Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

12.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52298

⸱

28 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Способ был разработан, чтобы непосредственно получить человека нервные стволовые клетки из гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенных из клеток периферической крови.

Аннотация

Человек по конкретным заболеваниям нейронные культуры имеют важное значение для создания в моделях пробирке для неврологических заболеваний человека. Тем не менее, отсутствие доступа к первичной человеческой взрослых нейронных культур вызывает уникальные проблемы. Последние события в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) обеспечивает альтернативный подход для получения нейронных культур из фибробластов кожи через пациента конкретной IPSC, но этот процесс является трудоемким, требует специальных знаний и большого количества ресурсов, и может занять несколько месяцев. Это препятствует широкому применению этой технологии для изучения неврологических заболеваний. Для преодоления некоторых из этих вопросов, мы разработали метод для получения нервные стволовые клетки непосредственно из человеческого взрослых периферической крови, минуя процесс выведения IPSC. Гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенные от взрослого человека периферической крови культивировали в пробирке и трансфицировали вирусных векторов, содержащих Сендай факторы транскрипции Sox2, октябрь3/4, Klf4 и C-Myc. Результаты трансфекции в морфологических изменений в клетках, которые в дальнейшем выбранных с помощью человека среда нейронной предшественников, содержащий основной фактор роста фибробластов (bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Полученные клетки характеризуются выражения для нейронных маркеров стволовых клеток, таких как нестина и SOX2. Эти нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами, астроглию и олигодендроциты в указанной среде для дифференцировки. Использование легко доступных образцов периферической крови человека, этот способ может быть использован для получения нервные стволовые клетки для дальнейшей дифференциации нервных клеток к для моделирования в пробирке неврологических расстройств и может продвинуть исследования, связанные с патогенезе и лечении этих заболеваний.

Введение

В пробирке нейронов культуры были использованы в качестве основополагающего инструмента исследований неврологических заболеваний. Первичный животных (в основном грызунов) нейронные культуры 1, 2 и нейронные клеточные линии человека, полученные из глиомы или других опухолей наиболее часто используемый в таких исследованиях. Тем не менее, было признано, что существуют значительные различия между грызунов и клетках человека. Многие выводы, основанные на грызунах не могут быть переведены на людей. Кроме того, с быстрым развитием анализа массы геномной информации и относительно легко редактировать генов и весь секвенирование генома, тенденция становится все более и более ориентированы на обнаружение заболевания, склонные гены и разграничения их функций и роли в конкретных заболеваний, что делает несколько человеческих нейронов клеточные линии ограничивается только использованием. Теоретически, первичные нервные культуры человека, полученные из образцов пациентов нервной системы лучший выбор, но их невозможно получить; следовательно, альтернатива метОРВ необходимо. В последние годы некоторые подходы были использованы, с двумя является наиболее различимы. После развития техники генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью мыши и соматических клеток человека 3, 4, нервные клетки могут быть дополнительно отличается от них 5-7. Тем не менее, генерации и характеризующие IPSC требует интенсивного труда, методы и ввод времени, иногда даже чрезмерно. Вскоре после этого, еще один подход был разработан, чтобы преобразовать непосредственно нервных клеток из соматических клеток 8, 9. Как в результате нейроны непролиферативная, он ограничивает его применение в интенсивных исследований и скрининга лекарственных средств, что требует большого количества клеток. Для того, чтобы преимущества обеих технологий, прямой вывод нервных стволовых клеток / клеток-предшественников из соматических клеток были изучены несколько групп 10-12, который обходит утомительный процесс генерации IPSC и характеристике, но еще предоставледе приличное число нервных стволовых клеток для последующего нервной дифференциации. Ранее мы показали, что после введения транскрипционных факторов Яманака в гемопоэтических клеток-предшественников, нервные стволовые клетки могут быть непосредственно получены с использованием нейронной клетки-предшественника, выбирающий среду 13. Здесь мы сообщаем метод в деталях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Обогащение гемопоэтических клеток-предшественников из взрослых цельной крови

Примечание: гемопоэтических предшественников клетки или клетки CD34 + могут быть очищены от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных из различных источников, включая пуповинную кровь, лейкафереза ​​материала и цельной крови с помощью методов, основанных центрифугирования в градиенте плотности. Способ перечисленные здесь использует цельную кровь в качестве примера.

  1. Выделение МНПК из цельной крови:
    1. Добавить 4,5 мл разделения лимфоцитов среды в SepMate трубки с помощью пипетки через центральное отверстие пластины.
    2. Развести пробы крови с равным объемом стерильного DPBS, содержащих 2% сыворотки человека (об / об). Например, развести 5 мл образца с 5 мл DPBS + 2% сыворотки крови человека.
    3. Добавить разведенного образца с помощью пипетки вниз сторону трубы. Будьте осторожны, не залейте образец непосредственно через центральное отверстие.
    4. Центрифуга при 1200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Осторожно снимите выше слоя ВКПМ супернатант.
    6. Соберите слой РВМС (Облачно) в новую пробирку.
    7. Добавить 15 мл Дульбекко фосфатно-солевом буфере (DPBS), содержащей 2% сыворотки человека в трубку и центрифуге при 150 х г в течение 10 мин при комнатной температуре с вынул.
    8. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 15 мл DPBS, содержащих 2% сыворотки человека. Подсчитайте количество клеток.
    9. Центрифуга при 690 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить все супернатант из трубки.
    10. Ресуспендируют клеток в 1 х 10 7 клеток на 15 мл Искова модифицированной Дульбекко среды (IMDM), содержащей 1% антибиотиков (об / об) и 10% сыворотки человека (об / об).
    11. Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора до выделения CD34 + клеток.
  2. Положительный отбор CD34 + клеток от РВМС, используя CD34 Multisort набор:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работать быстро и использовать предварительно охлажденный решения, чтобы сделать клетки холода и предотвратить ограниченного выделенияантител на клеточной поверхности и неспецифической маркировки клеток в инструкции комплекта.
    1. Соберите все PMBCs в 50 мл пробирку и подсчитать общее количество клеток в среде.
    2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин. Удалить все супернатант полностью.
    3. Ресуспендируют до 10 8 клеток на 300 мкл в буфере борта (DPBS, содержащих 0,5% человеческий сывороточный (объем / объем) и 2 мМ ЭДТА).
    4. Добавить 100 мкл FcR блокирующий реагент и добавить 100 мкл CD34 MultiSortMicroBeads.
    5. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 30 мин в холодильник (2 - 8 ° C).
    6. Промыть клеток путем добавления 2 мл буфера на шарик 10 8 клеток и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант полностью.
    7. Ресуспендируют до 10 8 клеток в 500 мкл буфера.
    8. Поместите колонку MACS LS в магнитном поле MACS Сепаратор и колонки подготовить промывкой 3 мл борта буфера.
    9. Применить клеточной суспензии на центрог колонны. Немеченные клетки будет течь через которые могут быть собраны при желании.
    10. Промыть колонку три раза с 3 мл буфера борта.
    11. Удалить столбец из сепаратора и поместите его на 15 мл трубки.
    12. Добавляют 5 мл буфера борта на колонку и сразу же промыть с магнитным меченых клеток путем нажатия на поршень в колонну.
    13. Добавить 20 мкл Multisort выпуска реагента на 1 мл клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник (2 - 8 ° C).
    14. Добавить 1 - 2 мл буфера на шарик 10 7 клеток и центрифуги клетки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант полностью.
    15. Ресуспендируют клеток в 50 мкл из бисера буфера на 10 7 клеток.
    16. Добавить 30 мкл Multisort Стоп-реагент на 10 7 клеток и инкубировать в течение 15 мин в холодильник.
    17. Добавляют 5 мл буфера борта и центрифуги клетки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.

2. Вывод индуцированных нейронных стволовых клеток из CD34 + клеток

  1. CD34 + клетки культуры:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный среда должна быть использована в течение 7 дней при хранении в холодильнике. Значительные потери CD34 клетки можно было наблюдать через 24 часа, но значительное увеличение числа клеток должен быть заметен, особенно после того, как день 5. Если число клеток непрерывно уменьшается или нет пролиферации, это означает, либо плохое качество среды или CD34 клеток и клеток Не следует использовать на следующей стадии.
    1. Ресуспендируют и культуры CD34 + клетки в CD34, поддерживающие среду (StemSpan SFEM среду, содержащую человеческий тромбопоэтин (TPO, 100 нг / мл), FMS-такие как тирозинкиназы 3 (Flt-3) лиганда (100 нг / мл) и фактор стволовых клеток (SCF, 100 нг / мл), интерлейкин-6 (ИЛ-6, 20 нг / мл) и интерлейкин-7 (IL-7, 20 нг / мл)) в 24-луночный планшет (до 3 × 10 5 / лунку в 1 мл среды на лунку) при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе.
    2. Мтер 24 ч, собирать плавающих клеток и центрифуги клетки при 110 мкг при комнатной температуре, чтобы избавиться от всех присоединенных клеток и клеточных обломков. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей среды CD34 поддержание и семени в новом 24-луночного планшета (до 1 х 10 5 / лунку) при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе в течение 5 дополнительных дней.
    3. Замена половины среде каждый другой день, тщательно аспирации верхнюю половину супернатанта в то время как CD34 + клетки, плавающей на дне лунки (фиг.1А).
  2. Вирус Сендай трансфекции:
    1. На 5-й день, собирают клетки CD34 и центрифуги клетки при 170 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    2. Ресуспендируют клеток в свежей среде при 1 × 10 5 / лунку в 24-луночный планшет в 1 мл среды.
    3. Оттепель перепрограммирования комплект cytotune-IPS Сендай, сначала погружения днища труб в водяной бане при 37 ° в течение 10 сек, а затем полностью таятьт RT. Кратко центрифуги трубы и поставить их на лед. Подготовка вируса смесь Сендай путем смешивания Рекомендуемый объем каждого вируса, указанному на сертификате анализа (COA) для соответствующего лота. МВД 15 рекомендуется.
    4. Добавить вируса Сендай смесь в каждую лунку CD34 клеток. Смешайте скважин, осторожно встряхивая. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    5. Обратите внимание на эффективность трансфекции после 24 часов. Обратите внимание, что сотовые заполнители и формирование сфере индикаторы для успешной трансфекции (рис 1б).
    6. Изменить половина среды, тщательно передачи верхнюю половину среды в другую также. Если есть какие-клеточные шарики в новой скважины, добавить такое же количество свежей средой.
    7. Изменить среду каждые другой день, повторяя шаг 2.2.6.
  3. Нервные стволовые клетки индукция:
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от условий клеток, около 5 или 7 дней после трансфекции, однослойные прилипшие клетки достигнет 30 -50% слияния (рис 1С).
    1. Удалить надосадочную жидкость, содержащую плавающие клеток и сфер, а затем добавить 1 мл нейронной среде предшественника (Дульбекко в модификации Дульбекко: питательной смеси F-12 (DMEM / F12), содержащий 1x N2 добавки, 0,1% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина ( БСА), 1% (об / об) антибиотики, 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 20 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF)) в адгезивных клеток.
    2. При желании, диссоциируют клеточные сферы, осторожно пипеткой и центрифуги клетки при 170 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл среды нейронной предшественников в новом 24-луночного планшета, покрытого Матригель в инструкции, резервного копирования.
    3. Изменение среды каждый день до клетки достигают 60 - 80% сливной, как правило, после 1 недели.
    4. Удалите супернатант и добавить 1 мл среды нервных стволовых клеток (сыворотка среде, свободной НСК SFM). Диссоциации клеток с помощью скребка клеток с последующимочень осторожно пипеткой.
    5. Удалить клетки и семена все из них в одну лунку 6-луночного планшета с. Добавить еще 1 мл нервных стволовых клеток среды, чтобы сделать 2 мл среды для каждой скважины. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    6. Изменить среду каждые другой день.
    7. Когда клетки достигли 60% слияния, отделить и replate клеток при соотношении 1: 3, следуя инструкциям в разделе 2.3.4 и 2.3.6.
  4. Замораживание стволовых нервных клеток:
    1. Подготовка нервной стволовой клетки замораживания среды путем добавления 20% диметилсульфоксида (ДМСО) в нейронной стволовых клеток среды. Держите морозильной среду на льду.
    2. Диссоциации клеток в 6-луночный планшет с использованием скребка клеток с последующим осторожным пипетированием. Граф клеток. Центрифуга клетки при 170 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    3. Ресуспендируют клеток в нервные стволовые клетки среды на 1 х 10 6 / мл. Добавить такой же объем замораживания среды к клеткам.
    4. Добавить 1 мл (5 х 10 5 Всего клетки) клеток в криопробирку. Замораживание клеток с использованием замораживания контейнер Г-н FROSTER следующий инструкции.

3. нервных клеток Дифференциация

  1. Нервных клеток дифференциация:
    1. Когда нервные стволовые клетки достигают 80% слияния, снять нервные стволовые клетки с помощью резинового шпателя, а затем отделить осторожно пипеткой.
    2. Граф клеток и регулировать концентрацию до 1 х 10 5 / мл в нервные стволовые клетки среде.
    3. Для нейрональной дифференцировки, пластины клеток на поли-D-лизином / ламинина покрытием покровные стекла в 24-луночные планшеты при 1 × 10 5 / лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    4. Замените среду с нервной дифференциации среды (DMEM / F12, содержащей 1x N2 дополнения, 1x B27 добавки, 300 нг / мл лагеря, 0,2 мм витамин С, 10 нг / мл мозг нейротрофического фактора (BDNF) и 10 нг / мл глиальных клеток происходит нейротрофического фактора (GDNF)) AFтер 24 ч. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    5. Изменить нейронной дифференциации среду дважды в неделю в течение 2 недель.
  2. Астроглиальных дифференциация:
    1. Отделить нейронных стволовых клеток с помощью пипетки.
    2. Количество клеток и регулировать концентрацию клеток до 5 х 10 4 клеток / мл. Семенной клеток на 24-луночных планшетах. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    3. Замена среды с DMEM / F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и клетки инкубируют при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе.
    4. Изменить среднего дважды в неделю в течение 2 недель. Если клетки достигают слияния до 2 недель, replate клетки следующие шаги 3.2.1 и 3.2.2.
  3. Олигодендроцитов дифференциация:
    1. Отделить нейронных стволовых клеток с помощью пипетки.
    2. Подсчитайте клетки и семена 1 х 10 5 клеток на поли-L-орнитин покрытием 24-луночных планшетах в 1 мл олигодендроцитов differentiвания среда, состоящая из DMEM / F12, содержащей N2 добавки, 10 нг / мл тромбоцитарного фактора роста-АА (PDGF-AA), 2 нг / мл нейротрофин-3 (NT-3), 2 нг / мл звуковой ежа ( Тсс), и 3 нМ трийодтиронина (Т3). Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатор.
    3. Изменить среднего дважды в неделю в течение 2 недель.
    4. Замените среду с DMEM / F12 с 1xN2 дополнения и 3 нМ T3 и культуры клеток на одну неделю для основного белка миелина (ОБМ) производства.

4. Иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Замена среды с 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Отменить PFA и промывают ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100 (PBS-T) 3 раза, 5 мин каждый раз.
  3. Проницаемыми клеток ФБР, содержащим 0,5% Тритон Х-100 в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Блок клетки с PBS-T, содержащий 4% козьей сыворотки в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Инкубируйте клетки с соответствующей первичной antiboумирает разводили в PBS-T, содержащем 0,1% БСА в течение 2 часов при комнатной температуре или O / N в холодной комнате.
  6. Промыть клетки 3 раза с PBS-T, 5 мин каждый раз. Инкубируйте клетки с соответствующими вторичными антителами в сочетании с флуорохромом с использованием 1: 400 разбавлени в PBS-T, содержащем 0,1% BSA в течение 1 часа на шейкере в темноте.
  7. Промыть клетки с PBS-T, содержащем 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  8. Промыть клетки еще два раза с PBS-T в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
  9. Соблюдайте меченых клеток с помощью микроскопа и сфотографироваться (Рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Качество CD34 клеток имеет решающее значение для успеха нервной трансдукции стволовых клеток. Высокое качество CD34 клетки пролиферируют в течение первых двух дней культуры и появляются как не сторонник, равномерно круглых клеток, плавающих чуть выше нижней части сосудов для культивирования (рис 1А). Успешные результаты инфекции в клеточных агрегатов, которые со временем расширятся (рис 1б), в то время как неспецифические клеточные агрегаты могут возникнуть при культивировании кле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подробный протокол, чтобы непосредственно генерировать нервные стволовые клетки из периферической гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается.

По сравнению с фибробластов, периферической крови человека является более доступным. Использование подарил протокол, более чем 1 х 10 5 клеток кроветворной предшественников, или CD34-положительных клеток, может быть обогащен с 10 мл цельной крови. Хотя загрязнение тромбоцитов, как правило, не предотвратить, может быть легко умень...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Исследование финансируется из внутренних фондов NIH.

Благодарности

У авторов нет конфликтов интересов, которые можно раскрыть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда для разделения лимфоцитовLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 мл
Сыворотка крови человекаInvitrogen34005-100
АнтибиотикиGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS колонкаMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM medium StemcellTechnologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 нг/мл
Flt-3Peprotech300-19100 нг/мл
SCFPeprotech300-07100 нг/мл
IL-6Peprotech200-0620 нг/мл
IL-7Peprotech200-0720 нг/мл
IPS Sendai Reprogramming KitLife TechnologiesA1378001
Скребок для клетокSarstedt83.183
DMSO SigmaD2650
CryoTube флаконыТермо368632
Контейнер Mr. Frosty Thermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
N2 добавкаLife Technologies17502-0481x
Бычья сыворотка альбуминSigmaA29340.1% (w/v)
bFGFPeprotech100-18B20 нг/мл
EGFPeprotechAF-100-15
B27 добавкаLife Technologies17504-0441x
NSC сыворотка беззащитная средаLife TechnologiesA10509011x
поли-D-лизин/ламинин покрытая покровными стекламиBD Bioscences354087
цАМФSigmaA9501300 нг/мл
Витамин CSigmaA02780,2 мМ
BDNFPeprotech450-0210 нг/мл
GDNFPeprotech450-1010 нг/мл
поли-L-орнитинSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 нг/мл
NT-3Peprotech450-032 нг/мл
ShhPeprotech1314-SH/CF2 нг/мл
T3SigmaT63973 нМ
PFASigmaP61484%
PBSКачество Биологический119-069-1011x
Козья сывороткаSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Мышиный моноклональный анти-Nestin MilliporeAB59221:1,000 разведение
Anti-SOX2 антителоApplied StemcellASA0120Готовое к применению
анти-&бета мышиное средство; Антитело к III-тубулинуPromegaG712Aв соотношении 1:1,000
Антитело кролика против GFAPSigmaG4546в соотношении 1:100
Антитело против O4R& D SystemsMAB1326IgM; 1 нг/мл
Alexa Fluor 594 козье антитело против кроликаLife techniologiesA110121:400 разведение
Alexa Fluor 488 козье антитело против мышиLife techniologiesA110011:400 разведение
Alexa Fluor 488 козье антитело против мышиIgM Life techniologiesA210421:250 разведение
DAPISigmaD95421 μ г/мл

Ссылки

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801(2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720(2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансфекция вирусом СендайCD34 периферической кровисреда для нейральных предшественниковиммунофлуоресцентная микроскопияэкспрессия нестина и SOX2нейрональная дифференцировкагенерация астроцитов и олигодендроцитовметод прямой индукции
Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.