Получение одноклеточные подвесок для Cytofluorimetric анализа из различных регионов мышиной кожи

Краткое содержание

Кожа является домом для сложной иммунной клеточной сети. Мы описываем эффективную методологию переваривания кожи мышей из различных частей тела животного с целью получения одноклеточной суспензии и анализа различных популяций лейкоцитов, находящихся в коже, с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Кожа является барьерным органом, который взаимодействует с внешней средой. Постоянно подвергаясь потенциальному микробному вторжению, дерма и эпидермис являются домом для различных иммунных клеток как в гомеостатических, так и в воспалительных состояниях. Таким образом, инструменты для получения высвобождения клеток кожи для цитофлуориметрических анализов очень полезны для изучения сложной сети иммунных клеток, находящихся в коже, и их реакции на микробные стимулы. В этой статье мы описываем эффективную методологию переваривания кожи мышей с целью быстрого и эффективного получения суспензий одиночных клеток. Этот протокол позволяет поддерживать максимальную жизнеспособность клеток без ущерба для экспрессии поверхностных антигенов. Мы также описываем, как брать и переваривать образцы кожи из различных анатомических мест, таких как ухо, туловище, хвост и подушечка лапы. Полученные суспензии затем окрашивают и анализируют с помощью проточной цитометрии для различения различных популяций лейкоцитов.

Введение

Кожа является одним из самых больших органов тела, и ее большая поверхность постоянно подвергается воздействию внешней среды. Поэтому кожа должна защищать организм от потенциальных угроз, чтобы поддерживать гомеостаз, как физическими средствами, так и обеспечивая активную защиту от потенциального проникновения патогена. Подобно слизистой оболочке кишечника и легких, кожа содержит множество иммунных клеток, которые постоянно взаимодействуют с эпителием, поддерживая иммунный надзор. Эта сложная система, которая включает в себя как иммунные, так и неиммунные клетки кожи, была признана с первых дней иммунологии, когда в 1978 году впервые был придуман термин «кожно-ассоциированная лимфоидная ткань» (SALT) ¹ для описания такой сложности.

Большое количество иммунных клеток, находящихся в коже, помогает организму не только бороться с потенциальными инвазиями, но и организовывать заживление ран и поддерживать толерантность к аутоантигенам и микробиоте кожи ^2,3.

Среди резидентных иммунных клеток кожи дендритные клетки (ДК) играют решающую роль в формировании иммунных реакций и поддержании гомеостаза ⁴. Дермальные ДК и клетки Лангерганса легко реагируют на инвазии патогенов и при миграции в лимфатические узлы активируют Т-клетки и индуцируют экспрессию рецепторов самонаведения кожи на вновь образованных эффекторных Т-клетках5. ДК также играют фундаментальную роль в регулировании гомеостаза кожи. ДК, мигрирующие из дермы в лимфатические узлы в гомеостатических условиях, транспортируют изолированные в коже антигены с целью индуцирования толерантности к Т-клеткам, в основном за счет дифференцировки регуляторных Т-клеток (Tregs), специфичных к кожным антигенам ^6-8.

Т-клетки представляют собой наиболее распространенную популяцию иммунных клеток в коже. Они не только проникают в кожу во время инфекции, но и представляют собой стабильную популяцию среди резидентных лимфоцитов кожи ^9,10. Как CD8^+, так и CD4⁺ резидентные Т-клетки памяти (rm)T находятся в коже и после инфекции могут реагировать задолго до того, как эффекторные Т-клетки будут рекрутированы из крови. В коже также обитает популяция тканевых резидентных Tregs, способных поддерживать толерантность к кожным антигенам и тканевому гомеостазу. Эти клетки быстро и мощно активируются после воздействия родственного им антигена и поэтому были определены как Tregs ^{памяти 11,12}.

Наряду с ДК и Т-клетками, многие клетки врожденного иммунитета, такие как NK-клетки, гамма-дельта Т-клетки, ILCs ^{2-й группы 13}, тучные клетки и макрофаги, заселяют кожу и вносят свой вклад в защиту хозяина. Для анализа такой сложной среды в обязательном порядке необходимо получение одноклеточных суспензий из образцов кожи с высокой эффективностью при сохранении экспрессии поверхностных маркеров для проточного цитофлуориметрического анализа или сортировки.

