Методическая статья

Нормальных и злокачественных клетках мышц трансплантации в иммунной скомпрометированных взрослых данио рерио

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52597

⸱

26 декабря 2014 г.

 ,  ,  , 
1Molecular Pathology, Cancer Center and Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3GABBA - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток скелетных мышц данио-рерио и эмбриональной рабдомиосаркомы (ERMS) взрослым гомозиготным мутантным данио-рерио с ослабленным иммунитетом rag2E450fs. Этот протокол позволяет эффективно анализировать регенерацию и злокачественную трансформацию мышечных клеток.

Аннотация

Данио рерио стали мощным инструментом для оценки развития, регенерации и рак. Совсем недавно, протоколы трансплантации аллотрансплантата клеток были разработаны, которые позволяют приживление нормальных и злокачественных клеток в облученные сингенной и иммунной угрозу взрослых данио. Эти модели в сочетании с оптимизированными протоколов трансплантации клеток позволяют быстрой оценки функции стволовых клеток, регенерации после травмы и рак. Здесь мы представляем метод для трансплантации клеток данио взрослого скелетных мышцах и эмбриональная рабдомиосаркома (ERMS), детский саркомы, которая разделяет особенности эмбриональной мышцы, в иммунной угрозу взрослых RAG2 E450fs гомозиготной мутантной рыбки данио. Важно отметить, что эти животные не имеют Т-клеток и уменьшить функцию В-клеток, что облегчает приживление широком диапазоне тканей от неродственного донора животных. Наши оптимизированные протоколы показывают, что флуоресцентно меченных ДГО мышечных клетокations из α-актин-RFP трансгенных данио привить решительно при имплантации в спинной мускулатуры RAG2 гомозиготной мутантной рыбы. Мы также продемонстрировать приживление люминесцентных трансгенной Erms где флуоресценции ограничивается элементов на основе статуса дифференцировки. В частности, ERMS были созданы в АВ-деформированного Myf5-GFP; mylpfa-mCherry двойные трансгенные животные и опухоли вводили в брюшину взрослых иммунной скомпрометированных рыбы. Полезность этих протоколов охватывает приживления широком диапазоне нормальных и злокачественных клеток-доноров, которые могут быть имплантированы в спинной мускулатуры или брюшины у взрослых данио.

Введение

Данио рерио являются прекрасной моделью для регенеративных исследований, потому что они могут регенерировать ампутировали плавники, а также поврежденный мозг, сетчатку, спинной мозг, сердце, скелетные мышцы и другие ткани 1. Стволовые клетки и регенеративные исследования в взрослых данио были в значительной степени сосредоточены на характеристики регенерации в ответ на повреждение, в то время как идентификация стволовых клеток и клеток-предшественников из различных тканей при трансплантации клеток только недавно были изучены 2. Данио рерио также стали все чаще используется для изучения рака через поколения трансгенных моделей рака, которые имитируют человеческую болезнь 3 - 10.

В настройках рака, трансплантации клеток подходы стали широко приняты и разрешить динамической оценки важных опухолевых процессов, включая самообновления 11, функциональной гетерогенности 12,13, неоваскуляризации 14, пролиферации,ответы терапии 15 и вторжение 16,17. Тем не менее, привиты клетки часто отвергаются от получателя рыбы из-за иммунного защиты, которые атакуют и убивают трансплантата 18. Несколько методов были использованы, чтобы преодолеть отторжение привитых клеток. Например, животным-реципиентам иммунной системы может быть временно удалена от низкой дозой гамма-облучения до трансплантации 18,19. Тем не менее, получатель иммунная система восстановится к 20 дней после облучения и убить клетки донора 18. Кроме того, лечение дексаметазоном был использован для подавления Т и функции В-клеток, обеспечивая больше иммунную кондиционер подавляющий и содействия приживление широком диапазоне опухолей человека до 30 дней 14. Эти эксперименты требуют постоянного дозирования наркотиков и ограничены по изучению твердых опухолей. Долгосрочные приживления анализы использовали генетически идентичных Сингенные строки 20 - 22, где донор и recipiЛОР клетки иммунной совпадают. Тем не менее, эти модели требуют трансгенных линий, представляющих интерес для пересекаться в сингенной фоне более четырех поколений, чтобы произвести полностью сингенные линии. Чтобы избежать проблем иммунного отторжения у рыб получателя, наша группа недавно разработала иммунной угрозу RAG2 E450fs гомозиготных мутантов (ZFIN аллель обозначение RAG2 fb101) линии, которые Снижение функции Т- и В-клеток и которые позволяют приживление широком диапазоне тканей 23. Похожие модели иммунные скомпрометированы мыши широко используются для трансплантации клеток мыши и тканей человека 24.

