Методическая статья

Оценка эффективности снадобья рака сенсибилизации

DOI:

10.3791/52388

⸱

6 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мониторинг метаболизма опухолевых клеток в реальном времени в сочетании с моделью метастазирования на основе хорио-аллантоисной мембраны куриного эмбриона (CAM) in vivo используются для оценки новых противораковых мишеней/агентов на предмет их способности сенсибилизировать опухолевые клетки к химиотерапии, повреждающей ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из-за высокого уровня неоднородности и мутаций, присущих злокачественных опухолей человека, терапии монотерапии или комбинации препаратов, которые нацелены на один и тот же путь, скорее всего, не удастся. Упор должен быть сделан на ингибирование путей, ответственных за внутренней и / или адаптивной резистентности к терапии. Активное поле исследования является разработка и тестирование ингибиторов репарации ДНК, которые способствуют действия, и предотвратить сопротивление, обычно используется химиотерапии и лучевой терапии. Мы использовали новый протокол, чтобы оценить эффективность торможения BRCA2 в качестве средства для информирования опухолевых клеток с ДНК повреждающим цисплатин наркотиков. Метаболизм опухолевых клеток (подкисление и дыхание) отслеживали в режиме реального времени в течение 72 ч, чтобы очертить эффективность лечения на минуту за минутой основе. В сочетании, мы провели оценку метастатическим частоты с использованием куриного эмбриона хориоаллантойной мембраны (CAM) Модель кровоподтек и вторжения. ЭтоПротокол рассматриваются некоторые из недостатков, обычно используемых в пробирке и в методах естественных условиях, чтобы оценить режимы новые терапии рака. Он может быть использован в дополнение к обычным методам, таким как анализах пролиферации клеток, клеточной гибели анализов, и в естественных исследованиях на мышах ксенотрансплантатов, чтобы более точно различить среди кандидатов целей и агентов, и выбрать только наиболее перспективных кандидатов для дальнейшего развития.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приобретенная устойчивость к целенаправленной и / или лечения рака цитотоксические является важным клиническим проблема, которая может привести к неэффективности лечения, рецидивов, и увеличение смертности пациентов 1. Учитывая высокий уровень неоднородности в большинстве опухолей, что является математической уверенности, что опухоль достаточно большое количество клеток будет содержать подмножество клеток, устойчивых к одной или комбинированных препаратов, направленных на молекулярных путей, по которым эти клетки зависит выживание 2,3. Такие опухолевые клетки могут быть отобраны положительно во время лечения, что приводит к рецидива заболевания. Разработка новых методов лечения, которые одновременно нацелены на различные механизмы выживания раковых клеток, либо до, либо после выбора лечения опосредованного, таким образом, клинически значимым.

Высокий уровень нестабильности генома и мутации в геномах опухолевых является основной характеристикой, которая отличает раковые клетки от клеток-хозяев неопухолевых 4. Следовательно, usefuл стратегия повысить эффективность ДНК-повреждения химиотерапии и предотвратить развитие резистентности является активно ингибируют репарацию ДНК в опухолевых клетках 5. Это активное поле исследования и различных новых целей репарации ДНК в настоящее время изучаются в доклинических настройки. Количество малых молекул или антисмысловых на основе ингибиторов этих целей были разработаны и проходят испытания 6-8. Цель заключается в выявлении наиболее перспективных доклинические кандидатов и оценить их эффективность и безопасность в клинических испытаниях.

Высокая стоимость клинических испытаний и риск неудачи (по различным причинам, включая неоптимальной доклинических оценки) являются огромные препятствия на пути прогресса в разработке новых методов лечения 9. Использование соответствующих и строгих доклинических моделях адекватно оценить новые терапевтические цели и кандидаты препараты могут уменьшить высокий процент неудач клинических испытаний 10 .

Некоторые часто используемые доклинические методы оценки эффективности новых схем противораковых являются: а) измерение способности уменьшать пролиферацию опухолевых клеток в пробирке (пролиферации клеток анализах) б) снижение, терапия-индуцированного потенциала опухолевых клеток к Форма тканевых культур колонии (образование колоний анализы), с) уменьшение индуцированной терапии в метаболической активности опухолевых клеток в пробирке (конверсии окислительно-восстановительный краситель), г) терапии-индуцированной индукции в пробирке опухолевых клеток смерти (апоптоза, некротические, аутофагической, связанного с митоза и другие) 11 и Е), в естественных условиях терапии-индуцированной снижение роста или абляции человека и мыши ксенотрансплантатах 12-14.

