Методическая статья

ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий

DOI:

10.3791/53575

⸱

14 марта 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные протоколы описывают две методики, основанные на ферментно-связанном иммуносорбентном анализе (ЭЛИСА), для быстрого исследования лиганд-рецепторных взаимодействий: Первый анализ позволяет определить константу диссоциации между лигандом и рецептором. Второй анализ позволяет быстро проводить скрининг блокирующих пептидов для лиганд-рецепторных взаимодействий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для всестороннего понимания сигнальных путей требуются детальные знания о взаимодействии лиганд-рецептор. В данной статье описываются два быстрых и надежных точечных протокола иммуноферментных анализов (ИФА) для исследования взаимодействий лиганд-рецептор: прямой анализ взаимодействия лиганд-рецептор (АВЛ) и конкурентный АВЛ. В качестве примера представлен ИФА, основанный на анализе взаимодействия между различными лямбда-интерферонами (IFNL) и альфа-субъединицей их рецептора (IL28RA): прямой АВЛ используется для определения констант диссоциации (значения KD) между рецептором и лигандами ИФН, а конкурентный АВЛ для определения ингибирующей способности олигопептида, который был разработан для конкуренции с IFNL на месте связывания с рецептором. Описанные аналитические шаги для оценки значений KD и наполовину максимальной ингибирующей концентрации (IC50) описаны. Наконец, в обсуждении подчеркиваются преимущества и недостатки представленного метода и то, как результаты позволяют лучше понимать молекулярные взаимодействия лиганд-рецептор.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полное понимание сигнальных путей требует детального знания о взаимодействии лиганд-рецептор. Большинство методов оценки взаимодействия конкретного лиганда с его специфическим рецептором являются дорогостоящими, отнимает много времени, трудоемкими и требуют специального оборудования и опыта 1.

В данной статье описываются два быстрых и надежных протоколов точка за точкой для исследования взаимодействия лиганд-рецептор на основе иммуноферментного анализа (ИФА): анализ на прямой лиганд-рецептор взаимодействия (LRA) и конкуренция LRA. ELISA является высокочувствительным, специфические и легко доступны метод, обычно используется почти в каждой лаборатории. ELISA, могут быть выполнены и адаптированы в различных модах. Представленные протоколы оптимизированы для изучения взаимодействия между различными интерферонами лямбда (INFLs) и их рецепторов.

Прямой LRA позволяет использовать quantificatiна лиганд-рецептор связывания в отношении концентрации лиганда и, таким образом, дает кривую связывания. С помощью соответствующего модели взаимодействия лиганд-рецептор, эти данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить константу диссоциации (K D).

В представленном протоколе, обычно используется уравнение Хилла применяется для моделирования лиганд-рецептор связывания. Хотя другие методы , такие как поверхностного плазмонного резонанса технологии 2,3 позволяют определить аффинности связывания между двумя белками, эта технология часто трудоемкий, дорогой и требует специального лабораторного оборудования.

Конкурс LRA позволяет скрининг ингибирующих пептидов: лиганд-рецептор связывания количественно по отношению к концентрации пептида. Это дает кривую доза-ответ, описывающую ингибирующее действие пептида. Данные могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить максимальную концентрацию ингибирования половину (IC 50 ) блокирующего пептида.

Оба протокола ELISA просты в использовании, и может быть адаптирован к широкому кругу вопросов исследования. Рекомбинантные белки любого типа могут быть использованы, чтобы надежно и быстро определить детали взаимодействия. Кроме того, конкуренция LRA может быть использован для определения критических участков взаимодействия лигандов и рецепторов с использованием блокирующих пептидов, которые предназначены для имитации либо лиганд, либо рецептор. Если блокирующий пептид показывает эффективное и специфическое ингибирование, пептид занимает критический сайт взаимодействие лиганда (если пептид имитирует рецептор) или лиганда (если пептид имитирует лиганд).

Первый протокол описывает определение K D значение различных INFLs и альфа - субъединицу их рецепторов, т.е. интерлейкин-28 - рецептора (IL28RA) с использованием прямого LRA. Далее, второй протокол показывает, как определить способность 20 аминокислот, длинного пептидаингибируют взаимодействие INFL-IL28RA. Пептид предназначен, чтобы конкурировать с IFNLs на их сайт связывания с рецептором и, таким образом, позволяет молекулярное понимание взаимодействия. Кроме того, этот пептид может быть использован для блокирования IL28RA в экспериментах в пробирке , чтобы определить влияние на нижестоящих сигнальных эффектов 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка реагентов

  1. Для получения карбонатного буфера для нанесения покрытия, растворения 0,36 г Na 2 CO 3 и 0,84 г NaHCO 3 в 100 мл дистиллированной воды; стерильный фильтр буфер с использованием вакуума не приводимый 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) мембранный фильтр и хранить при комнатной температуре до использования.
  2. Приготовьте моющий раствор путем добавления 0,05% об / об Твина 20 в фосфатном буферном растворе (PBS).
  3. Приготовьте 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (блокирующий раствор) в растворе PBS растворением 5 г БСА (≥98%) в 100 мл PBS и хранят при температуре 4 ° С.
  4. Рекомбинантный Рецептор, лигандами и блокирующие Пептиды
    1. Reconstitutethe рекомбинантного человеческого рецептора интерлейкина альфа-субъединицы (IL28RA) и рекомбинантных His-помеченных лигандов человеческого IFN (IFNL1-3) в соответствии с инструкциями изготовителя и хранить при температуре -80 ° C. Синтезируют блокирующие пептиды и использовали , как описано выше 4. Используйте PBS для приготовления различных концентраций лигандаs и пептиды для использования в анализах.
  5. Для получения первичного антитела, разбавленные 6X Его мышиных моноклональных антител в PBS с 0,1% BSA в соотношении 1: 1000 разбавления. Для приготовления вторичного антитела, разбавленные с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированное козье антитело против мышиных IgG (H + L) в PBS с 0,1% BSA в соотношении 1: 10000 разбавления.
  6. Приготовьте раствор ТМБ путем смешивания реагентов А и В в соответствии с инструкциями изготовителя.
  7. Подготовка стоп - раствора путем добавления 5 N серной кислоты (H 2 SO 4) в дистиллированной воде и хранят при комнатной температуре.

2. иммуноферментного анализа (ИФА)

Примечание: Прямое взаимодействие лиганд-рецептор - ELISA (прямая LRA, рисунок 1) может быть использован для измерения диссоциации рецептор-лиганд константа (K D), как меру рецептор-лиганд , сродство связывания. Взаимодействие конкуренции лиганд-рецептор ELISA (конкуренция LRA, рис 2) всеOWS скрининга пептидов (и других блокирующих соединений), которые действуют, чтобы помешать взаимодействию между лигандом и рецептором. Основной протокол , который ранее был опубликован 5 была оптимизирована.
Примечание: В обоих ИФА методы используют многоканальную пипетку для добавления растворов в лунки 96-луночного планшета в каждой стадии. В Декантируйте растворе или стадии промывки, выбрасывают решения непосредственно в раковину.

  1. Прямой лиганд-рецептор-Взаимодействие анализа (прямой LRA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для иллюстрации рабочего процесса (см рисунок 1).
    1. Покрытие Тарелка с рецепторе Рекомбинантного
      1. Развести рекомбинантный рецептор в карбонатном буфере до конечной концентрации 100 нг / мкл. Coat лунки 96-луночного планшета для микротитрования с фиксированной концентрацией рецепторов (100 нг / мкл) с помощью пипетки 100 мкл в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Исключить внешние стены пластины, чтобы избежать хорошо края артефакт. Закройте планшет крышкой и инкубироватьпластины при температуре 4 ° CO / N.
    2. Блокирование и добавление ЛИГАНДАМИ
      1. На следующий день, удалить раствор для покрытия путем наклона пластины к раковине и вымыть пластины 3 раза промывочным раствором (PBS + 0,05% об / об Твина 20).
      2. Блок свободные участки рецептора-связывания в пластине с покрытием с использованием 200 мкл 5% раствора БСА в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
      3. Откажитесь блокирующий раствор (см этап 2.1.2.1.) И мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      4. Готовят рекомбинантный His-меткой лигандов при различных концентрациях (например, 8 мкг / мл, 4 мкг / мл, 2 мкг / мл, 1 мкг / мл, 0,5 мкг / мл, 0,25 мкг / мл, 0,125 мкг / мл, 0,063 мкг / мл, 0,031 мкг / мл, 0,0 мкг / мл) в PBS. Добавьте только PBS в пустых лунок.
      5. Добавьте 100 мкл каждой концентрации лиганда в лунки в двух повторностях и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре позволяет рецептор-лигандвзаимодействие.
    3. Инкубационный с антителами
      1. После инкубации с лигандами, промыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      2. Пипетка по 100 мкл первичного анти-His раствора антитела мышиного моноклонального (1: 1000) в каждую лунку.
      3. Инкубируйте планшет при КТ в течение 2 ч; после инкубации, вылейте раствор антител (смотри стадию 2.1.2.1.) и мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
      4. Добавьте 100 мкл HRP в сочетании коза раствора вторичного антитела против мышиного IgG (1: 10000) в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 45 мин при комнатной температуре.
      5. Выбросьте раствор антител (смотри стадию 2.1.2.1.) И мыть пластины 3 раза промывочным раствором.
    4. Добавление субстрата и развития
      1. Доведите растворы субстрата TMB до комнатной температуры и подготовки субстрата ТМВ раствора А и В в соотношении 1: 1. Добавляют 100 мкл свежеприготовленные субстрата в каждую лунку и держать планшет при комнатной температуре в течение 15-30 мин. После достаточного седловине или развитие добавляют 50 мкл раствора стоп.
    5. Чтение пластины и анализ данных
      Примечание: Описанный протокол основан на предположении, что измеренный сигнал поднимается от специфического связывания. Это может быть необходимо, чтобы оценить вклад неспецифического связывания с сигналом, но это выходит за рамки данного протокола.
      1. Измерить оптическую плотность (оптическая плотность, OD) непосредственно при длине волны 450 нм.
      2. Вычтите фоновый сигнал от измеренных значений ОП и нормализовать их. Преобразовать все значения концентрации лиганда в логарифмическом масштабе ( по основанию 10, log 10).
      3. Участок нормализовалась и фон скорректированного значения ОП (Y-ось, соответствует доле занятых связывания с рецептором сайтов) против логарифма концентрации лиганда (оси Х, логарифмическая шкала 10).
      4. Для оценки величины K D, соответствует данным в следующей форме уравнения Хилла:
        tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
        Примечание: Здесь Y обозначает долю занятых сайтов связывания рецепторов и Y макс максимального связывания; [L] обозначает концентрацию свободного лиганда и коэффициента Хилла. Если есть только один сайт связывания лиганда, коэффициент Хилла п = 1. Для систем с сайтом связывания более одного лиганда, связывание проявляет положительный кооперативности, если п> 1, отрицательная кооперативность, если п <1 и, если п не кооперативности = 1. микроскопическое константа диссоциации называется и соответствует половине максимальной эффективной концентрации EC 50 6. Кажущаяся константа диссоциации K d = (K D) п. В простейшем случае , когда п = 1, константы диссоциации соответствует концентрации лиганда , при которой половина рецептора сайтов связывания заняты и K d = K D. Эта модель предполагает связывание в условиях равновесия, а также, что лишь небольшая часть массовых действийдобавленный лиганд , связанный с рецептором, то есть, [L] >> [RL].

figure-protocol-1
Рисунок 1. Анализ Прямой лиганд-рецептор-взаимодействие (прямое LRA). Шаг за шагом протокол для прямого LRA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Конкурс лиганд-рецептор-Взаимодействие анализа (конкурс LRA)
    Примечание:. Для иллюстрации рабочего процесса смотри Рисунок 2 Порядок проведения конкурсов LRA те же шаги, что и прямой LRA (нанесение покрытия на пластину, инкубирование антитела, развитие пластины) для важных изменений лиганда и пептидов , кроме стадии добавления. Надлежащие отрицательные контроли имеют важное значение для данного анализа. В предыдущем исследовании скрининга 4, зашифрованное блокирующий пептид не проявлял антагонистические эффекты.
    1. Блокирование - Добавление ЛИГАНДАМИ и преграждать пептидами
      1. На следующий день, удалить раствор для нанесения покрытия и промойте пластину (см 2.1.2.1).
      2. Блок пластины с покрытием путем добавления 200 мкл 5% раствора БСА в каждую лунку и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
      3. Получения рекомбинантного His-маркированные лиганды (IFNL1-3) при фиксированной концентрации (2x-20 нг / мл) в PBS.
      4. Приготовьте блокирующий пептид (см Таблицу 3) с различными концентрациями в диапазоне от 10 нМ до 100 мкМ в PBS , чтобы гарантировать кривую доза-ответ.
        Примечание: Это позволяет последующее определение значения IC 50 для блокирующего пептида. В контрольных лунках, добавьте только фиксированную концентрацию лиганда без пептида, чтобы получить максимальную (100%) связывания. В заготовке, добавляют только PBS без лиганда или пептида.
      5. Добавьте 50 мкл лигандов (IFNL1-3) и 50 мкл каждого реptide концентрация в лунки в двух экземплярах.
      6. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Чтение пластины и анализ данных
      Примечание: Описанный протокол основан на предположении, что измеренный сигнал поднимается от специфического связывания. Это может быть необходимо, чтобы оценить вклад неспецифического связывания с сигналом, но это выходит за рамки данного протокола.
      1. Измерить оптическую плотность (оптическая плотность, OD) непосредственно при длине волны 450 нм.
      2. Вычтите фоновый сигнал от измеренных значений ОП и нормализовать их. Преобразовать все значения концентрации пептида в логарифмической шкале ( по основанию 10, log 10).
      3. Участок нормализовалась и фон скорректированного значения ОП (Y-ось, соответствует доле занятых связывания с рецептором сайтов) против логарифма концентрации лиганда (оси Х, логарифмическая шкала 10).
      4. Для оценки величины IC 50, соответствует данным следующему уравнению:
        figure-protocol-2
        Примечание: Здесь [P] означает концентрацию пептида, а наклон Хилла. Склон холма описывает крутизну кривой доза-реакция. IC 50 соответствует концентрации ингибитора , при которой наблюдается 50% ингибирование связывания между лигандом и рецептором.

figure-protocol-3
Рисунок 2. Анализ конкуренции лиганд-рецептор-взаимодействия (конкуренция LRA). Шаг за шагом протокол для конкуренции LRA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Константы диссоциации между INFL1-3 и их рецептора альфа-субъединицы IL28RA определяли с использованием прямого LRA. Результаты показаны на рисунке 3: доля занятых участков связывания наносится на график логарифма соответствующей концентрации IFN. Скэтчарда данных отображается в правом нижнем углу. Результаты показывают , что прямая АСБ дает кривую связывания, которые могут быть дополнительно проанализированы , чтобы оценить значение K D. Величина К D

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELISA является стандартным и хорошо общепризнанный метод для многих лабораторий. Далее мы изменены и улучшены ранее опубликованного метода 5,7. Продемонстрировал шаг за шагом протокол показывает , как он может быть использован в простой способ для определения значений K D взаимодействий лиганд-рецептор. Кроме того, ИК 50 блокирующего пептида, который препятствует взаимодействию лиганд-рецептор может быть определено.

Основные преимущества быстрая настройка, легкая подгот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.E. зарегистрирована как получатель грантов от программы «SNSF Ambizione Score» (PZ00P3_154709), «Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte» Базельского университета, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel и Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. выражает благодарность за поддержку iPhD стипендии инициативы SystemsX.ch в программе системной биологии (9я очередь).

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем благодарность проф. Дж. Стеллингу (департамент биомедицинских исследований и инженерии, ETH Цюрих и Швейцарский институт биоинформатики, Базель, Швейцария) за его критическое обозрение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)Thermo Scientific442404Пластина для ELISA
Sodium carbonate (Na2CO3)Merck497-19-8Для буфера покрытия пластинки для ELISA
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)Merck144-55-8Для буфера покрытия пластинки для ELISA
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7030-100G5% BSA в PBS для блокировки
rhIL-28Rα/IFNλR1R&D systems5260-MRРецомбинантный человеческий интерлейкин-28 рецептор альфа
rhIL-29/IFNλ1R&D systems1598-IL/CFРецомбинантный человеческий интерлейкин-29/Без носителей/C-концевой 10-His тег
rhIL-28A/IFNλ2R&D systems1587-IL/CFРецомбинантный человеческий интерлейкин-28A/Без носителей/C-концевой 6-His тег
rhIL-28B/IFNλ3R&D systems5259-IL/CFРецомбинантный человеческий интерлейкин-28B/Без носителей/C-концевой 6-His тег
6x His Моноклональное антитело (мышь)Clontech631212Первичное антитело для захвата His-метки Лигандов
Goat anti-Mouse igG (H+L)Jackson Immuno Research115-035-166Секундное антитело, связанное с пероксидазой хрена
BDoptEIA TMB reagent setBD Biosciences555214Субстратный раствор TMB для ELISA
Sulfuric acid (H2SO4)Fulka847205 N H2SO4 (Растворители для остановки ферментативных реакций)
Synergy/H1 - Microplate readerBioTeKПластиночный электронабиратель для ELISA

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155(2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51(2014).
  9. Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
  10. Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IC50

Похожие статьи