Здесь мы представляем методы для трансплантации скелетных мышц и эмбриональная рабдомиосаркома (ERMS), детский саркомы, которая разделяет особенности с скелетных мышцах, в недавно описал RAG2 гомозиготной мутантной рыбки данио. Наличие иммунной угрозу взрослых даниорасширяет наши возможности для выполнения крупномасштабных клеточной трансплантации исследования непосредственно визуализировать и оценивать стволовых клеток к самообновлению в пределах нормальных и злокачественных тканей. С помощью этого метода, флуоресцентно меченных мышечных клеток препараты из взрослых α-актин-RFP 25 трансгенных данио решительно прививать в RAG2 гомозиготных мутантов рыбок данио после инъекции в спинной мускулатуры. Кроме того, мы демонстрируем приживление и расширению начального MYF5 -GFP; mylpfa- mCherry трансгенных Erms после внутрибрюшинного введения в RAG2 E450fs гомозиготной мутантной рыбки данио. Полезность этих протоколов выходит за примерами, показанными и могут быть легко применены к дополнительным данио регенеративных тканей и рака.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Massachusetts General Hospital подкомитета по научным исследованиям животных ухода, в рамках протокола # 2011N000127.

Раздел 1. скелетных мышц клеточной трансплантации во взрослых RAG2 E450fs гомозиготных мутантов данио рерио

1. Подготовка взрослых данио доноров клеток скелетных мышц

  1. Получения трансгенных взрослых данио, которые флуоресцентно меченного мышцы. В этом эксперименте 30 α-актина-ЗП донор рыб 25 были использованы для трансплантации 1 × 10 6 клеток на рыб получателя.
  2. Жертва донор данио в 1,6 мг / мл Tricaine метансульфонат (MS222) в течение 10 мин или до никакого движения крышечки не видно.
  3. Поместите доноров рыбу на фильтровальную бумажным полотенцем и акциза спинной мышцы, используя чистую лезвие. Сокращение должно быть сделано около ануса под углом 45 °, чтобы максимизировать коллекцию тканей (Как показано на рисунке 1А ). Поместите расчлененный ткань в чистой 10 см чашку Петри.
  4. Добавить 500 мкл буфера суспензии (предварительно охлажденной 0.9x фосфатный буфер солевом растворе (PBS) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS)) в рассеченной ткани. До 10 доноров рыбок данио могут быть размещены вместе в этой книге.
  5. Фарш ткани с бритвой> 20 раз, пока клетки находятся в однородной суспензии. Вся спинной мускулатуры гомогенизируют в том числе кожи, костей и плавников. Добавить 2 мл суспензии буфера. Использование 5 мл пипетку, растирают клеточной суспензии ≥20 раз, чтобы отделить клетки.
  6. Фильтр клеточной суспензии через сито меш 40 мкм в 50 мл коническую пробирку помещают на лед.
  7. Промыть чашки Петри с дополнительными 2,5 мл суспензии буфера для сбора оставшегося ткани и фильтруют через тот же фильтр и коническую трубку, в конечном объеме 5 мл (10 донор рыба может быть использован в изолята).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа, кости и плавники будут исключены следующие фильтрации.
  8. Если необходимо, сочетать подобные суспензии в ту же коническую трубку.
  9. Подсчитать общее число жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего красителя и гемоцитометра.
  10. Забронируйте 500 мкл для потока цитометрии, при желании (не обязательно, шаг 2).
  11. Центрифуга клеточной суспензии при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  12. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 3,33 х 10 5 клеток / мкл (0.9x PBS + 5% FBS). В общей сложности, 3 мкл будет выведена на рыбу получателя в общей сложности 1 х 10 6 клеток на получателя (шаг 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Менее 3 мкл клеточной суспензии следует пересаживать в рыбу получателя. Если количество клеток ограничивает, по цене как 5 х 10 4 клеток на реципиента может привести к успешному приживления (Таблица 1).

2. проточной цитометрии анализ донорской скелетных мышечных клеток Подготовка (Необязательно)

  1. Изолировать мышцу от дикого типа, без трансгенных рыб, как описано Iп шагу 1.1. Этот образец служит в качестве отрицательного контроля и полезен для установки проточной цитометрии ворота.
  2. Добавить соответствующий жизнеспособность красителя. Например, добавьте 5 мкл на складе DAPI решение (500 нг / мкл) в 500 мкл препарата мышц. Вихревой слегка перед анализом. Приобретать 5 х 10 3 до 1 х 10 4 события. Анализ диких контрольные образцы первого типа для размещения ворота с последующим анализом мышечных клеток, выделенных из трансгенных рыб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: проточной цитометрии, как правило, осуществляется в течение 1 часа после мышечной ткани аорты, во время которого рассеченные клетки сохраняют более 60% жизнеспособность (Рисунок 2). Клетки должны быть на льду во все времена. Всего жизнеспособность клеток может быть повторно оценивали перед трансплантацией использованием трипанового синего красителя и гемоцитометра.

3. Внутримышечные Трансплантация клеток скелетных мышц во взрослую RAG2 гомозиготных мутантов данио рерио

  1. Очистите 10 μ; Л 26S G микро-шприц, втягивая и изгнания 10% гипохлоритом натрия (5 раз), а затем 70% этанола (5 раз), а затем следуют подвески буфера (0.9x PBS + 5% FBS, в 10 раз).
  2. Обезболить 2-4-месячного гомозиготную RAG2 мутантный рыбу или дикую рыбу получатель типа (в виде контроля), добавив отдельные капли Tricaine метансульфонат (MS222, 4 мг / мл стоковый раствор) в чашку Петри, не содержащей рыбу в воде системы до тех пор, крышечка движений медленных и рыба по-прежнему.
    Примечание: Доза Tricaine анестезии будет зависеть от возраста и размера получателя данио.
  3. Поместите под наркозом данио получатель на влажную бумажным полотенцем или губкой, с левой стороной вверх.
  4. Вставьте иглу шприца в латеро- спинной мускулатуры (см рис 1а). Убедитесь, что инъекции выполняются под углом 45 °. Вводите 3 мкл клеточной суспензии (приготовленной на стадии 1.12) на рыб в общей сложности 1 х 10 6 клеток на получателя.
  5. Тщательно передачи вводят данио в чистую бака с помощью пластиковой ложкой, чтобы восстановиться.
  6. Оценка получатель данио для ставок приживления на 10, 20, 30 дней после пересадки путем визуализации наркозом рыбу при ярком поле и эпифлуоресцентной микроскопии.

Раздел 2. эмбриональная рабдомиосаркома (ERMS) Трансплантация во взрослую гомозиготная RAG2 Mutant данио рерио

4. ДНК Микроинъекция эмбрионов данио рерио

  1. Линеаризации RAG2-kRASG12D плазмиду 7 расщеплением 10 мкг ДНК с помощью XhoI, при 37 ° С в течение 6 ч или O / N.
  2. Очищают ДНК с помощью стандартных фенола: хлороформ добычи и осаждают этанолом. Ресуспендируют в 20 мкл деионизированной воды (в качестве альтернативы, ДНК-фрагмент колонны коммерческие очистки может быть использован).
  3. Запуск непереваренной и расщепленной ДНК в 1% агарозном геле и определения концентрации ДНК бу чтение спектрометр. Кроме того, работать на образцы 1: 1, 1: 5, 1:10 и разведения на 1% агарозном геле и количественно по сравнению с лестницы ДНК.
  4. Подготовка смеси инъекции в конечной концентрации 15 нг / мкл переваренной RAG2-kRASG12D ДНК в 0,1 М KCl и 0,5 × Трис-ЭДТА. Окончательная сумма ДНК вводят в 2 NL объема впрыска топлива будет составлять 30 стр.
    Примечание: До трех различных конструкций ДНК может быть эффективно совместно вводили в максимум 60 мкг ДНК на эмбрион. Эти трансгены интегрироваться в геном и экспрессируется совместно в рамках развивающегося опухоли 26.
  5. Вводят линеаризованной RAG2-kRASG12D в эмбрионы один-клеток стадии в основном, как описано в 27 данио штамма интерес (Фиг.1В). Инъекции следует проводить в клетке, а не в желтке более высокую эффективность. В этом эксперименте, дважды трансгенных AB-деформированного состояния; MYF5-GFP, был использован mylpfa-mCherry. Поднимите данио использованием стандартного Разведение рrotocols 28.
    ПРИМЕЧАНИЕ: выживание Инъекции часто зависит от рыбок данио используемого штамма. В среднем, 30% из введенных эмбрионов будет развиваться Erms. 300-600 эмбрионы должны быть введены в эксперименте с целью обеспечения того, чтобы достаточное количество GFP-положительных и mCherry-позитивные первичные опухоли генерируются для трансплантации и анализа.

5. Скрининг для первичных Erms в данио рерио Личинки

  1. Соблюдайте вводят данио от 10 до 30 дней после инъекции для появления видимых внешних первичных Erms.
  2. В течение 30 дней после инъекции, анестезию получатель данио, добавив отдельные капли Tricaine метансульфонат (MS222 4 мг / мл стоковый раствор) в чашку Петри, содержащую систему рыб, пока движения крышечка медленно и рыба до сих пор.
    Примечание: Доза Tricaine анестезии будет зависеть от возраста и размера получателя данио. Основные опухолью данио, требуют более низких доз Tricaine.
  3. Выберите основной Erms-мироносицрыбу, которая Myf5-GFP-положительные и mylpfa-mCherry-положительные, используя эпифлуоресцентной микроскопа.

6. ERMS опухоли Подготовка

  1. Жертвоприношение выбранного основного данио ERMS несущий в 1,6 мг / мл Tricaine метансульфонат (MS222) в течение 10 мин или до никакого движения крышечки не видно.
  2. Преобразовать каждое несущей опухоль, данио отдельно. Поместите рыбу в чистую чашку Петри и анализировать вокруг опухоли с помощью лезвия бритвы и тонких щипцов (как показано на рисунке 1b). Передача расчлененный ткани опухоли в чистую чашку Петри.
  3. Добавить 100 мкл предварительно охлажденной 0.9x фосфатный буфер солевом растворе (PBS) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Фарш ткани с чистой бритвой> 20 раз, пока клетки находятся в однородной суспензии.
  4. Добавить 900 мкл того же самого буфера (0.9x PBS + 5% FBS), пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить клетки с использованием 1000 мкл отфильтрованного пипетки. Фильтр по 40 и# 956; м сетчатый фильтр в соответствующий 50 мл коническую трубку. Храните на льду.
  5. Вымойте чашки Петри с дополнительным 2-4 мл буфера, и пройти через тот же сито меш и в соответствующей конической трубе.
  6. Центрифуга при 1000 х г в течение 10 мин, при 4 ° С.
  7. Удалите супернатант и ресуспендируют в 100 мкл буфера.
  8. Подсчитать общее число жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего красителя и гемоцитометра.
  9. Развести клеток в желаемой концентрации в том же буфере (0.9x PBS + 5% FBS). Клетки должны быть разбавлены до 5 х 10 3 клеток / мкл для пересадки 5 мкл каждого получателя рыбок данио в общей сложности 2,5 х 10 4 клеток на получателя.
  10. Анализ проточной цитометрии также может быть выполнена с небольшим количеством суспензии со стадии 6.5, чтобы квантовать относительные соотношения флуоресцентных клеток в образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите 100 мкл клеточной суспензии (после фильтрации в шаге 3,5) и разбавляют 400 мклиз 0.9x PBS + 5% FBS подвески буфера для анализа потока цитометрии. Для обеспечения надлежащего стробирования, выполните дополнительный анализ с использованием одного трансгенного опухолевой ткани или мышцы изолированы от взрослых дикого типа, MYF5-GFP и mylpfa-mCherry рыбы. Выполните проточной цитометрии по существу, как описано в шаге 2 раздела 1.

7. Трансплантация Erms во взрослую RAG2 гомозиготных мутантов данио рерио

  1. Очистить 10 мкл 26S G микро-шприц, втягивая и исключении 10% раствор отбеливателя (5 раз), а затем 70% -ным этанолом (5 раз), а затем следуют подвески буфера (0.9x PBS + 5% FBS, 10 раз ).
  2. Обезболить получатель гомозиготную RAG2 мутантный рыбу, добавив отдельные капли Tricaine метансульфонат (MS222 4 мг / мл стоковый раствор) в чашку Петри, содержащую рыб в воде системы до тех пор, движения крышечка не являются медленными и рыба все еще.
  3. Поместите под наркозом данио получатель на мокрой бумажным полотенцем или SPONGE, с вентральной стороной вверх.
  4. Вводят 5 мкл клеточной суспензии в брюшную полость (2,5 х 10 4 клеток на реципиента).
    Примечание: инъекционной иглы должны быть очищены от инъекции различных опухолей, как описано в стадии 4,1. От 5 до 10 мкл может быть эффективно пересаживают внутрибрюшинно, в зависимости от размера рыбы получателя. Опухоль приживления может быть достигнуто путем инъекции 1 × 10 4 до 5 х 10 5 клеток на несортированных рыбы получателя (Таблица 1).
  5. Осторожно положите получатель данио в чистую емкость с пластиковой ложкой.
  6. Оценка получатель данио для ставок приживления на 10, 20, 30 дней после пересадки путем визуализации наркозом рыбу при ярком поле и эпифлуоресцентной микроскопии.
  7. Использование насаждаемое рыбы для последующих применений, включая флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) для оценки состояния дифференцировки (рис 3Н), стандартный гистологический анаSIS (фиг 3F), реакции изображений терапия 15, и / или последовательного трансплантации подходов, включая ограничение анализ разбавления 11.

Результаты

Порядок подготовки и пересадки клеток скелетных мышц с α-актин-ОПП трансгенных доноров в иммунной угрозу гомозиготную RAG2 мутантный данио была продемонстрирована (Протокол Раздел 1, 1А и фиг.2). Скелетной мышечной ткани получают из α-актин-RFP трансгенных доноров и в результате суспензию отдельных клеток содержится 84,3% жизнеспособных клеток по оценке DAPI исключения после проточной цитометрии (рис 2б). RFP-позитивные клетки состоит 35,3% от этой одной клеточной суспензии (рис 2С). Трансплантация клеток в спинной скелетных мышц RAG2 гомозиготной мутантной рыбы получателя привело к последовательной и сильной приживления по оценке дифференциации отдельных клеток в многоядерные волокон (1 х 10 6 клеток вводили на рыбу, таблица 1, рисунок 2D-I). Wild типполучатель рыба не удалось привить мышечные волокна более 30-дневного эксперимента (п = 13). По 10 дней после трансплантации, 9 из 14 RAG2 гомозиготной мутантной рыбки данио, содержащиеся RFP-положительных мышечных волокон вблизи места инъекции (64,3%, рис 2Е, F). Важно отметить, что привиты ЗП-положительных мышц сохраняется в течение 30 дней после трансплантации (фиг 2G-I), с подмножеством животных следят за 115 дней после приживления и экспонирования надежный и стойкий приживления мышц (данные не показаны). Эти результаты аналогичны тем, которые ранее сообщалось нашей группой 23, используя тот же протокол (таблица 1).