Основным недостатком методов перечисленных в пробирке в том, что ни один из них не даёт постоянную оценку в режиме реального времени эффекта кандидатов терапии. Скорее, они предоставляют информацию только на отдельных, широко разделенных временных точкахв течение курса лечения. Такие измерения, утрата способности точно отражать величину и сроки ответов опухолевых клеток. В естественных условиях модели мыши ксенотрансплантата также ограничены высокой стоимостью, длина времени, чтобы завершить, и риск неоптимального дозирования и лечения времени (планирование). Кроме того, есть свидетельства, что модели грызунов ксенотрансплантатов ограниченные предсказатели клинической эффективности у людей, по сравнению с в пробирке оценки ответов первичных опухолевых клеток человека и установления клеточных линий опухолей человека кандидату терапевтических вмешательств 15,16.

Мы разработали новый протокол комбинации, чтобы оценить новые комбинации лекарственных средств до клинически, таким образом, устраняются недостатки наиболее распространенных процедур, указанных выше. На месте распространения, формирования колонии, или окислительно-восстановительной красителей анализов преобразования, мы использовали единицы измерения, метаболизм, чтобы проанализировать адгезию клеток, дыхание, и подкисления в режиме реального временив течение всего периода лечения 17. Одновременно, мы исследовали влияние комбинированного лечения в естественных условиях с помощью куриных эмбрионов хориоаллантойной мембрана (CAM) модели инвазии и метастазированию 18,19. Мы использовали эти методы для оценки способности антисмысловой олигонуклеотид (ASO) таргетирования BRCA2 усиливать эффективность широко используемого химиотерапевтического цисплатин наркотиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был разработан для использования с адгезивными клетками. Изменения должны применять этот метод для неприлипающих клеток, выращенных в суспензии. Эксперименты CAM, описанные в протоколе предназначены для использования с клетками, которые экспрессируют флуоресцентный маркер (например, GFP, ППП и т.п.). Девять дневные куриные эмбрионы требуется на 2-й день эксперимента протокола для CAM экспериментов.

1. Подготовка и трансфекции опухолевых клеток антисмысловыми олигонуклеотидами (ASOs)

  1. Отберите среду из T75 колбу (ов), содержащей клетки, представляющие интерес, промыть 1xPBS и добавьте 2 мл 0,25% трипсина / ЭДТА. Добавить 10 мл полной среды роста в каждую колбу и передачи клеток в растворе в 50 мл пробирку. Подсчитайте клетки и отрегулировать громкость так, чтобы конечная концентрация составляет 1.0x10 5 клеток на мл.
  2. Этикетка две группы колбы Т25: одна группа будет содержать восемь колб, обозначенные 1-8, и будет USed для реального времени эксперимента измерения метаболизма; а вторая группа будет содержать 8 колб и будет использоваться для CAM куриного эмбриона эксперимента. Добавить 2 мл клеток в растворе в каждую колбу и место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2 O / N).
  3. На следующее утро (день 0, время 0), этикетка три 5 мл пробирки следующим образом: контроль (без ориентации КРМ или миРНК), "целевой интерес '(то есть, ориентированных КРМ или миРНК) и Липофектамин 2000 (или аналогичный трансфекции реагент). Развести решений складе ASO до соответствующей концентрации с бессывороточной среде в соответствующую пробирку.
    1. Добавить требуемое количество реагента для трансфекции в соответствующую пробирку и инкубируют в бессывороточной среде в течение 5 мин. Добавить раствор реагента для трансфекции в пробирки ASO и инкубировать в течение 20 мин.
  4. Добавить 250 мкл раствора контрольной ASO трансфекции реагента в каждую из колб 1-4 в каждой группе, и 250мкл 'целевой интерес "ASO трансфекции раствора реагента в каждую из колб 5-8 в каждой группе. Инкубируют в течение 4 ч (37 ᵒC, 5% CO 2).
    1. Во время инкубации, выполнять действия, описанные в разделе 2.1. После инкубации добавляют 3 мл полной среды в каждую колбу в CAM эксперимента группы и возврата в инкубаторе O / N (37 ᵒC, 5% СО 2). Процесс метаболизма экспериментальной группы в соответствии с описанием в разделе 2.2. Обработайте CAM эксперимент устанавливается в соответствии с описанием в разделе 4.

2. биосенсоров Chip Подготовка и посева клеток

  1. В стерильных условиях, тщательно промыть шесть чипов биосенсора с 400 мкл PBS. Стерилизацию фишки с 400 мкл 70% -ного этанола в течение 20 мин. Промыть три раза 400 мкл PBS.
    1. Поместите фишки внутри стерильной ткани КУЛЬТУРАе блюда для предотвращения загрязнения. Поместите три чипа в чашке с надписью «контроль», и три в блюдо с надписью «интересующий объект.
  2. Этикетка два 50 мл пробирки, как «контроль» и «целевой интерес». Промыть клетки с PBS и добавить соответствующий объем 0,25% трипсина / EDTA. Подождите, пока однослойных отделяет и сбора клеток из каждой колбы. Депозит раствор в соответствующую пробирку.
    1. Граф клеток и регулировать громкость так, чтобы конечная концентрация является 6.0x10 5 клеток / мл. Центрифуга и ресуспендирования клеток, если начальная концентрация слишком мала.
  3. Добавить 250 мкл клеточной решение каждого чипа биосенсора в соответствующей группе (в общей сложности 1.25x10 5 клеток на чипе). Выполните эту задачу, одну группу на время, чтобы свести к минимуму риск спутать фишки. Поместите стерильные чашки, содержащие микросхемы внутри камеры влажности, чтобы предотвратить испарение, и поместите в ЦДХ влажностиmber в инкубаторе O / N (37 ᵒC, 5% СО 2).
  4. На следующее утро (день 1), тщательно аспирации среды из каждого чипа и заменить его 250 мкл ростовой среде с добавлением 0,2% бычьего плода сыворотки (FBS) и 1x пенициллина и стрептомицина (P / S). Инкубируют в течение 4 ч (37 ᵒC, 5% CO 2).

3. Метаболизм Система измерения Подготовка и приготовления раствора

  1. Во время инкубации, подготовить необходимые решения наркотиками и система измерения метаболизм в течение предстоящего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система измерения метаболизма содержит в общей сложности шесть модулей. Каждый модуль вмещает одну фишку на эксперимент.
    1. Подразделите анализа на следующие экспериментальные группы: одна чип от каждого из "контроль" и "мишени", представляющих интерес групп на получение транспортного средства на время анализа; две микросхемы из каждой группы получить медикаментозное лечение в течение определенного периода времени, в течение а-ssay с последующим транспортного средства в течение периода вымывания.
    2. Для приготовления ознакомительных исследований, изменять длину, время и концентрацию лекарственного лечения, чтобы удовлетворить конкретного препарата в вопросе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для цисплатина следующие шаги были определены эмпирически с А549 и могут варьироваться в зависимости от клеточной линии. Выполните все этапы с расходом по умолчанию 4 мкл / мин.
      6 ч роста среднего + 0,2% FBS и 1x P / S
      24 ч 6 мкм цисплатин в среде + 0,2% FBS 1x P / S
      24 ч роста среднего + 0,2% FBS и 1x P / S
      18 ч роста среднего + 0,2% FBS и 1x P / S
      4 ч 0,1% Triton X-
      Примечание: Отклонения от этих шагов потребует расчета, чтобы определить необходимый объем средних и наркотиков решений на основе желаемой скорости течения и продолжительности эксперимента. В следующих разделах основаны на описанных выше шагов.
  2. Этикетка и заполнить четырнадцать 50 мл пробирки с 50 мл среды роста + 0,2% FBS ANd 1x P / S. Поместите шесть в одном измерении метаболизм система труб стойки, шесть в другом, а остальные два в третьей штатив для пробирок, который также содержит трубы с цисплатином. Уплотнение первые две стойки с воздушной мембраной, чтобы предотвратить испарение.
  3. Приготовьте раствор 6 мкМ цисплатина (соответствующего объема) в средней + 0,2% FBS с 1x P / S. Отказаться от необходимого объема цисплатин решения в четырех обозначенных 50 мл пробирки.
    1. Место труб в остальных четырех слотов в третьем метаболизма измерительная трубка стойки. Убедитесь, что трубы расположены в соответствующих пазов, которые соответствуют желаемым biomodules. Печать труб с воздухопроницаемой мембраной.
  4. Подготовка и маркировать шесть 50 мл трубки и залейте их 20 мл каждого из 0,1% Тритон-X решения в среде. Triton-X решение будет лизировать оставшиеся клетки и осуществляют «ноль» значение для каждого чипа. Место труб в четвертое измерение метаболизм блок трубки стойку и печать умач воздуха permable мембраны, чтобы предотвратить чрезмерное испарение.
  5. Загрузите фишки в biomodules и начать эксперимент.

