Методическая статья

Колориметрический анализ, что меры частности Гранзим протеолитической активности: Гидролиз Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

12.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем простой количественный колориметрический анализ, который конкретно измеряет протеолитическую активность Granzyme B (GzmB) человека, мыши или крысы. Этот протокол может быть легко адаптирован для определения протеазной активности других гранулярных сериновых протеаз путем гидролиза других синтетических пептидных субстратов с соответствующей последовательностью узнавания.

Аннотация

Сериновая протеаза Granzyme B (GzmB) опосредует апоптоз клеток-мишеней при высвобождении цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) или естественных киллеров (NK). GzmB является наиболее изученным гранзимом у людей и мышей, поэтому исследователям нужны конкретные и надежные инструменты для изучения его функции и роли в патофизиологии. Это особенно требует анализов, которые не распознают протеазы, такие как каспазы или другие гранзимы, которые структурно или функционально связаны. Здесь мы применяем предпочтение GzmB к расщеплению после остатков аспарагиновой кислоты в колориметрическом анализе с использованием пептидного тиостера Boc-Ala-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB является единственной сериновой протеазой млекопитающих, способной расщеплять этот субстрат. Субстрат расщепляется с одинаковой эффективностью человеком, мышью и крысой GzmB, свойство, которое не свойственно другим коммерчески доступным пептидным субстратам, даже тем, которые рекламируются как подходящие для этой цели. Этот протокол продемонстрирован с использованием нефракционированных лизатов из активированных NK-клеток или CTL, а также подходит для рекомбинантных протеаз, образующихся в различных прокариотических и эукариотических системах, при условии использования правильного контроля. Этот анализ представляет собой высокоспецифичный метод для установления потенциальной проапоптотической активности цитотоксических молекул в лимфоцитах млекопитающих и их рекомбинантных аналогов, выраженной с помощью различных методологий.

Введение

Гранзимы представляют собой семейство сериновых протеаз, обнаруженных в секреторных лизосомах естественных киллеров (NK) клетки и цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) 1. Существует пять различных гранзимы в организме человека (A, B, H, K и М), и десять мышей (- G, K, M и N), 2,3. Granzyme и Гранзим (GzmA, GzmB) являются наиболее распространенными и широко исследованы в условиях человека и грызунов.

Классический функция GzmB является индукция апоптоза в клетках-мишенях, выполненных в сочетании с белком перфорина порообразующего, что позвол ет Granzyme доступа в цитозоль клетки-мишени четыре. Хотя выражения GzmB однозначно найти в цитотоксических лимфоцитов, недавние исследования были решении различных других GzmB экспрессирующих типов клеток, в том числе, но не ограничиваясь кератиноцитов 5, 6 базофилов, тучных клеток 7, плазмоцитов дендритных клеток, 8 и 9-клеток, 10.В этом контексте, не-апоптотических функции GzmB были обнаружены в пределах от участия в воспалительных процессах, ремоделировании ткани и других иммунорегуляторных свойств 11-14.

Учитывая, что более широкое биологическая роль была предложена для GzmB, чем предполагалось ранее, исследователи требуют надежных и конкретные инструменты для его обнаружения. Из преимуществом является конкретное требование GzmB на расщепляют на карбоксильной стороне остатков аспарагиновой кислоты, собственности уникальных среди эукариотических сериновых протеаз 15. Мышь, человека и крысы GzmB структурно очень похожими, однако расширенный субстратной специфичности мыши GzmB тонко отличается от обоих человека и крысы 16, что означает, что некоторые общие субстраты с Asp на терминале (P1) могут быть расщеплены эффективно GzmB из всех трех видов, в то время как для других поверхностей с более сложными последовательностями перед Р1 может дать широко переменные результаты. В обоих прошлом и более поздних Literature, этот факт вызвал значительную путаницу и разночтения биологической значимости некоторых экспериментальных результатов, хотя тщательно контролируется, кинетические исследования пытались исправить ситуацию 17.

В этой статье мы стремились проиллюстрировать эти точки, используя два коммерчески доступных веществ, а именно Вос-Ala-Ala-Asp-SBzl и N-ацетил-Ile-Glu-Pro-Asp-р-нитроанилид. Два реагенты сделать генерировать различные реактивные группы после расщепления (бесплатно Сульфгидрильные против флуоресцентного свободного paranitroanilide), но это не имеет никакого влияния на протеолитического расщепления. Описанный протокол является современной адаптация очень старый протокол 18, но должно помочь исследователям использовать различные субстраты GzmB надлежащим образом, а также обеспечивает методологическую основу для определения активности других гранзимы, таких как GzmA и GzmH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: селезенки были получены от мышей (6-10 недель), и все эксперименты на животных были проведены в соответствии с этикой животных руководящих принципов MacCallum центра рака Питер (E486).

1. Получение образцов.

  1. Подготовка активированных клеток мыши Нагорного Карабаха.
    1. Изолировать первичных наивные клетки NK от одноклеточных суспензий селезенке мышей C57BL / 6 или B6.GrzmB - / - (GzmB ген NULL) мышей негативной селекции с использованием коммерчески доступных наборов.
    2. Следуйте протоколу производителя. Вкратце, магнитно-LABEL "не-НК» клетки, такие как Т- и В-клеток, дендритные клетки, гранулоциты, макрофаги и красных кровяных клеток, используя биотин-сопряженных антител против своих конкретных поверхностных маркеров. Используйте магнитную сепарацию с анти-биотин бисером истощать "Non-НК" клетки.
    3. Культура изолированных NK клеток в течение 5-7 дней в среде, содержащей IL-2 (1000 ед / мл) при 700000 клеток / мл в 24-луночных планшетахна 37   ° С.
    4. Кроме того, использование активированных Т-клеток 19, основным антиген-ограничено ЦТЛ от клеточного рецептора трансгенных мышей ОТ1 Т 20, CTL, генерируется в смешанных культурах лимфоцитов 21, или супернатантов, активированных клеток NK, чтобы определить активность секретируемого GzmB 19.
  2. Обслуживание линии и изоляции первичных клеток NK человека НК клеток.
    1. Поддержание лейкемии человека (NK клетки) YT в Roswell Park Memorial Institute (RPMI) среде, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки. Альтернативно, очистки первичных клеток NK из периферической крови здоровых людей и стимулировать в течение 2-3 дней в среде, содержащей IL-2, в 100 ед / мл, как описано выше 22.
  3. Поколение клеточных лизатов.
    1. Промывают клетки три раза в PBS (рН 7,4), а затем приостановить Nonidet Р-40 лизирующего буфера (0,1% NP-40, 250 мМ NaCl, 25 мМ HEPES, 2,5 мМ ЭДТА). В идеале, лизировать минимум 5 х 10 6 NK-клеток, или 1 х 10 7 Т-клеток в 100 мкл буфера. Не следует добавлять ингибиторы протеазы, как многие из них необратимые ингибиторы сериновых протеаз и, в частности, такие как tryptases GzmA. Инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем гранулы ядра в микроцентрифуге при 15000 х г в течение 10 мин. Отменить ядерного осадка и передачи супернатант в новую пробирку.
  4. Определить концентрацию белка в лизатах.
    1. Используйте имеющийся в продаже протокол выбора, таких как, Брэдфорд или бицинхониновой кислоты (BCA) и определения концентрации белка. Убедитесь, что концентрация составляет ~ 2 мг минимальное / мл. Магазин лизаты при -20 ° С до требуемой активности (гранзимом стабилен в течение многих месяцев при температуре -20 ° С).

