Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52181

⸱

12 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Транскрипционная гетерогенность в стромальных клетках жировой ткани человека может быть определена на уровне одной клетки с использованием маркеров клеточной поверхности и остеогенных генов. Мы описываем протокол с использованием проточной цитометрии для выделения субпопуляций клеток с повышенным остеогенным потенциалом, который может быть использован для улучшения реконструкции черепно-лицевого скелета.

Аннотация

Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (МСК) костного мозга считаются золотым стандартом для применения тканевой инженерии на основе стволовых клеток. Тем не менее, процесс, с помощью которого они должны быть собраны, может быть связан со значительной заболеваемостью донорских участков. В отличие от них, стромальные клетки (ASCs), полученные из жировой ткани, более распространены и легче собираются, что делает их привлекательной альтернативой BM-MSCs. Как и ММК-МСК, ИСК могут дифференцироваться в остеогенные клетки линии и могут использоваться в приложениях тканевой инженерии, таких как посев на каркасы для использования при черепно-лицевых дефектах скелета. АСК получают из стромально-васкулярной фракции (СВФ) переваренной жировой ткани, которая представляет собой гетерогенную смесь АСЦ, эндотелиальных и пристеночных клеток сосудов, гладкомышечных клеток, перицитов, фибробластов и циркулирующих клеток. Проточный цитометрический анализ показал, что профиль поверхностных маркеров для АСК аналогичен профилю маркеров для БМ-МСК. Несмотря на несколько опубликованных отчетов, устанавливающих маркеры фенотипа ASC, до сих пор не существует консенсуса по поводу профилей, идентифицирующих остеопрогениторные клетки в этой гетерогенной популяции. В этом протоколе описывается, как выделить и использовать субпопуляцию ASC с повышенной остеогенной способностью для восстановления дефектов черепа критического размера.

Введение

Гетерогенная природа популяций стволовых клеток еще не полностью изучена и остается основным препятствием для разработки клинически эффективных терапевтических применений на основе стволовых клеток. Одним из наиболее распространенных способов охарактеризовать гетерогенную популяцию стволовых клеток является использование метода сортировки клеток, такого как флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS), для разделения клеток на основе профилей экспрессии их поверхностных маркеров. По мере усложнения методов сортировки становится возможным идентифицировать более отчетливые функциональные субпопуляции клеток. Микрофлюидные технологии все чаще используются для анализа экспрессии генов на уровне отдельных клеток. Мультиплексная количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) в микрофлюидном чипе позволяет проводить эффективный и надежный транскрипционный анализ одиночных клеток с высоким разрешением. 1-5

В предыдущем исследовании с использованием транскрипционного профилирования 48 генов одной клетки наблюдалась значительная транскрипционная гетерогенность среди ASC. 6 Тем не менее, распределение генов MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 продемонстрировало сильную ассоциацию с кластером клеток, обладающих высокоостеогенными транскрипционными профилями. Для выделения клеток в соответствии с этим профилем экспрессии остеогенов паттерны экспрессии поверхностных антигенов коррелировали с паттернами транскрипции, а впоследствии было обнаружено, что экспрессия поверхностных маркеров эндоглина (CD105) тесно коррелирует с повышенным потенциалом остеогенной дифференцировки ASC. Независимо от экспрессии CD105, экспрессия поверхностного рецептора Thy-1 (CD90), связанного с гликозил-фосфатидилинозитолом мембранного белка, ранее идентифицированного Chen et al. как ассоциированный с остеопрогениторными клетками, также коррелировала с экспрессией остеогенных генов. 6,7 Эти результаты дают возможность проспективно изолировать субпопуляции в рамках более крупного гетерогенного пула ASC с повышенной остеогенной способностью для применения в инженерии костной ткани на основе клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы больных были получены с информированного согласия, и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Стэнфордского университета Institutional Review Board (протокол № 2188 и № 9999).

1. Выделение клеток и культура:

