц комплекса ремоделирования хроматина, сравнивая активность всего комплекса с активностями, в которых отсутствует одна или несколько субъединиц. В качестве примера приведен человеческий комплекс ремоделирования хроматина INO80; Тем не менее, описанные здесь методы могут быть адаптированы для изучения других комплексов ремоделирования хроматина.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SNF2 семья хроматина комплексы включают центральную SNF2-как АТФазную субъединицы 1,2. Некоторые SnF2-АТФазы, как функция в виде отдельных субъединиц ферментов, в то время как другие функционировать в качестве каталитической субъединицы крупных мульти-субъединицы комплексов. Выяснение молекулярных механизмов, с помощью которых каждый из субъединиц хроматина комплексов способствовать их деятельности требует способность выполнять биохимические анализы, которые рассекают процесс ремоделирования.

АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирование человеческим INO80 комплекса и других ферментов хроматина могут быть предусмотрены как многоступенчатый процесс, который начинается с связывания фермента ремоделирования к нуклеосом, с последующей активацией его ДНК-и / или нуклеосом-зависимой АТФ-азы, транслокация ремоделирования фермента на нуклеосомной ДНК, и в конечном итоге репозиционирования нуклеосом 1,2. Понимание молекулярных детали АТФ-зависимый процесс ремоделирования хроматина гequires рассечение реакции ремоделирования в его отдельных этапов и определения вклада отдельных субъединиц хроматина комплекса к каждому стадии реакции. Такие анализы требуют умение анализировать нуклеосом ремоделирования и другие мероприятия с использованием определенных молекулярных субстратов в пробирке.

В предыдущем протоколе богу, мы описали процедуры, используемые для создания INO80 хроматина комплексов и подкомплекса с определенными субъединиц композиций 3. Здесь мы представляем три биохимические анализы, которые позволяют количественный анализ нуклеосоме связывания, ДНК-и нуклеосом-активируется АТФ-азы, и нуклеосом деятельности ремоделирования связанных с такими комплексами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 АТФ-зависимых нуклеосомных Ремоделирование Анализы

Для измерения АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирования деятельности, иммунологически INO80 или INO80 подкомплексы инкубируют с АТФ и mononucleosomal подложки, которая содержит одну нуклеосомы, расположенную на одном конце 216 п.н., 32 Р-меченного фрагмента ДНК. Реакционные продукты затем подвергали электрофорезу в нативных поли-акриламида гелей.