2. Гранзим Анализ активности

  1. Подготовка реагентов
    1. Подготовка 10 мМ запас субстратов (Boc-АСР-S-Bzl или Ac-IEPD-PNA) в ДМСО (~ 5 мг / мл) и хранить в аликвотах при -20 & #176; С. Подготовьте рабочее разведение недавно и отказаться после каждого дня, так как Вос-AAD-S-Bzl частично гидролизуется на хранение в ДМСО.
    2. Приготовьте 250 мМ запас колориметрического реагента (5,5'-дитио-бис (2-нитробензойной кислоты), DTNB) в ДМСО (0,09 г / мл) и хранят при -20 ° С. Подготовьте новую рабочую разбавления каждый день. Этот реагент требуется только для субстратов с SBzl группами индикации, не PNA.
    3. Макияж свежий буфера (0,1 М HEPES, 0,05 М MgCl 2, рН 7,3) каждые 2-3 недели.
  2. Доведите DTNB и синтетические субстраты до комнатной температуры. Развести основания (1:16, например, 100 мкл в 1,6 мл буфера) и DTNB (1: 250, например, 10 мкл в 2,5 мл буфера) и хорошо перемешать.
  3. Развести минимум 100 мкг белка лизата каждого образца в буфере до конечного объема 160 мкл. Используя многоканальную пипетку добавить 50 мкл на лунку в трех повторах (~ 33,3 мкг / лунку) в '' U '' нижней винилового 96-луночного планшета.Включить "буферная только для" контроля (также в трех экземплярах).
  4. Добавить 100 мкл разбавленного DTNB контролю образцы / буфера (пропустите этот шаг при работе с Ac-IEPD-ПНА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расщепление Ac-IEPD-ОНУ по GzmB непосредственно релизы флуорогенный PNA (рис 4б).
  5. Использование многоканальную пипетку, чтобы быстро добавить 50 мкл разбавленных субстратов к каждому набору трех повторах, начиная с буфером затем каких-либо отрицательных контролей и заканчивая ожидаемых положительных образцов.
  6. Поместите пластину в ридере. Измерьте Asp-азы путем гидролиза Вос-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / AC-IEPD-ОНУ в микроплаты на OD 405 нм. Используйте протокол кинетическую анализа, возьмите 25 показаний, каждые 15 секунд (примерно 6 мин Общее время чтения).
  7. Используйте оптической плотности, генерируемых в каждый момент времени вручную рассчитать скорость подложки расщепления, если программное обеспечение пластинчатого читателя не может генерировать значение для Vmax.

3. Анализ Daта

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, полученные представлен в виде максимальной скорости, определяется как изменение ОД с течением времени (MOD / мин).

  1. Для анализа данных, определения максимальной скорости подложки расщепления, который рассчитывается от скорости изменения оптической плотности. Сделайте это автоматически с помощью программного обеспечения ридере, который, как правило, имеет эту опцию.
  2. Кроме того, после просмотра кинетические кривые изменения оптической плотности, которые генерируются на кинетическом анализе на ридере вручную выбрать точки данных, которые дают самый крутой прямую линию. Для большинства анализов максимальная скорость достигается в течение первых 2 минут данного анализа.
  3. Вычтите начальное чтение OD с самой высокой чтении OD на этой прямой и разделите на интервале времени. Передачи необработанных данных в Microsoft Excel / Graph площадку для статистического анализа и графического дисплея.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вос-ААР-S-Bzl субстрат является специфическим для GzmB

Серин-протеазы GzmB является основным компонентом цитотоксических лимфоцитов (CTL и NK-клетки), и, в основном, ответственны за быстрое индукции апоптоз в клетках-мишенях, таких как вирус-инфицированных или трансформированных клетках. Это в значительной степени из-за его предпочтения субстрата для расщепления после некоторых специфических аспартат остатков в отдельных белков, атрибут совместно с каспаз, которые также расщ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исторически гранзимы были определены в качестве ключевых эффекторных молекул цитотоксических лимфоцитов (CTL и NK-клетки), способных индуцировать быстрый апоптоз в клетках-мишенях. Это было в основном за счет действия GzmB, который расщепленного субстрата цель на аспартат (D) остатки и, таким образом, смог активировать каспазы каскад обеими расщепляющих про-каспазы, а также некоторые из их нижестоящих мишеней. Тем не менее, в настоящее время в виду, что выражение GzmB не ограничивается лимфоидных клеток цитотоксическими...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа получила поддержку в виде гранта HA 6136/1-1 от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество) для MH. JAT поддерживается грантами на программы и проекты от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Субстрат Granzyme B (мышиный и человеческий)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B субстрат (только человеческий)
N-α-CBZ-L-lysine-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A субстрат
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H субстрат
5,5'-дитио-бис (2-нитробензойная кислота) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Набор
выделения реагентов NK-клеток II мышиMiltenyi Biotec GmbH130-096-892набор для выделения отрицательных
клеток NK-клеток набор для изоляции NK-клеток человекаMiltenyi Biotec GmbH130-092-657набор для отрицательного отбора
Планшет Считыватель BioradiMarkBiorad Microplate Manager Версия программного обеспечения MPM6.3
Serocluster U-образный винил 96-луночный планшетCorning, MA, США2797
для

Ссылки

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BNKDTNBB

Похожие статьи