4. CAM Эксперимент Лечение наркомании и впрыска

ПРИМЕЧАНИЕ: шаги и процедуры для подготовки куриных эмбрионов для эксперимента CAM описаны в других 19

  1. Начните обработки CAM эксперимент 48 ч после трансфекции (День 2). Подразделять на «контроль» и «цель интереса» групп в двух колбах для автомобиля и два для цисплатин. Аспирируйте среды из колб и пополнить либо 3 мл свежей среды, или 6 мкМ цисплатина. Инкубируют в течение 6 ч (37 ᵒC, 5% CO 2).
  2. Аспирируйте среды, затем промыть и Trypsinize клетки; собирать Трипсинизированные клетки в растворе в четырех надлежащим образом маркированных 15 мл пробирки.
    1. Центрифуга и промыть клетки три раза PBS. Повторное приостановить осадок клеток в 5 мл PBS вбы считать клетки.
    2. Отрегулируйте громкость так, чтобы конечная концентрация ячейки 1.0x10 6 клеток / мл. Передача клеток решение в маркированные 5 мл пробирки для инъекций, и место на льду. Invert трубы аккуратно перед инъекцией, чтобы гарантировать, что клетки тщательно перемешивают.
  3. Отложите в общей сложности 24 куриных эмбрионов (9 дней) для инъекций (6 в группе). Выполнение инъекции с помощью стеклянной иглу, прикрепленную к гибкой трубки, подключенной к 1 мл шприца. Лицо, осуществляющее инъекцию следует слепы к группе лечения.
    1. Использование стерео микроскоп, вводят 1.0x10 5 клеток в объеме 100 мкл в венозной циркуляции CAM. Использование медленно, пульсирующий технику, чтобы придать полный объем клеток. Аккуратно промокните место инъекции мягкая протрите, чтобы остановить поток крови и поглощать какой-либо утечки. На каждом эмбриона контейнер соответствующим после каждого введения.
  4. Подтвердите наличие и DISTRIпределение флуоресцентных клеток в сосудистой сети САМ после инъекции путем визуализации их с помощью флуоресцентного микроскопа. Принять к сведению любые эмбрионов, в которых количество опухолевых клеток появляется низко, или распределение желать лучшего.
  5. Поместите куриные эмбрионы во влажной камере и хранить их в инкубаторе (37 ° С, 60% влажности). Подождите 7-9 дня до перечисления метастатических очагов.

5. Метастатический Фокус Перечень

  1. Во время 7-9 дней инкубационного периода, контролировать эмбрионов и отказаться от любых мертвых. Убедитесь, что камера влажности остается влажной в течение всего времени инкубационного периода.
  2. Использование флуоресцентного микроскопа стерео на 20-кратным увеличением, сканировать всю верхнюю поверхность эмбриона CAM в обычной, сетки, как узор.
  3. Подсчитайте количество метастатических очагов в каждом поле зрения, то подсчитать количество для окончательного общего в зачаточном состоянии. Делая так на всех шести эмбрионов в каждой группе будет обеспечивать среднее число OF метастатических очагов в лечении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты и показатели адаптировано с разрешения из опубликованных работ 22.

Ингибирование BRCA2 индуцирует снижение дыхания в цисплатин обрабатывают опухолевых клеток

Рака Человеческие клетки А549 легких, получавших BRCA2 таргетирования ASO и цисплатин выставлены скорейшего и необратимому уменьшению дыхания, по сравнению с клетками, которые получили контроль ASO и цисплатин в одиночку; После 24 ч лечения цисплатином разница в дыхании между B...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из-за присущей стоимости и риска, связанного с клинических испытаний, есть необходимость в разработке более и более строгий доклинических методика тестирования, чтобы адекватно оценить новые схемы лечения анти-раковые. Текущие часто используемые методы все проявляют слабые стороны, которые могут ограничить их возможности различать потенциально перспективных терапевтических целей / агентов, и те, которые могут быть менее эффективными. Мы разработали протокол, чтобы оценить новые подходы по борьбе с раком, который урегули...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа стала возможной благодаря грантов JK от Онтарио центров передового опыта и научно-исследовательского фонда Онтарио.

Мы хотели бы поблагодарить Siddika Pardhan и д-р Питер Фергюсон для оказания технической помощи во время съемок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки A549ATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
пленки AeraSeal CarlRoth GmbH
AMEMWisent Bioproducts210-011-QK
Антисмысловые олигодезоксинуклеотидыAveciaBRCA2 целевая последовательность: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (основания 7241-7259
Axio Zoom V16 МикроскопCarl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
биосенсорные чипыBionas GmbH и Micronas GmbHBIS8001D
системой Bionas Discovery 2500 Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
CisplatinSigma Aldrich479306
Оплодотворенные куриные яйцаместного производства
Фетальная бычья сыворотка Gibco - Life Technologies
Липофектамин 2000 Инвитроген - Технологии Жизни 12566014http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBSWisent Bioproducts311-010-CL
трипсин (0,25%)/EDTAWisent Bioproducts325-043-CL
)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
  2. Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747(2013).
  3. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).
  6. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
  7. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
  8. Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
  9. Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
  10. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  11. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
  12. Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
  13. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
  14. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
  15. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
  16. Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
  17. Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714(2011).
  18. Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
  19. Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BRCA2CAMin vitro in vivo

Похожие статьи