  1. Получить человеческого подкожной жировой ткани от здоровых пациенток, проходящих выборные липоаспирация животе, фланг, и / или области бедра под местной / общая анестезия. Убедитесь, что Экспертный совет (IRB) одобрение получено для протокола изоляции ИСС из тканей человека и следуйте институциональные меры предосторожности при работе с такими материалами.
  2. Чтобы получить СФДВ от lipoaspirated жировой ткани, первый мыть липоаспирата три раза равными объемами стерильного 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Тщательно аспирата и отбросить нижний водный слой.
  3. Подготовка коллагеназы пищеварения буфера: 0,075% Тип I коллагеназы в ХэнкаСбалансированный солевой раствор (HBSS). Подготовка FACS буфера: 2% FBS, 1% P188 и 1% Пен-Strep в PBS. Фильтр оба решения, используя коммерчески доступный размер пор быстрый поток полиэфирсульфоновой фильтр 0,22 мкм.
  4. Переваривать промывают жировой ткани, добавить равный объем коллагеназы пищеварения буфера и помещают сосуд пищеварения надежно встряхивании на водяной бане в течение 60 мин при 37 ° С (примерно 180 качает / мин).
    Примечание: Лучше всего использовать больший объем пищеварения сосуд, чем это требуется, так как это позволяет максимально пищеварения при встряхивании (т.е. 250 мл коллагеназы пищеварения буфера 250 мл жировой ткани промывают в 1 л стерильной колбе).
  5. Нейтрализовать ферментативную активность добавлением равного объема FACS буфера и позволяет сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин. Далее, центрифуге при 233 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
  6. Тщательно аспирата и отбросить супернатант, стараясь не потревожить высокой плотности SVF гранул.
  7. Ресуспендируют осадок в 5-10 мл РТ красныйбуфера для лизиса клеток, в зависимости от размера гранул. Оставьте раствор, чтобы сидеть при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифуге при 233 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок путем добавления 5-10 мл традиционной ростовой среде, в зависимости от размера гранул (Дульбекко в модификации Дульбекко [DMEM] / 10% FBS / 1% пенициллина-стрептомицина решение [перо стрептококк]).
  9. Суспензию фильтруют через сито нейлона клеток 100 мкм для удаления остатков клеток.
  10. Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант, не нарушая гранул.
  11. Ресуспендируют осадок в 5-10 мл традиционных СМИ роста, в зависимости от размера гранул.
  12. Поместите 2 × 10 6 клеток в стандартной 15 см блюдо культуры и создать первичные культуры O / N на 37 ° C / 21% O 2, 5% СО 2. Поддержание в суб-сливающийся уровнях с целью предотвращения спонтанной дифференцировке при 37 ° С / 21% O 2, 5% СО 2 в среде роста.
    Плотность клеток в полной мере: ПРИМЕЧАНИЕсливной 15 см пластины приблизительно 4-6 х 10 6 клеток.

2. Окрашивание

  1. Культура ИСС в традиционной среде роста при 37 ° С / 21% O 2, 5% CO 2 в течение 36 ч перед окрашиванием / сортировки.
  2. Лифт ИСС от культуры пластин с использованием Accutase (в соответствии с протоколом производителя).
  3. Вымойте клеток один раз FACS-буфера (PBS с 2% FBS и 1% пера стрептококк).
  4. Центрифуга на 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
  5. Удалите супернатант, не нарушая гранул. Ресуспендируют клеток в 0,5-1 мл FACS буфера (в зависимости от числа клеток и количество антител нужной).
    ПРИМЕЧАНИЕ: объем клеточной суспензии, в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя FACS антитела, определяет концентрацию антител. Тем не менее, титрование концентрации антител, с использованием исходной концентрации 1: 100, как правило, рекомендуется, если это первый раз использовать антитела.
  6. Подсчитайте общее количествоклеток с использованием гемоцитометра.
  7. Резервный 100 мкл аликвоты в 1,5 мл центрифужные пробирки, которые будут использоваться для неокрашенной пробы и одноцветных контроля (в соответствии с количеством флуоресцентных антител, используемых).
  8. Добавьте соответствующие флуоресцентно-меченных моноклональных антител (при заданных концентраций, в соответствии с инструкциями изготовителя) и инкубировать в течение 20-30 мин на льду, защищают от света.
    1. Для обозначения остеогенной субпопуляции: Развести анти-CD90 (APC анти-CD90 человека (Thy1)) или анти-CD105 (FITC анти-человеческого CD105 (эндоглин)) в FACS буфере до концентрации 1:50.
    2. Чтобы присвоить другие клеточные популяции (например, кроветворной и эндотелиальные клетки): Развести анти-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), анти-CD34 (Anti-Human CD34 APC), и / или анти-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) в FACS буфере до концентрации 1:50.
    3. Если не используется непосредственно конъюгированных антител, использовать биотинилированного первичного антитела с соответствующим стрептавидин-конъюгированные второйичных антитела, такие как стрептавидин PE-Cy7, в разведении 1: 100.
  9. После инкубации промыть клетки дважды: заполнить трубы с буфером FACS и центрифуги в 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, супернатант аспирацией.
  10. Ресуспендируют клеток в 400-500 мкл FACS буфера и фильтра образцов через сито нейлон клеток 70 мкм, чтобы удалить скопления клеток.
  11. Передача меченых клеток в FACS труб с фильтром верхней и сохранить образцы на льду в течение всего срока анализа.

3. флуоресценции активирован сортировки клеток

Примечание: Следующие шаги мандат предыдущие знания в флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) или помощь квалифицированным специалистом.

  1. Использование программного обеспечения соответствующих FACS, анализа проектирования участков для изучения рассеяния вперед (ФСБ), боковое рассеивание (SSC), Фикоэритрин (PE) -Texas Красный, Pacific Blue, флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), аллофикоцианином (APC) и любое другое использование флюорофорd маркировать клетки.
  2. Перед загрузкой в ​​клеточного сортера, кратко вихря каждого образца для ресуспендирования клеток.
  3. Начать с анализом образца неокрашенной, чтобы установить ворота для общего количества клеток, чтобы исключить продукты распада клеток, а для определения базового аутофлюоресценция.
  4. Добавить пропидийиодидом (PI) для неокрашенной пробы и анализировать ее для того, чтобы визуализировать население живых клеток в общей численности населения клеток. Построить ворота вокруг этого населения.
  5. Анализ контрольного образца одного цвета для каждого флуорохромом, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
  6. Анализ окрашенных образец, чтобы установить положение ворот для сортировки.
  7. Добавить PI для окрашенных образца для того, чтобы окрашивать мертвые клетки.
  8. Сортировать меченых клеточных популяций. Сортировка в любой 1,5 мл центрифужные пробирки или конические пробирки (15 мл), содержащем культуральную среду.
  9. Вручную прекратить сортировки когда была получена необходимое количество клеток.
  10. Намчисле FACS, выполните проверку на чистоту с помощью анализа небольшую долю (напр.,, 500 ячеек) приобретенной клеточной популяции.
    Примечание: Этот шаг подтверждает чистоту отсортированных клеточных популяций. В идеале, чистота должна быть больше, чем 90-95%.
  11. Центрифуга клетки при 233 мкг в течение 5 мин при 4 ° С сразу после завершения сортировки и ресуспендируют в 1 мл свежей среды, содержащей 10% FBS.
    Примечание: Количество используемых сред может быть увеличена в зависимости от размера из клеточного осадка.
  12. Пластина на покрытые желатином пластин для повышения жизнеспособности клеток. В зависимости от конечного выхода клеток, пластины 300000 клеток на лунку в 6-луночный планшет, 100000 клеток на лунку в 12-луночный планшет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование CD90 в качестве маркера для клеток с улучшенными результатами остеогенеза в изоляции из высокообогащенного населения человеческих ИСС (рис 1а, 1б). ИСС окрашивали Pacific Blue-сопряженных анти-человеческого CD45, FITC-сопряженных анти-человеческого CD105 и APC-сопряженных анти-человеческого CD90. После сортировки, уровень чистоты был больше, чем 98%, как количественно с помощью анализа после сортировки.

Определение группы элементов на основе транскрипции профил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящее время, изоляция однородных групп населения ИСС из SVF в жировой ткани человека остается сложной, хотя желанной целью. Выделение про-остеогенных ASC субпопуляций особенно желательно, так как такие клетки могут быть использованы для изучения формирования и гомеостаз скелетных тканей. Тем не менее, SVF жировой ткани таит значительную неоднородность в отношении стволовых потенциала и дифференцировки клеток потенциал. 11 Молекулярная основа для этого неоднородности не могут быть поняты из объединенных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеют финансовую заинтересованность в какую-либо продукцию, устройств или наркотиков, упомянутых в этой рукописи. Ни один из авторов не имеют каких-либо конкурирующих финансовых интересов, чтобы сообщить.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным институтом исследований в области здравоохранения гранта R01-DE021683-01 и национальных институтов исследований в области здравоохранения гранта R01-DE019434 в MTL; Медицинского института Говарда Хьюза исследовательский грант на MTCDCW была поддержана ACS Франклин Мартин факультета исследовательский грант, The Hagey лаборатории детской регенеративной медицины и Стэнфордский исследовательский университет Здоровье ребенка института факультета Scholar Award.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Одноразовые конические пробирки 250 млCorning (Thomas Scientific)2602A43
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Gibco15140-122
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAXGibco10566-016
PBS, pH 7,4Gibco10010-023
Бетадин - антисептик Повидон/Раствор йодаPurdue PFC-67618015017
Сбалансированный солевой раствор Хэнка, 1XCellgro21-023-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, происхождение из СШАGibco16000-044
Коллагеназа из  Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130-5G
ACCUTASE Cell DetachmentSolution Стволовые Клеточные Технологии7920
APC Мышиный античеловеческий CD90BD Фарминген559869
FITC Мышиный античеловеческий CD105 (Эндоглин)BD Фарминген561443
Античеловеческий CD45 eFluor 450 (замена тихоокеанского голубого) eBioscience48-9459-41
Античеловеческий CD34 APCeBioscience17-0349-41
Античеловеческий CD31 (PECAM-1) PEeBioscience12-0319-41
Стрептавидин PE-Cy7eBioscience25-4317-82
BD FACS Aria II приборBD Biosciences
BD FACSDiva Программное обеспечениеBD Biosciences

Ссылки

  1. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
  2. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
  3. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
  4. Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
  5. Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
  6. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
  7. Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
  8. Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
  9. Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
  10. James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720(2009).
  11. Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
  12. Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211(2011).
  13. Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585(2013).
  14. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  15. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  16. Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
  17. McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
  18. Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8(2014).
  19. Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD90
Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.