Мышиная кожа представляет собой наружный эпидермальный слой, состоящий в основном из кератиноцитов, клеток Лангерганса и дендритных эпидермальных Т-клеток; и дермальный слой под ним. Дерма является домом для большинства иммунных клеток и состоит из внеклеточного матрикса, в котором коллагеновые волокна находятся в наибольшем количестве, особенно коллаген-I и коллаген-IV. В отличие от человеческой кожи, кожа мыши покрыта мехом, и поэтому больше населена волосяными фолликулами. Кроме того, он намного тоньше человеческой кожи и содержит мышечный слой, панникулюс карнозус, который способствует заживлению ран ¹⁴. Эти характеристики затрудняют эффективное разрушение коллагеновой сети дермы с целью выведения иммунных клеток.

В этой статье мы предлагаем подходящий метод для расщепления внеклеточного матрикса, который основан на коктейле из коллагеназы высокой чистоты 1 и 2 и термолизина. Более того, поскольку анализ кожи из разных регионов требует разных экспериментальных процедур, мы покажем различные методы эффективного получения образцов кожи из подушечки ноги, хвоста, уха и туловища. Затем мы пометим образцы, чтобы оценить наличие ДК (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), макрофагов (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), CD8⁺ и CD4⁺ Т-клеток.

Протокол

Утверждение исследования: экспериментальные протоколы были одобрены Министерством здравоохранения Италии (Рим, Италия) в соответствии с Decreto Legislativo 27 Gennaio 1992, п. 116 "Attuazione делла Direttiva п 86. / 609 / CEE в Materia ди Protezione дельи animali utilizzati Фини sperimentali о объявления Altri Фини scientifici."

1. Получение образцов кожи

1. Эвтаназии мышь путем смещения шейных позвонков.
2. Ухо:
   1. Вырежьте голую часть ушей мыши.
   2. Отдельный спинной и брюшной стороне, потянув их друг от друга с пинцетом. Удалите все оставшиеся хрящи, аккуратно очищая внутреннюю часть ушей с пинцетом.
3. кожа Ствол:
   1. Бритье всю кожу животного и с электрической бритвы и с тонким депиляции лосьон.
   2. Отрежьте нужный образец кожи (от 2 см ² до всей кожи животных).
      1. Если отрезать весь спинной и ажеТрал кожи мыши, сделайте вертикальный разрез в середине мыши обратно, а затем разрезанной вдоль границ бритыми областей вокруг тела мыши.
      2. Аккуратно отделить кожу от брюшины и мышц спины, держа образец кожи до сих пор с пинцетом при отделении образца кожи с закрытым круглым обрамленными наконечниками хирургическими ножницами или скальпелем.
   3. Приготовьте 100 мм для культивирования клеток планшет, содержащий 10 мл охлажденного льдом PBS.
   4. Устранить подкожного жира погружением пробы кожи в PBS в пластине, приготовленным на стадии 1.3.3 и соскоб образец кожи пинцетом.
4. Хвост:
   1. Отрезать хвост мыши.
   2. Сделать вертикальный разрез на хвост с хирургическими ножницами или хирургическим скальпелем, начиная от основания хвоста и доходящим до кончика хвоста.
   3. Используйте пинцет, чтобы отделить кожу от хвоста. Захватите края разреза у основания хвоста и осторожно вытяните в сторону наконечника, удерживаяТело хвоста пинцетом.
   4. Удалите лишний жир, аккуратно очищая образец кожи.
5. разбойник
   1. Вырежьте всю ногу мыши с хирургическими ножницами. Как избежать резки любой волосатые кожи.
   2. Разрежьте кожу стопы в продольном направлении от голеностопного сустава до начала цифр.
   3. Держите кости лодыжки с пинцетом или рукой, захватывая кожу с пинцетом и подтягивает кожу в сторону цифр, как будто снимая перчатки.

2. Переваривание

1. Подготовьте переваривания коктейль из исходного раствора (приготовленного, как в списке материалов) со следующим рецептом: смесь энзимов (см список материалов для спецификаций) 300 мкг / мл, DNAse1 50 Ед / мл. Развести в RPMI 5% FBS.
2. Нарезать образцы кожи с ножницами на мелкие кусочки в чашку Петри 35 мм с 2 мл Пищеварение Коктейль (для ствола кожи: 2 мл Пищеварение Коктейль каждые 2 см ² кожи, общая до 3 мл).
3. Инкубируют при 37 ° С в течение 90 мин. Осторожно потрясите чашку Петри 1-2 раза во время инкубации.
4. Налейте переваривается образцы кожи на 70 мкм клеточный фильтр на 66 мм в чашку Петри, содержащую 1 мл RPMI1640 5% FBS.
5. Промыть фильтр грубой очистки с 5 мл RPMI 1640 5% FBS.
6. Сожмите пробы через сито клеток с поршень шприца.
7. Промывка плунжер, чашку Петри и сетчатый фильтр с 20 мл RPMI 1640 5% FBS, перенесите в 50 мл пробирку.