  1. Для создания 32 P-меченых, '601' фрагмента ДНК, амплификации из pGEM-3Z-601 4 фрагмент ДНК 216 б.п., содержащий 601 нуклеосом последовательность позиционирования конечного расположенный, с использованием олигонуклеотидов 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG и 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG как прямого и обратного праймеров.
    1. Установка ПЦР с 100 мкл, как описано в таблице 1.
    2. Выполните реакции ПЦР в термоциклере используя следующую программу: 1 мин при 96 ° C, followeD на 45 сек при 94 ° С, 30 сек при 57 ° С, 60 сек при 72 ° С в течение 30 циклов; заканчивая 7 мин при 72 ° С.
    3. После того как реакция завершена ПЦР, удалить некорпоративные нуклеотидов путем передачи продуктов реакции в два раза через нуклеазы без центрифужных колонок.
    4. Запуск 5 мкл очищенного продукта ПЦР в 1,2% агарозном геле, чтобы подтвердить, что реакция методом ПЦР нужный фрагмент ~ 216 п.н. ДНК.
    5. Развести 5 мкл очищенного продукта ПЦР в 20 раз, и измерения концентрации ДНК с помощью УФ-спектрофотометра. Средняя урожайность составляет ~ 40 нг / мкл.
    6. Измеряют радиоактивность 1 мкл очищенного продукта ПЦР в сцинтилляционном счетчике. Оцените эффективность маркировки путем расчета CPM / нг. Успешный реакция маркировки ожидается выход ~ 15 000 CPM / нг 601 фрагмента ДНК.
  2. Передача клеток HeLa нуклеосомы на меченого 601 ДНК с помощью метода серийных разведений 5.
    1. Смешайте 2 пмоль32 Р-меченого ДНК-фрагмент 601 с 6 мкг Hela нуклеосом (полученный, как описано 5) в 50 мкл буфера, содержащего 1,0 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF и 1 мМ ДТТ и инкубируют при 30 ° С в течение 30 мин.
    2. Последовательно разбавляя смесь до 0,8 М, 0,6 М и 0,4 М NaCl разбавлением 12,5 мкл, 20,8 мкл, и 41,6 мкл, соответственно, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, и 1 мМ ДТТ, с 30-минутной инкубации при 30 ° С после каждого разведения.
    3. Кроме того разбавленной смеси до 0,2 М, а затем 0,1 М NaCl добавлением 125 мкл, а затем 250 мкл того же самого буфера, содержащего 0,1% Nonidet P-40, 20% глицерина, и 200 мкг / мл БСА, с 30-минутной инкубации при 30 ° С между двух заключительных разведения. Храните mononucleosome подложку при 4 ° С в течение 3 месяцев.
  3. Выполнение АТФ-зависимые нуклеосом скольжения реакции в общем объеме 10 мкл. REAКомпоненты ие приведены в таблице 2. Поскольку оптимальная концентрация NaCl в течение INO80 нуклеосом ремоделирования активности ~ 50 мМ NaCl (неопубликованные результаты), регулировать общую концентрацию NaCl в каждой реакции до 50 мм, с учетом количества NaCl, содержащейся в препараты нуклеосом и фермента.
    1. Перед началом настроить анализов, бросить родные поли-акриламид гели (18 х 16 см). Чтобы подготовить единый гель, содержащий 5% акриламида (акриламид: бис-акриламид 37,5: 1), 0.5x КЭ (45 мМ Трис борат, 1 мМ ЭДТА), 0,01% персульфата аммония (APS), и 0,001%, N, N, N, N'тетраметилэтилендиамина (TEMED), смешивают ингредиенты, перечисленные в таблице 3. Разрешить гель для полимеризации, по крайней мере, 2 ч при комнатной температуре.
    2. Между тем, для каждой реакции должна быть выполнена, сочетают в предварительно охлажденной силиконизированный 1,5 мл микроцентрифужных трубки ~ 20 нМ или INO80 INO80 подкомплексом (полученного, как описано 3) с некоторым количеством EB100 буфера ( Таблица 4) достаточно, чтобы дать объем 4,75 мкл. Незамедлительно заморозить оставшиеся INO80-содержащие фракции в порошкообразной сухой лед или жидкий азот.
    3. Настройка мастера коктейль с остальными ингредиентами, расширения с коэффициентом 'X' (где X = общее число реакций +3). Количество каждого ингредиента, необходимого для одной реакции 10 мкл представлены в таблице 5; Рецепт должен быть расширен в зависимости от количества реакций, чтобы быть выполненной. Все хорошо перемешать, нажав на трубу или с помощью пипетки вверх и вниз с Pipetman и спин трубку на несколько секунд в настольной микроцентрифуге.
    4. Разливают 5,25 мкл мастера коктейль, чтобы каждый из реакционных труб, установленных на шаге 1.3.2. Все хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Запуск реакции путем передачи реакционные трубы до 30 ° С тепла блока или водяной бане и инкубируют в течение 2 часов.
    5. Между тем, готовить 'удаления смеси' коктейль, содержащий конкурента ДНКи нуклеосомы, расширения на коэффициент X (X = общее количество реакций и 4). Количество каждого ингредиента, необходимого для подготовки 1,5 мкл смеси для удаления одной реакции приведены в таблице 6; Рецепт должны быть расширены в зависимости от количества анализов должны быть выполнены.
    6. Завершить реакции добавлением 1,5 мкл удаления смеси. Хорошо перемешать, спин вниз, и инкубируют при 30 ° С в течение еще 30 мин.
    7. В то же время, предварительно запустить родной полиакриламидном геле в вертикальном блоке электрофореза при 100 V в течение 30 мин при 4 ° С, с использованием 0.5x TBE буфер, как работает с помощью магнитной мешалки внутри нижней камеры для поддержания постоянной циркуляции буфера.
    8. Чтобы загрузить образец, добавить 2,5 мкл красителем, содержащим 3x КЭ, 30% глицерина, 0,25% бромфеноловый синий и 0,25% ксилолцианола FF. Все хорошо перемешать, кратко вращаться образцы, и загрузить на гель, используя советы загрузки.
    9. Запуск гель при 200 V в течение 4,5 ч при 4 ° С с циркуляцией буфера.
    10. Чтобы обнаружить сигнал, перевести гель для стопку двумя листами фильтровальной бумаги. Оберните бумагу фильтра с гелем на вершине, используя прозрачную пластиковую обертку, а затем выставить его на экране хранения люминофора при 4 ° С в течение требуемого времени.
    11. Сканирование экран с системой сканера изображений изотопов и проанализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения.

2 Mononucleosome Анализы связывания

Для анализа сродство связывания данного INO80 комплекса для mononucleosomes, выполнить электрофоретической подвижности клавишу Shift Анализ (EMSA), используя mononucleosomal субстрат сгенерированный на шаге 1.2.

  1. Настройка реакция смесей для анализов связывания, как описано для нуклеосомных ремоделирования анализов, но опустить АТФ и удаление смесь из реакций; инкубировать при 30 ° С в течение 30 мин.
  2. Добавить 2,5 мкл загрузочного красителя к каждой реакционной смеси, и распространяется на родном полиакриламидном геле, содержащем 3,5% акриламида (акриламид: бис 37,5: 1), 1% глицерина, 0.5x КЭ, 0,01% АПС и 0,001% тетраметилендиамин.
  3. Использование 0.5x TBE буфер, как работает, запустить гель при 200 V в течение 2,5 ч при 4 ° С с циркуляцией буфера и подвергают к экрану хранения люминофора.

3 ДНК-и нуклеосом-зависимые АТФазы Анализы

Выполнение анализов АТФазы в 5 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 60 мМ NaCl, 6,6 мМ MgCl 2, 0,8 мМ ЭДТА, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% глицерина, 0,1 мг / мл BSA, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мМ АТФ, 2 мкКи [α- 32 P] АТФ (3000 Ки / ммоль). Для каждого INO80 комплекса или количества INO80 комплекса, который надо анализировать созданы три параллельные реакции, один, содержащий EB100 буфер для измерения ДНК-или нуклеосом-независимый АТФазы, одна из которых замкнутой кольцевой ДНК плазмиды (5000 б.п., ~ 30 нм) для измерения ДНК- зависит АТФазы, и один, содержащий HeLa oligonucleosomes (~ 185 нм) для измерения нуклеосом-зависимой АТФ-азы. Настройте все реакции на льду.

  • Для каждой реакции, сочетают 10-50 нм иммунологически INO80 или INO80 подкомплексов с количеством EB100 буфера, достаточном для получения объема 2,2 мкл в предварительно охлажденные смазкой 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Незамедлительно заморозить любые INO80-содержащие фракции в порошкообразной сухой лед или жидкий азот.
  • Настройка мастера коктейль. Количество каждого ингредиента, необходимого для одной реакции приведены в таблице 7. Масштабирование рецепт путем расширения с коэффициентом 3 (Х 2) 1, где Х = количество INO80 препаратов для анализа.
  • Для подготовки 'суб-коктейли », содержащий буфер только, ДНК, или нуклеосом, обойтись 2,5 (X + 2) мкл мастер коктейля на три отдельных труб. Добавить 0,3 (X + 2) мкл либо EB100, замкнутую круговую ДНК плазмиды (1,5 мкг / мкл), или HeLa oligonucleosomes (1,5 мкг / мкл) и хорошо перемешать.
  • Разливают 2,8 мкл соответствующего суб-коктейль с ферментом, содержащих реакционных труб, установленных в стEP 3.1. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы смешать; избежать введения пузырьков.
  • Для начала реакции, передать реакционные трубы до 30 ° C тепла блока с.
  • После 5, 15, 30, и 60 мин инкубации, определить 0,5 мкл каждой реакционной смеси на полиэтиленимин целлюлозы тонкослойной хроматографии (ТСХ) пластины (20 х 10 см) в прямой линии по меньшей мере, 1,5 см от нижнего края . Сразу вернуться реакционные трубы в 30 ° C тепла блока, так что несколько моментов времени можно взять от одной пробирке. После появление пятен, насухо ТСХ пластины, используя сушилку удара.
  • Перенесите ТСХ-пластин в стеклянную камеру, содержащую достаточно 0,375 М фосфата калия (рН 3,5), чтобы позволить нижние 0,5 см ТСХ пластины, которые будут погружен в раствор.
  • Накройте камеру, и развивать, пока на передней жидкой фазы не достигнет верхней части ТСХ-пластин. Немедленное высушить тарелки тщательно с использованием фена.
  • Защиту высушенных пластин ТСХ на экране накопительный люминофор при комнатной температуре.Сканирование экран с системой сканера изображений изотопов и определить количество радиоактивного субстрата АТФ и АДФ продукта.
  • Чтобы рассчитать количество АТФ гидролизуется, умножить% АТФ гидролизуется в количестве настоящее АТФ в исходной реакционной смеси с использованием следующей формулы: пмоль АТФ гидролизуется = 10 пмоль АТФ в исходной реакционной х [АДФ / (АТФ + АДФ)]

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Цифры показывают репрезентативные результаты биохимических анализов, используемых для характеристики INO80 деятельности, в том числе нуклеосоме скольжения (рисунок 1) и связывания (рисунок 2) анализов и ДНК-или нуклеосомных-зависимой АТФазы анализов (рисунок 3).

    Эксперимент показано на рисунке 1 сравнивает способность неповрежденных INO80 комплексов очищают FLAG-Ies2 или FLAG-INO80E и INO80 подкомплексов очищают либо FLAG-In...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Чтобы гарантировать, что нуклеосом ремоделирование и деятельность АТФазы мы наблюдаем в анализах зависит от каталитической активности INO80 комплексов, а не на загрязнение ремоделирования и / или ферменты, АТФазы, мы обычно анализ нуклеосом реконструкции и АТФазы каталитически неактивных версий INO80 комплексов, очищают Параллельно с дикого типа INO80 используя ту же процедуру. Негативная реакция контроль хватает АТФ также должны быть выполнены при опробования нуклеосом ремоделирования деятельности, чтобы проверить на н...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Работа в лаборатории авторов поддерживается грантом от Национального института общих медицинских наук (GM41628) и грантом для Института медицинских исследований Стоуерса от Фонда медицинских исследований Хелен Нельсон при Общественном фонде Большого Канзас-Сити.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Коктейль ингибиторов протеазыSigmaP8340
    10x ПЦР реакционный буфер Прикладная наука Рош 
    Roche Taq ДНК-полимеразаRoche Прикладная наука 
    NucAway Колонки без NucLease AmbionCat. # AM10070
    сверхчистый АТФ USB/Affymetrix77241 25 UM
    бычья сыворотка альбумин SigmaA9418 
    40% Акриламид/Бис 37,5:1Amresco0254-500ML
    Ультразвуковая ДНК спермы лосося GE Healthcare27-4565-01
    10% персульфат аммония (APS)Thermo Scientific17874
    бензоназа НовагенКат. No 70664
    dCTP, [α-32P]- 6,000 Ки/ммольPerkinElmerBLU013Z250UC
    ПЦР термоамплификатор PTC 200MJ ResearchPTC 200
    Hoefer вертикальный электрофорез установка для вертикального электрофорезаHoeferSE600X-15-1.5
    смазанная 1,5 мл микроцентрифужные пробирки Costar3207
    Накопительный люминофорный экран Молекулярная динамика63-0034-79
    3ММ фильтровальная бумагаWhatman 28458-005VWR
    Typhoon PhosphorImager GE Healthcare8600
    Программное обеспечение ImageQuantGE Healthcarever2003.02
    TLC Стеклянные пластины, PEI-целлюлоза FMillipore5725-7
    Immobilon-FL Трансферная мембрана 7 x 8,4миллипорыIPFL07810
    Обзорный измеритель общего назначения с торцевым окном или блинчиком GM (Гейгера-Мюллера) зондBiodexModel 14C
    1143509400111435094001

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
    2. Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
    3. Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
    4. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
    5. Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
    6. Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
    7. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
    8. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
    9. Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
    10. Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
    11. Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
    12. Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
    13. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
    14. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
    15. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
    16. Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    EMSAINO80

    Похожие статьи