Мы также представили метод для производства, подготовки и трансплантации Erms опухолевых клеток в брюшную полость RAG2 гомозиготной мутантной рыбы получателя (протокол разделе 2, рис 1B и рисунок 3). ERMS были получены в doublе трансгенных Myf5-GFP; mylpfa-mCherry рыба, которая, как было показано, чтобы позволить визуализацию внутри-опухолевой гетерогенности и функционального анализа опухолевых клеток субпопуляций после трансплантации 11. Однако дальнейшее молекулярная характеристика каждой субпопуляции трудно, потому что рыба мало, когда они развиваются Erms от 10 до 30 дней жизни и количество опухолевых клеток являются предельными для последующих применений. Одним из решений является расширение числа опухолевых клеток путем прививки Erms в взрослых данио получателя. На сегодняшний день, подобные эксперименты были завершены с помощью CG1-деформированного сингенную рыбу и требуется более 4 поколений обратного скрещивания по развитию сингенные линии, которые были трансгенных по MYF5-GFP; mylpfa-mCherry. Чтобы обойти эти проблемы, мы продемонстрировали полезность иммунной угрозу RAG2 гомозиготной рыбок данио мутант получателя привить основные Erms от AB-деформированного рыбок данио. Все первичные ERMS привиты в РАg2 гомозиготные мутантные животные, облегчающие расширение опухоли (таблица 1). Похожие результаты были недавно сообщили, где 24 27 RAG2 гомозиготных мутантов рыбок данио привитых Erms, а 0 из 7 дикие братья и сестры типа привиты болезни 23. Представитель пример привиты Erms показано в течение 30 дней после трансплантации на рисунке 3Е. Привиты ERMS разделить гистологические особенности эмбриональная рабдомиосаркома, аналогичной той, что содержится в первичной опухоли (фиг 3В и 3F). Анализ FACS подтвердил, что Erms содержатся функционально различных опухоль, распространяющуюся клетки и дифференцированные клетки, экспрессирующие MYF5-GFP и / или mylpfa-mCherry. Выживаемость следующие внутрибрюшинного процедуры инъекции были в избытке 95%. Получатель данио обычно поддаваться от бремени опухоли после 30 дней после трансплантации момент времени.

figure-results-1
Рисунок 1. Протокол схема, (А) нормальных и (B) скелетных трансплантации злокачественных мышечных клеток в RAG2 гомозиготных мутантов данио. Дополнительные шаги, отмеченные звездочкой (*).

figure-results-2
Рисунок 2. скелетных мышц приживления в RAG2 гомозиготной мутантной рыбки данио. () Α-актин-RFP трансгенных доноров данио. (Б) Жизнеспособность клеток из суспензии изолированных мышечных клеток, как оценивали путем исключения красителя DAPI и проточной цитометрии. (C) Доля RFP-позитивных клеток, обнаруженных в мышечных клеток суспензии с α-актин-RFP донора (красный), по сравнению с диким контроля типа(Серый). (DE) Слияние светлого поля и флуоресцентных изображений животных дикого типа (D) или RAG2 гомозиготной мутантной рыбы (E) на 30 дней после трансплантации. (F) приживления ставки с течением времени. Красным цветом отмечены количество привитых животных, а серый показывает не-привиться рыбу. Количество животных, проанализированных в каждый момент времени указаны. (GI) Высокое увеличение изображения в коробках области в панели Е, показанный на 10 (G), 20 (H) и 30 (I) дней после трансплантации, показывая сохранение дифференцированных мышечных волокон с течением времени (стрелки). Масштабные линейки равна 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3. Трансплантация MYF5-GFP; mylpfa-mCherry ERMS в RAG2 гомозиготных мутантов . данио (AD) RAG2-kRASG12D индуцированные первичные ERMS, возникающие в AB-деформированного MYF5-GFP; mylpfa-mCherry данио на 30 дней жизни. (EH) RAG2 гомозиготных мутантов рыбок данио привиты с Erms и проанализированы в течение 30 дней после трансплантации. (A, E) Слияние светлого поля и флуоресцентных изображений начальных и пересаженных Erms. Опухоль область изложены и стрелка указывает место инъекции в E. (В, F) Hematoxylin- и эозином окрашенных парафиновые срезы первичного (б) и привиты ERMS (F), показывающие зоны повышенной клетками, связанных с раком. (С,G) Жизнеспособность клеток оценивали, как путем исключения красителя DAPI и проточной цитометрии. (D, H) Флуоресцентные опухолевых клеток субпопуляции, как определено с помощью проточной цитометрии. Масштабные линейки равна 2 мм (A, E) и 50 мкм (B, F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Таблица 1. Результаты приживления для мышц и трансплантации Erms клеток. (*) Обозначает сообщалось ранее данные, используя те же методы, 23. Данные перепечатано с разрешения методов природы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой таблицы,

Обсуждение

Эффективная и надежная приживление взрослых скелетных мышц спинного была достигнута с очень простым методом клеточного препарата с последующим инъекции клеток в спинной мускулатуры RAG2 гомозиготной мутантной рыбы. В общем, внутримышечные инъекции процедуры были очень надежными, с некоторыми связаны смерть сразу после процедуры имплантации, от 10% до 35% в зависимости от опыта. Дополнительная оптимизация, скорее всего, сосредоточится на использовании меньшего калибра иглы для инъекций и развития стационарной аппаратуры впрыска с использованием микроскопа и микроманипулятора, что будет способствовать легкость имплантации клеток. Наш подход также используется несортированные мышечные клетки от животных-доноров и содержит лишь около 30% мышечных клеток-предшественников. Использование трансгенных репортеров линий, которые маркируют стволовых клеток и изоляции FACS, скорее всего, обеспечить обогащенные клеточные суспензии, которые приводят к увеличению приживления в рыб получателя. Скелетных мышц слоктей и может быть обогащен и культивировали до трансплантации, как описано выше 29. Примечательно, что наши результаты также показывают, что шаги создания ниши и дифференциации донорской мышечной ткани происходит до 10 дней после трансплантации, создание этой модели в качестве надежной и быстрой экспериментальной площадкой для оценки приживления мышц и регенерации. Кроме того, эти эксперименты резко контрастируют с теми, завершена в мышей, где до травмы мышц с cardiotoxin или бария хлорида потребуется два дня до приживления 30,31. Вполне вероятно, что игла травмы получают во время процедуры трансплантации усиливает приживление, стимулируя производство регенеративного окружающей среды в рамках животного-реципиента 32,33. Мы также предвидим, что наш метод будет легко адаптировать к трансплантации скелетной мышечной ткани от младшего рыбок данио, позволяя оценку генетических мутаций, которые влияют на раннее развитие скелетных мышцно привести к летальности на личиночной стадии.

Мы также предоставили подробный протокол для приживления данио Erms интраперитонеально в некондиционированной, RAG2 гомозиготной мутантной рыбы. Этот подход был полезен для расширения двойных трансгенных первичных опухолей без необходимости генерации опухоли в сингенных трансгенной линии. Наша недавняя работа показала, что трансплантация клеток подходы обеспечивают новые экспериментальные модели для оценки Erms лекарственной чувствительности в естественных условиях, где единственный опухоль может быть расширена на тысячи животных и взносы за воздействие на экономический рост, самообновления и неоваскуляризации 15. Кроме того, мы успешно привиты широкий спектр опухолей в RAG2 гомозиготной мутантной рыбы в том числе Т-клеток острого лимфобластного лейкоза, меланомы, и ERMS 23. Заглядывая в будущее, мы представляем себе эти линии будут полезны для оценки важные функциональные свойства рака вVivo включая оценку внутри опухолевой гетерогенности, вторжение, метастазирование, ангиогенез, и сопротивление терапии. Кроме того, генерация RAG2 гомозиготной мутантной рыбы в оптически прозрачного Casper штамма данио 34, скорее всего, облегчить прямой визуализации многие из этих признаков рака.

В общей сложности, мы предоставляем подробные протоколы для успешного приживления флуоресцентно помечены нормальных и злокачественных скелетных мышцах в систему, чтобы взрослый RAG2 гомозиготных мутантов иммунной угрозу рыбок данио.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается Лимонад Алекса Стенд Foundation (DML), Американское общество рака (DML), в MGH Говард Goodman стипендию (DML), и Национальные институты здравоохранения предоставляет R24OD016761 и 1R01CA154923 (DML). CNY проточной цитометрии Основные и потока для анализа изображений, поделился приборы номер гранта 1S10RR023440-01A1. IMT финансируется за счет общения с португальского Фонда науки и техники (Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia - FCT). QT финансируется совета по стипендиям Китая. Мы благодарим Ангела Volorio за ее полезные замечания и советы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Буферный раствор Tris-EDTA 1xSigma-Aldrich93283-100MLMicroinjection. Инъекционная смесь.
Хлорид калияFisher Science EducationS77375-1Микроинъекция. Инъекционная смесь.
Фермент рестрикции XhoINew England BiolabsR0146Sмикроинъекция. Линеаризация плазмид.
QIAquick Набор для очистки ПЦРQiagen28104 (50) или 28106 (250)Микроинъекция. Для очистки линеаризованной плазмиды до 10 кбн.
фенола/хлороформа/изоамилового спиртаFisher ScientificBP1753I-100. Для очистки линеаризованной плазмиды.
Ультрачистая агароза, 500  gИнвитроген16500-500Микроинъекция. Количественное определение линеаризованной плазмиды.
Спектрофотометр Nanodrop 2000Thermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspxмикровпрыск. Количественное определение линеаризованной плазмиды.
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Life TechnologiesD1306проточная цитометрия/FACS
5 мл полистирольная круглая донная трубкаBD Falcon352058пробирка для сбора проточной цитометрии
BD FACSAria IIBD BiosciencesSpecial Order Research Products (SORP) программаFACS
5 мл полипропиленовая круглая донная трубкаBD Falcon352063Пробирка для сбора FACS
BD LSR IIBD BiosciencesSpecial Order Research Products (SORP) программапроточной цитометрии
Фосфат Буферизованный физиологический раствор, pH 7,4 (1x)Life Technologies10010-023трансплантация
Фетальная бычья сывороткаOmega ScientificFB-01трансплантация
трикаина метансульфоната (MS-222)Western Chemical Inc.http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.htmlТрансплантация. Анестезирующий. Внимание: Раздражающее средство. Раздражает глаза, дыхательную систему и кожу.
VWR Абсорбирующие скамьиподкладки VWR56616-018Трансплантация. В качестве альтернативы можно использовать обычные бумажные полотенца или губку.
Промышленные бритвенные лезвия Singe EdgeVWR55411-050Чашка
, Полистрирен, Одноразовый стерильныйVWR25384-302
Сетчатый фильтр для трансплантации, 40 & микро; m НейлонFalcon-Corning Incorporated352340трансплантация
50 мл центрифуга TubeCorning Incorporated430828трансплантация
Трипановый синий краситель (0.4%)Life Technologies15250-061трансплантация
Набор гемацитометров Hausser Scientific1483трансплантация
шприц Гамильтона, несъемная игла, объем 10 &; l, размер иглы 26s ga (скошенный кончик)Hamilton80366трансплантация
Austin's A-1 Bleach, коммерческаякомпанияAustin Transplantation. Можно использовать любое коммерческое решение.
Этанол 190 ProofDecon Labs, Inc.DSP-MD.43Микроинъекция (линеаризованная очистка плазмид) и трансплантация. Любой рекламный ролик  Можно использовать раствор.
Высокоскоростная микроцентрифуга, цифровая микроцентрифуга 300DDenville Scientific Inc.C0265-24Трансплантация
Sorvall Legend XFR CentrifugeThermo Scientific75004539 пересадка. Каталожный номер для 120 В, 60 Гц (США).
5 мл серологических пипетокBD Falcon357529трансплантации
Corning Stripettor Plus Pipetter ControllerCorning Incorporated4090Transplantation. Можно использовать любой автоматический контроллер пипетирования.
Неопудренные смотровые перчаткиВсе шаги. Можно использовать любую коммерческую марку.
Наконечники для фильтрации пипеток и микропипетки Всеэтапы. Можно использовать любую коммерческую марку.
Щипцы Dumont #5Fine Science Tools11205-20трансплантационный
флуоресцентный стереомикроскопOlympusMVX10Scoring. Можно использовать любой подходящий флуоресцентный стереомикроскоп.
Olympus DP72 микроскоп цифровой фотоаппаратOlympusDP72Scoring. Можно использовать несколько камер, подходящих для выбранной системы обработки изображений.
Микроинъекции Петри для трансплантации, , James

Ссылки

  1. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
  2. Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  4. Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
  5. Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
  6. Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
  7. Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  8. Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  9. Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  10. Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
  11. Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  12. Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
  13. Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
  14. Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768(2011).
  15. Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
  16. Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801(2013).
  17. Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
  18. Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  19. Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086(2012).
  20. Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  21. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  22. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790(2011).
  23. Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
  24. Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
  25. Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
  26. Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
  28. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
  29. Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  30. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
  31. Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532(2014).
  32. Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
  33. Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
  34. White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Rag2

Похожие статьи