3. Антитела и этикетирование

1. Промыть полученной суспензии дважды 5 мл PBS 1% FBS (или БСА).
2. Этикетка полученной суспензии клеток с требуемыми антителами.
   1. Ресуспендируют образцы в количестве 100 мкл / образец из смеси, содержащей 2 мкг / мл aCD16 / CD32 (клон 2.4G2), разведенного в PBS 1% FBS.
   2. Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С для того, чтобы блокировать неспецифическое связывание желаемых антител через рецепторы Fc.
   3. Добавление антител , указанные в таблице1.
      1. Готовят смесь разбавляя желаемые антитела в 100 мкл / образец PBS 1% FBS в концентрации 4 мкг / мл.
      2. Добавьте 100 мкл смеси, полученного на стадии 3.2.3.1 для каждого образца так, что в трубке, будет объемом 200 мкл смеси антител в конечной концентрации 2 мкг / мл.
   4. Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С и покрывают от света.
3. Мытье с 1 мл PBS 1% FBS, центрифуги в течение 5 мин при 400 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют в 300 мкл PBS 1% FBS.
4. Добавить DAPI в конечной концентрации 2 мкг / мл и инкубируют при 4 ° С, в защищенном от света месте в течение 10 мин.
5. Анализ образцов, полученных с помощью FACS.
   1. Для того чтобы выделить лейкоциты, используйте следующую стратегию стробирования:
      1. Во-первых устранить любые мертвые клетки с помощью стробирования на население DAPI-.
      2. Выберите синглеты в FSC-A против FSC W участка , как показано на рисунке 1 .
      3. Ворота клетки в зависимости от размера и зернистости, характерной для лейкоцитов, представляющих интерес.
      4. Выберите CD45 + клеток в FSC-A CD45 участка , как показано на рисунке 1.
   2. Выделяют различных популяций лейкоцитов по экспрессии поверхностных маркеров следующим образом:
      1. Определить , как контроллеры домена CD11c ⁺ MHC II ⁺ клеток. Они могут быть впоследствии проанализированы на экспрессию CD207, чтобы различать клетки Лангерганса и CD207 + Dermal ДК из CD207- Кожное ГЦ.
      2. Определение Макрофаги, как / 80 + клеток CD64 + F4.
      3. Определение В-клеток как CD19 + MHCII + клеток.
      4. Определение Т-клеток, как CD8 + или + клеток CD4.

Результаты

Кожа из другой области тела переваривают в соответствии с протоколом, описанным и окрашивают с указанными антителами. Стратегия стробирования изображена на рисунке 1. Сначала выберите живые клетки (DAPI- клетки), то ворота на синглеты (FSC-A против FSC-W) и на клетках с морфологией лимфоцитов (FSC-A по сравнению с SSC-A). Когда указано, CD45 ⁺ клетки кроветворной происхождения выбраны.

Контроллеры д...

Обсуждение

Мы описали способ получения одноклеточных суспензий из различных областей кожи мыши. Метод пищеварения мы приняли, не только дает высокие урожаи, но и сохраняет экспрессию поверхностных маркеров, что является фундаментальным для последующего анализа FACS.

Использование коктейля коллагеназы I и II и термолизином, гарантирует минимальную партии к партии различий в активности фермента делает этот метод высокой воспроизводимостью. Другие опубликованные методы опираются на различные коктейли ферм...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Reagents
Enhanced RPMI 1640 medium			RPMI1640 с добавкой L-glu, пен-стрептококком без бета-меркаптоэтанола
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	ресуспендия [2.5  мг/мл] в dH2O; Магазин аликвот при -20  ° C
dnase i	sigma	D4263-1VL	ресуспендирован в RPMI 1640 без сыворотки [1,000  U/ml]
Materials
Хирургические ножницы
Хирургические щипцы
Хирургический скальпель
35 мм чашки
Петри 66 мм Чашки
Петри
70 &микро; m Клеточные фильтры	BD	352350
<Коктейль> для крепкого пищеварения			Разбавленный в RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 &; г/мл
ДНКаза1			50 U/мл
Антитела
Name	Company<	strong>Clone<	strong>Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC