Представленные протоколы описывают две методики, основанные на ферментно-связанном иммуносорбентном анализе (ЭЛИСА), для быстрого исследования лиганд-рецепторных взаимодействий: Первый анализ позволяет определить константу диссоциации между лигандом и рецептором. Второй анализ позволяет быстро проводить скрининг блокирующих пептидов для лиганд-рецепторных взаимодействий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для всестороннего понимания сигнальных путей требуются детальные знания о взаимодействии лиганд-рецептор. В данной статье описываются два быстрых и надежных точечных протокола иммуноферментных анализов (ИФА) для исследования взаимодействий лиганд-рецептор: прямой анализ взаимодействия лиганд-рецептор (АВЛ) и конкурентный АВЛ. В качестве примера представлен ИФА, основанный на анализе взаимодействия между различными лямбда-интерферонами (IFNL) и альфа-субъединицей их рецептора (IL28RA): прямой АВЛ используется для определения констант диссоциации (значения KD) между рецептором и лигандами ИФН, а конкурентный АВЛ для определения ингибирующей способности олигопептида, который был разработан для конкуренции с IFNL на месте связывания с рецептором. Описанные аналитические шаги для оценки значений KD и наполовину максимальной ингибирующей концентрации (IC50) описаны. Наконец, в обсуждении подчеркиваются преимущества и недостатки представленного метода и то, как результаты позволяют лучше понимать молекулярные взаимодействия лиганд-рецептор.
Введение
Полное понимание сигнальных путей требует детального знания о взаимодействии лиганд-рецептор. Большинство методов оценки взаимодействия конкретного лиганда с его специфическим рецептором являются дорогостоящими, отнимает много времени, трудоемкими и требуют специального оборудования и опыта 1.
В данной статье описываются два быстрых и надежных протоколов точка за точкой для исследования взаимодействия лиганд-рецептор на основе иммуноферментного анализа (ИФА): анализ на прямой лиганд-рецептор взаимодействия (LRA) и конкуренция LRA. ELISA является высокочувствительным, специфические и легко доступны метод, обычно используется поч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагентов
- Для получения карбонатного буфера для нанесения покрытия, растворения 0,36 г Na 2 CO 3 и 0,84 г NaHCO 3 в 100 мл дистиллированной воды; стерильный фильтр буфер с использованием вакуума не приводимый 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) мембранный фильтр и хранить при комнатной температуре до использования.
- Приготовьте моющий раствор путем добавления 0,05% об / об Твина 20 в фосфатном буферном растворе (PBS).
- Приготовьте 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (блокирующий раствор) в растворе PBS растворением 5 г БСА (≥98%) в 100 мл PBS и хранят при температуре 4 ° С.
- Рекомби....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Константы диссоциации между INFL1-3 и их рецептора альфа-субъединицы IL28RA определяли с использованием прямого LRA. Результаты показаны на рисунке 3: доля занятых участков связывания наносится на график логарифма соответствующей концентрации IFN. Скэтчарда данных отображается в правом нижнем углу. Результаты показывают , что прямая АСБ дает кривую связывания, которые могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить значение K D. Величина К D
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
ELISA является стандартным и хорошо общепризнанный метод для многих лабораторий. Далее мы изменены и улучшены ранее опубликованного метода 5,7. Продемонстрировал шаг за шагом протокол показывает , как он может быть использован в простой способ для определения значений K D взаимодействий лиганд-рецептор. Кроме того, ИК 50 блокирующего пептида, который препятствует взаимодействию лиганд-рецептор может быть определено.
Основные преимущества быстрая настройка, легкая подгот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
A.E. зарегистрирована как получатель грантов от программы «SNSF Ambizione Score» (PZ00P3_154709), «Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte» Базельского университета, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel и Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. выражает благодарность за поддержку iPhD стипендии инициативы SystemsX.ch в программе системной биологии (9я очередь).
Благодарности
Мы выражаем благодарность проф. Дж. Стеллингу (департамент биомедицинских исследований и инженерии, ETH Цюрих и Швейцарский институт биоинформатики, Базель, Швейцария) за его критическое обозрение рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | Пластина для ELISA |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | Для буфера покрытия пластинки для ELISA |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | Для буфера покрытия пластинки для ELISA |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA в PBS для блокировки |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Рецомбинантный человеческий интерлейкин-28 рецептор альфа |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Рецомбинантный человеческий интерлейкин-29/Без носителей/C-концевой 10-His тег |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Рецомбинантный человеческий интерлейкин-28A/Без носителей/C-концевой 6-His тег |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Рецомбинантный человеческий интерлейкин-28B/Без носителей/C-концевой 6-His тег |
| 6x His Моноклональное антитело (мышь) | Clontech | 631212 | Первичное антитело для захвата His-метки Лигандов |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Секундное антитело, связанное с пероксидазой хрена |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | Субстратный раствор TMB для ELISA |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Растворители для остановки ферментативных реакций) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | Пластиночный электронабиратель для ELISA |
Ссылки
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
