Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Tongguang Wang; Elliot Choi; Maria Chiara G. Monaco; Eugene O. Major; Marie Medynets; Avindra Nath

doi:10.3791/52298

Методическая статья

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

DOI:

10.3791/52298

⸱

28 января 2015 г.

Tongguang Wang¹ , Elliot Choi¹ , Maria Chiara G. Monaco² , Eugene O. Major² , Marie Medynets¹ , Avindra Nath¹

¹Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, ²Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способ был разработан, чтобы непосредственно получить человека нервные стволовые клетки из гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенных из клеток периферической крови.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человек по конкретным заболеваниям нейронные культуры имеют важное значение для создания в моделях пробирке для неврологических заболеваний человека. Тем не менее, отсутствие доступа к первичной человеческой взрослых нейронных культур вызывает уникальные проблемы. Последние события в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) обеспечивает альтернативный подход для получения нейронных культур из фибробластов кожи через пациента конкретной IPSC, но этот процесс является трудоемким, требует специальных знаний и большого количества ресурсов, и может занять несколько месяцев. Это препятствует широкому применению этой технологии для изучения неврологических заболеваний. Для преодоления некоторых из этих вопросов, мы разработали метод для получения нервные стволовые клетки непосредственно из человеческого взрослых периферической крови, минуя процесс выведения IPSC. Гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенные от взрослого человека периферической крови культивировали в пробирке и трансфицировали вирусных векторов, содержащих Сендай факторы транскрипции Sox2, октябрь3/4, Klf4 и C-Myc. Результаты трансфекции в морфологических изменений в клетках, которые в дальнейшем выбранных с помощью человека среда нейронной предшественников, содержащий основной фактор роста фибробластов (bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Полученные клетки характеризуются выражения для нейронных маркеров стволовых клеток, таких как нестина и SOX2. Эти нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами, астроглию и олигодендроциты в указанной среде для дифференцировки. Использование легко доступных образцов периферической крови человека, этот способ может быть использован для получения нервные стволовые клетки для дальнейшей дифференциации нервных клеток к для моделирования в пробирке неврологических расстройств и может продвинуть исследования, связанные с патогенезе и лечении этих заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В пробирке нейронов культуры были использованы в качестве основополагающего инструмента исследований неврологических заболеваний. Первичный животных (в основном грызунов) нейронные культуры ^{1, 2} и нейронные клеточные линии человека, полученные из глиомы или других опухолей наиболее часто используемый в таких исследованиях. Тем не менее, было признано, что существуют значительные различия между грызунов и клетках человека. Многие выводы, основанные на грызунах не могут быть переведены на людей. Кроме того, с быстрым развитием анализа массы геномной информации и относительно легко редактировать генов и весь секвенирование генома, тенденция становитс....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обогащение гемопоэтических клеток-предшественников из взрослых цельной крови

Примечание: гемопоэтических предшественников клетки или клетки CD34 + могут быть очищены от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных из различных источников, включая пуповинную кровь, лейкафереза материала и цельной крови с помощью методов, основанных центрифугирования в градиенте плотности. Способ перечисленные здесь использует цельную кровь в качестве примера.

Выделение МНПК из цельной крови:
1. Добавить 4,5 мл разделения лимфоцитов среды в SepMate трубки с помощью пипетки через центральное отверстие пластины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Качество CD34 клеток имеет решающее значение для успеха нервной трансдукции стволовых клеток. Высокое качество CD34 клетки пролиферируют в течение первых двух дней культуры и появляются как не сторонник, равномерно круглых клеток, плавающих чуть выше нижней части сосудов для культивирования (рис 1А). Успешные результаты инфекции в клеточных агрегатов, которые со временем расширятся (рис 1б), в то время как неспецифические клеточные агрегаты могут возникнуть при культивировании клеток, к.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробный протокол, чтобы непосредственно генерировать нервные стволовые клетки из периферической гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается.

По сравнению с фибробластов, периферической крови человека является более доступным. Использование подарил протокол, более чем 1 х 10 ⁵ клеток кроветворной предшественников, или CD34-положительных клеток, может быть обогащен с 10 мл цельной крови. Хотя загрязнение тромбоцитов, как правило, не предотвратить, может быть легко умень.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование финансируется из внутренних фондов NIH.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые можно раскрыть.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Среда для разделения лимфоцитов	Lonza	17-829E	1x
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 мл
Сыворотка крови человека	Invitrogen	34005-100
Антибиотики	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2 mM
MACS LS колонка	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM medium Stemcell	Technologies	9650	1x
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1x
TPO	Peprotech	300-18	100 нг/мл
Flt-3	Peprotech	300-19	100 нг/мл
SCF	Peprotech	300-07	100 нг/мл
IL-6	Peprotech	200-06	20 нг/мл
IL-7	Peprotech	200-07	20 нг/мл
IPS Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A1378001
Скребок для клеток	Sarstedt	83.183
	DMSO Sigma	D2650
CryoTube флаконы	Термо	368632
Контейнер Mr. Frosty Thermo		5100-0001
DMEM/F12	Life Technologies	12400-024	1x
N2 добавка	Life Technologies	17502-048	1x
Бычья сыворотка альбумин	Sigma	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 нг/мл
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 добавка	Life Technologies	17504-044	1x
NSC сыворотка беззащитная среда	Life Technologies	A1050901	1x
поли-D-лизин/ламинин покрытая покровными стеклами	BD Bioscences	354087
цАМФ	Sigma	A9501	300 нг/мл
Витамин C	Sigma	A0278	0,2 мМ
BDNF	Peprotech	450-02	10 нг/мл
GDNF	Peprotech	450-10	10 нг/мл
поли-L-орнитин	Sigma	P4957	1x
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 нг/мл
NT-3	Peprotech	450-03	2 нг/мл
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 нг/мл
T3	Sigma	T6397	3 нМ
PFA	Sigma	P6148	4%
PBS	Качество Биологический	119-069-101	1x
Козья сыворотка	Sigma	G9023	4%
TritonX-100	Sigma	T9284
Мышиный моноклональный анти-Nestin Millipore		AB5922	1:1,000 разведение
Anti-SOX2 антитело	Applied Stemcell	ASA0120	Готовое к применению
анти-&бета мышиное средство; Антитело к III-тубулину	Promega	G712A	в соотношении 1:1,000
Антитело кролика против GFAP	Sigma	G4546	в соотношении 1:100
Антитело против O4	R& D Systems	MAB1326	IgM; 1 нг/мл
Alexa Fluor 594 козье антитело против кролика	Life techniologies	A11012	1:400 разведение
Alexa Fluor 488 козье антитело против мыши	Life techniologies	A11001	1:400 разведение
Alexa Fluor 488 козье антитело против мыши	IgM Life techniologies	A21042	1:250 разведение
DAPI	Sigma	D9542	1 μ г/мл

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи