Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

10.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52614

⸱

30 июля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Immunology, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Genetics of Skin Carcinogenesis, German Cancer Research Center (DKFZ)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Изучение медуллярных эпителиальных клеток тимуса in vitro было в значительной степени неудачным, поскольку современные системы 2D-культивирования не имитируют сценарий in vivo. Описанная здесь 3D-система культивирования - модифицированная модель органотипической культуры кожи - доказала свое превосходство в повторении пролиферации mTEC, дифференцировке и поддержании неразборчивой экспрессии генов.

Аннотация

Развитие внутриотраслевой тимуса Т-клеток требует сложной трехмерной сетчатой ​​структуры, состоящей из различных стромальных клеток, то есть, не-Т-клеток. Тимоциты пройти этот эшафот в хорошо скоординированным временной и пространственной того в то время как последовательно проходя обязательные контрольные точки, т.е. Т-клеток коммитирование, а затем поколения репертуара Т-клеточного рецептора и отбора до их экспорта в периферии. Два основных типа клеток, образующих житель этого эшафот являются корковых (cTECs) и мозгового тимуса эпителиальные клетки (mTECs). Ключевой особенностью является mTECs так называемый беспорядочный выражение многочисленных тканевых антигенов ограничено. Эти ткани ограниченным антигены представлены незрелых тимоцитов, прямо или косвенно, mTECs или дендритных клеток тимуса, соответственно в результате аутотолерантности.

Подходящие модели в пробирке эмуляции пути развития и функции cTECs и mTECs настоящее время лаковыекороль. Это отсутствие адекватных экспериментальных моделей, например мешает анализ разнородной экспрессии генов, которая до сих пор мало изучены на клеточном и молекулярном уровне. Мы адаптировали 3D органотипической модель совместного культуры к культуре экс естественных условиях изолированных mTECs. Эта модель была первоначально разработана для выращивания кератиноцитов таким образом, чтобы генерировать эквивалента кожи в пробирке. 3D-модель сохраняется ключевые функциональные особенности Mtec биологии: (I) пролиферации и терминальной дифференцировки CD80 вот, Aire-отрицательной в CD80 привет, Aire-положительных mTECs, (II) отзывчивость к RANKL, и (III) устойчивого выражения FoxN1, Aire и тканей ограниченным гены в CD80 привет mTECs.

Введение

Разработка тимоцитов составляют около 98% от тимуса, а остальные 2% состоит из множества клеток, которые в совокупности составить в строму тимуса (т.е. эпителиальные клетки, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки). Наружные корковые клетки эпителия (cTECs) обеспечить эмиграцию про-Т-клеток из костного мозга, Т индукции клеточных клонов в мультипотентных предварительно Т-клеток и позитивной селекции самостоятельной MHC ограничено тимоцитов. Внутренние мозговые тимуса эпителиальные клетки (mTECs) участвуют в индукции толерантности этих тимоцитов с высоким сродством ТКР для самостоятельной пептид / МНС комплексов по обе вызывающего негативного отбора или их отклонения в Т нормативно клеток линии. В контексте индукции центральной толерантности, mTECs уникальны тем, что они выражают широкий спектр тканей ограниченным аутоантигены (très), таким образом, зеркальное периферической себя. Это явление называется выражение беспорядочную ген (PGE)1,2.

Большинство современных исследований на эту увлекательную типа клеток зависят от бывших естественных изолированных клеток, а различные краткосрочные 2D культура системы неизменно привели к потере PGE и ключевых молекул регулятора, как MHC класса II, FoxN1 и Aire в течение первых 2 дней 3-6 , Оставалось неясным, однако, какие именно компоненты и особенности неповрежденной 3D сетчатая тимуса в 2D моделей пропали без вести. Повторное объединение тимуса органной культуре (РИПЦ) было до сих пор единственным 3D система, которая позволяет исследовать развитие Т-клеток, с одной стороны, и стромальных клеток биологии, с другой стороны, в здоровом тимуса микросреды 7. Тем не менее, RTOCs имеют определенные ограничения, то есть они уже содержат сложную смесь клеток, требует ввода плода стромальных клеток и выдержать максимальный период культуры 5 до 10 дней.

Отсутствие редукционистская в культурах клеток препятствует изучениенекоторые аспекты развития Т клеток и тимуса органогенеза не менее молекулярная регулирование PGE и его отношения к биологии развития mTECs.

Вследствие тесной связанности-структурированной организации эпителиальных клеток кожи и тимуса, мы выбрали 3D Органотипической культура (OTC) системы, которые были разработаны изначально для эмуляции дифференцировку кератиноцитов в пробирке и, таким образом, создать кожный эквивалент. Внебиржевой системе состоит из инертного лесов матрицы с наложением кожных фибробластов, которые попали в фибрин геля, на который кератиноциты высевают 8,9. Здесь мы заменили кератиноцитов с очищенными mTECs. Сохраняя основные черты этой модели, мы оптимизировали некоторые параметры.

В принятой модели внебиржевом mTECs распространение, прошли терминальную дифференцировку и поддерживается идентичность Mtec и PGE, таким образом, тесно подражая в развитии естественных mTECs 10. Эта техническая записка содержит подробный протокол, позволяющий пошаговый наладка тимуса ОДКБ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Regierungspräsidium Карлсруэ. Все животные были размещены под конкретного патогена условий на Германский онкологический центр (DKFZ). Для всех щенков культура эксперименты мыши от 1 до 7 дней в возрасте были использованы.

1. Выделение из тимуса mTECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги пищеварения проводили, как описано ранее 1 в стерильных условиях с некоторыми изменениями следующим образом.

  1. Обезглавьте щенков мыши и удалить тимус. Поместите thymi на льду в чашку Петри, содержащую RPMI 1640 (содержащей 5% FCS).
  2. Вырезать thymi в мелких, маленьких кусочков и место в круглым дном трубки с ~ 5-30 мл RPMI СМИ и осторожно перемешать с помощью магнита в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. После этого слейте супернатант, содержащий в основном тимоцитов и переварить оставшиеся ткани последовательно один раунд collagenaSE Тип IV (0,2 мг / мл и 57 Ед / мл конечного concentartion) в течение 15 мин каждый при 37 ° С с последующим коллагеназы / диспаза (0,2 мг / мл и 1,2 ед / мл конечной концентрации) в течение 25 мин каждый при 37 ° С в водяной бане с магнитной мешалкой, пока thymi полностью переваривается. Используйте 1 мл фермента на 2:58 thymi.
  4. Перемешивают ткани раз в 7-10 мин с помощью пипетки Пастера. Бассейн коллагеназы / диспазу фракции и фильтруют через 70 мкм марли.
  5. Обогащайте mTECs магнитным сортировки ячейки (MACS). Выполните очистку mTECs магнитным сортировки клеток, как описано выше 11, а показано на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для магнитной сортировки mTECs мы использовали следующие антитела: анти-CD80-PE (16-10A1, использование в разведении 1: 100) и анти-EpCAM-био (G8.8, использование в разведении 1: 100) 12. Незрелые и зрелые mTECs использованием MACS были определены как: CD45 - CD80 + EpCAM - и CD45 - CD80 + respectivЭли.
  6. После очистки MACS (чистота незрелых mTECs = 83,1 ± 6,3% и зрелых mTECs = 79.23 ± 3.42%), семена в mTECs на органотипической культур, как описано ниже (раздел 2.3).
  7. Кроме того, сортировки mTECs по FACS (с использованием мкм сопла 100) после истощения CD45 MACS, используя следующие антитела: анти-CD45-PerCP (30-F11, использование при разведении 1: 100), анти-Ly51-FITC (6C3, использовать на 1 : 100 разведение), анти-ЕрСАМ-Alexa647 (G8.8, использование в масштабе 1: 500 разбавления) и анти-CD80-PE (16-10A1, использование при разведении 1: 100). Исключить мертвые клетки, используя пропидий йодид (1: 5000) (день 4). Незрелые и зрелые mTECs помощью FACS были определены как: PI - CD45 - Ly51 - ЕрСАМ + CD80 - и CD45 PI - - - Ly51 ЕрСАМ + CD80 +, соответственно.

2. 3D Органотипической Co-культуры (ОДКБ)

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-кожный конструкции для органотипической выращивания keratinocytES были получены, как описано выше 9,13. На всех этапах клетки инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2. В OTCs использованием mTECs были подготовлены с незначительными изменениями в следующем.

  1. Подготовка фибробластов человека
    ПРИМЕЧАНИЕ: кожные фибробласты человека были получены из эксплантов культур де-epidermised дермы, как описано ранее 9.
    1. Вкратце, вырезать полоски кожи человека (~ 5 см длины) и обработать термолизина (0,5 мг / мл в физиологическом растворе с 10 мМ Hepes рН 7,4) O / N при 4 ° С.
    2. После этого отделить эпидермис от дермы с помощью щипцов.
    3. Мелко нарезанный дермы на мелкие кусочки, место в пластине 10 см Петри и дать высохнуть в течение 1-2 часов в стерильной воздушного потока. Дополнение эксплантов регулярно DMEM, содержащей 20% FBS.
    4. Сплит вне растет фибробласты, когда сливной (обычно около 3 недель), используя 0,1% трипсин, убедившись, что экспланты продолжать придерживаться пластины для дальнейшего конПоследовательные раунды вырост.
    5. Развернуть фибробласты из тех же эксплантов до 3 раз в DMEM с 10% FBS и крио-сохранение им 14. Используйте ту же партию фибробластов для каждой экспериментальной серии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: фибробласты не были облучены для наладки кожных эквивалентов.
  2. Подготовка строительные леса
    1. Отрежьте 0,4-0,6 мм толщиной вискоза, нетканый волокнистый материал (Детали продуктов в поддержку Excel лист) в хорошо разграниченные кругов, используя острый 11 мм диаметр металла перфоратор точно вписываются в 12 и фильтра вставками. Затем поместите его в 12 и фильтрующего (полиэстер капиллярной мембраны пор, 3 мкм пор по размерам), как эшафот. Поместите полную установку фильтра в стерильный пластины 12-а.
    2. Подготовка фибрина геля с использованием фибринового клея-набор для операции, состоящей из комбинации фибриногена и тромбина. Предварительно разбавить fibrinogen- а также тромбина компонента комплекта 8 мг / мл и 10ед / мл, соответственно. Для одного лунку 12-луночного планшета в действовать следующим образом.
      1. Развести 100 мкл фибриногена (8 мг / мл) с 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) без Ca 2+ и Mg 2+, рН 7,0. Развести 100 мкл тромбина (10 единиц / мл) с 100 мкл FCS, содержащие 270000 фибробласты.
      2. Разливают 200 мкл тромбина, содержащего фибробласты клеток смешивают на помост, к которым добавляют 200 мкл фибриногена (смесь 1: 1), в результате чего в конечной концентрации фибриногена 2 мг / мл тромбина и 2,5 ед / мл. Все хорошо перемешать и равномерно распределить по всей площади эшафот, осторожно пипеткой (День 1).
        Примечание: Через 30 мин при 37 ° С сгусток ограждающих фибробласты будут сформированы, заполняя полностью внутренние пространства каркасом и формирования гладкую верхнюю поверхность.
  3. Совместное культивирование с mTECs
    1. Для предварительной культуры, погружаться культур органDMEM с 10% FBS, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты и 1 нг / мл TGF-β1 с среднего изменения через день в течение 4-5 дней.
    2. В день посева Mtec, замените носитель по rFAD среды (1: 1 DMEM + DMEM / F12) с 10% FBS, 10 -10 М холерного токсина, 0,4 мг / мл гидрокортизона, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, RANK-лиганда (0,1 мкг / мл) и 500 единиц / мл апротинина, таким образом предотвращая преждевременное фибринолиз путем сериновых протеаз, секретируемых фибробластами.
    3. 7-8 ч позже, настройки со-культуры путем посева 250000 mTECs (либо полные mTECs или CD80 и CD80 вот привет подмножества), в объеме 100 мкл на лунку сверху фибробластов эшафот. Граф клеток с использованием камеры Нейбауера (День 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во все времена тимуса 3D органотипической культуры погружается в СМИ в отличие от ОДКБ кожи, которые воздуха поднимается.
    4. После 24 ч инкубации, поставить культур со средней (общая среда обмена), а упомянутые выше (шаг 2.3.2) Теперь containiнг уменьшается количество апротинина, 250 ед / мл (день 5).
    5. Для оценки пролиферативной активности mTECs, добавить Эду (6,7 мкм / мл, т.е. 10 мкм / лунку) в OTCs в течение 4 часов до прекращения культур. Выполните окрашивание OTC крио-секций, как описано в пакете ОБР изображений в сочетании с совместным окрашиванием кератина 14. Определение пролиферативные показатели mTECs, либо путем подсчета К14 + ОБР + клеток в двух секциях каждого образца культуры или потоком цитометрии (ОБР проточной цитометрии, раздел 1.7, но вместо Ly51-FITC использовать CDR1-PB 15 на разведение 1: 100 и 2.3.6.4).
    6. После 4-7 дней совместного культивирования, прекратить ОДКБ и процесс выделения РНК, крио-срезов или FACS-анализа (день 8-11).
      1. Прекратить культур с помощью щипцов, отделяя эшафот / кожный эквивалент от фильтра вставки также.
      2. Для крио-срезов, вставлять весь OTC в октябре соединения и заморозить в Liуслуга паров азота, прежде чем крио-срезов. Подготовьте 5-7 мкм OTC секции, использу криостат и хранят при -20 ° С до использования. Для иммуно-гистохимии крио-срезы ОДКБ использовать анти-кератина 14 (AF64, использование в масштабе 1: 1000 разбавления), и анти-виментин (gp53, использование в разведении 1: 100) антител. Выполните косвенный иммуно-окрашивание, используя гистохимии соответствующие вторичные антитела.
      3. Для выделения РНК, добавить 1 мл денатурирующих решение (содержащий фенол и гуанидина тиоцианата) в винтовой колпачок 2 мл РНКазы свободной трубки. Вырезать весь OTC на куски с скальпелем и добавить в пробирку, содержащую раствор денатурирующего. Механически малейших OTCs с FastPrep инструмента в два раза в течение 30 сек при скорости 6,0, в промежутке между на льду в течение 2 мин (образец можно хранить при -80 ° С, после этого момента). Если в замороженном виде при -80 ° С, оттаивают на льду. Центрифуга трубки на 11,500-13,000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и Follow протоколы выделения РНК с использованием кислоты гуанидина извлечение тиоцианата-фенол-хлороформ, как описано производителем.
      4. Для анализа FACS, удалить и отделить каркас мембраны из фибрина / фибробластов / Mtec геля. Мелко нарезанный гель скальпелем и переварить в FACS трубы для ~ 20 мин или до тех пор, пока полностью переваривают с 2 мл коллагеназы / диспаза при 37 ° С на водяной бане с магнитной мешалкой. Перемешивают раствор фермента с помощью пастеровской пипетки каждые 5 мин. После полного переваривания, фильтровать клеточной суспензии через 70 мкм фильтр; окрасить суспензии отдельных клеток с использованием антител, как описано в 1.7, и анализируют методом проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы приняли 3D органотипической сокультуры модель (3D OTC), который был первоначально разработан для в пробирке долгосрочной культуры кератиноцитов 9. MACS-обогащенные mTECs (см MACS обогащению схема Рисунок 1) высевали на эшафот, состоящей из фибрина гель и захваченных фибробластов. Фибробласты обеспечивают существенную внеклеточный матрикс (ECM) с поддержкой mTECs в пробирке. MTECs культивировали в ОДКБ для 4-14 дней в присутствии RANKL в затопленных культур в отличие от ке...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наряду RTOCs, 3D OTCs было намного превосходит по TEC дифференциации и PGE обслуживания / индукции (таблица 1) по сравнению с другими (I) 'упрощенные 3D культуры' с помощью - фибробласты один, без строительных лесов; (II) 2D системах с помощью - фибробласты / фидерные клетки культивируют совместно с ТЕМ 10, (III) 3T3-J2-клетки, где TEC клонов разработки, но PGE теряется, (IV) или Матригель (V) компоненты ECM (неопубликованные данные). PGE поддерживали в течение 7 дней в 3D ОДКБ, 4 дне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого финансового или коммерческого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Немецким центром исследования рака (DKFZ), Европейским консорциумом "Tolerage", Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) и Landesstiftung Baden-Württemberg.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Беременные мышки C57BL/6 Колонки Charles River WIGA
LSMiltenyi Biotec130-042-401
MSколонки Miltenyi Biotec130-042-201
CD45 Микрогранулы, мышьMiltenyi Biotec130-052-301
Анти-PE МикрогранулыMiltenyi Biotec130-048-801
Микрогранулы стрептавидинаMiltenyi Biotec130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 и -биотин)Ref. 12
CD80-PE антителоBD Pharmingen553769
CD45-PerCP антителоBD Pharmingen557235
антитело Ly51-FITCBD Pharmingen553160
CDR1-Pacific BlueRef. 15
Антитело к кератину 14CovancePRB-155P
Антитело к виментинуProgenGP58
Cy3-конъюгированное AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 111-165-003
Alexa 488-конъюгированный AffiniPure F(ab')2 Фрагмент козьей свинки анти-морской свинки IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 106-546-003
Вторичное антитело козы против кролика IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 488Молекулярные зонды (Invitrogen GmbH)A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Набор для визуализацииInvitrogenC10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Набор для анализа проточной цитометрииInvitrogenC10425
12-луночные фильтрующие вставки (тонкие)Greiner bio-one
12-луночный планшетGreiner665180-01
Jettex 2005/45ORSA, Giorla Minore, Италия
Фибриноген TISSUECOL-Kit ImmunoBaxter
Thrombin TISSUECOL-Kit ImmunoBaxter
PBSServa47302.03
DMEMLonzaBE12-604F
DMEM/F12LonzaBE12-719F
HEPESGibco15630-049 
FBS GoldGE HealthcareA11-151
Апротинин (тразилол)Bayer4032037
Токсин холерыBiomolG117
ГидрокортизонСеромед (Биохром)K3520
L-аскорбиновая кислотаSigmaA4034
TGF-ß 1ИнвитрогенPHG9214
RANKLR& D systems462-TR-010
ТермолизинSigma Aldrich  T-7902
OCT СоединениеTissueTek4583
Тризол (aka. Денатурирующий раствор - кислотная экстракция гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ)Инвитроген10296028
FastPrep FP120Thermo Scientific
Collagenase Type IV CellSystemsLS0041890,2 мг/мл и 57 ед/мл конечного конс.
Нейтральная протеаза (диспаза)CellSystemsLS0021040,2 мг/мл и 1,2 ЕД/мл конц.
ДНКаза I Рош11 284 932 00125 &микро; г/мл конечная конц.
657631

Ссылки

  1. Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
  2. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
  3. Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
  4. Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
  5. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  6. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  7. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
  8. Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
  9. Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
  10. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  11. Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
  12. Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
  13. Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
  14. Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
  15. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

медуллярные эпителиальные клетки тимусакаркас из фибринового гелядермальные фибробласты человекаанализ методом проточной цитометриииммуногистохимическое окрашиваниеметод выделения РНКколлагеназное расщеплениечувствительность к RANKL
3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.