Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Summary

Описан чувствительный и точный метод количественного определения внеклеточных микроРНК с использованием химии на основе красителя и технологии капельной цифровой ПЦР.

Abstract

Циркулирующие (бесклеточных) микроРНК (миРНК) освобождаются из клеток в кровоток. Количество специфических микроРНК в обращении было связано с болезненным состоянием и имеет потенциал для использования в качестве биомаркеров заболеваний. Чувствительный и точный метод циркулирующих микроРНК количественной оценки с использованием химии на основе красителя и капелька цифровые технологии ПЦР была недавно разработана. В частности, с использованием Закрытые нуклеиновых кислот (LNA) основе микроРНК специфических праймеров, с зеленым флуоресцентным ДНК-связывающего красителя в совместимой капельной системе цифровой ПЦР, то можно получить абсолютное количественное определение специфических микроРНК. Здесь мы опишем, как выполнять эту технику, чтобы оценить количество микроРНК в биологических жидкостях, таких как плазма и сыворотки, является возможным и эффективным.

Introduction

МикроРНК (микроРНК) высвобождаются в кровоток потенциально всеми клетками организма в результате активного высвобождения или некротических и апоптотических процессов. Бесклеточные микроРНК были обнаружены в кровотоке либо в виде свободных стабильных молекул, либо связанных с липопротеинами, либо оболоченных внутри экзосом и микровезикул ^1-3. Считается, что они функционируют как межклеточные коммуникаторы ⁴, и их количество изменяется при наличии рака, сердечных расстройств или аутоиммунных заболеваний ^5-7. Их точная и воспроизводимая количественная оценка является основой для их оценки в качестве биомаркеров заболеваний. Тем не менее, по нескольким причинам, уже описанным в другом месте ^8,9, количественное определение микроРНК в сыворотке или плазме, а также в других жидкостях организма может быть очень сложным ^10,11. Недавно мы разработали метод абсолютного количественного определения циркулирующих микроРНК, основанный на специфичных для микроРНК праймерах ЛНК и технологии цифровой цифровой ПЦР (ddPCR) на основе ДНК-связывающей капли красителя ¹². Данная методология была применена для валидации биомаркеров микроРНК рака молочной железы ^13,14.

После разделения каждой молекулы микроРНК с обратной транскрибацией внутри капли размером в нанолитр, можно подсчитать количество копий каждой микроРНК в каждом образце, в основном подсчитывая количество зеленых и, следовательно, положительных, флуоресцентных капель. Как только происходит реакция ПЦР, достигается положительный подсчет, без необходимости построения стандартной кривой или учета эффективности ПЦР при расчете целевого количества, как это происходит при количественной ОТ-ПЦР (ОТ-кПЦР). Кроме того, ddPCR оказалась более чувствительной и точной, чем RT-qPCR, при количественном определении циркулирующей микроРНК ¹⁵. В этой статье мы представляем подробный протокол данной методики, обсуждая наиболее актуальные шаги и, в частности, рассматривая клинические образцы сыворотки и плазмы.

Protocol

МикроРНК Изоляция от плазмы или сыворотки

Примечание: плазменная панель и подготовка сыворотки является важным шагом в распространении микроРНК количественной оценки. Там нет предпочтительного процедура для плазмы и сыворотки крови препарата. Единственная важная вещь, чтобы рассмотреть, что все образцы из того же эксперимента должны быть обработаны с использованием точно такой же рабочий процесс. Начать с 200 мкл сыворотки или плазмы. Общую РНК может быть выделена из сыворотки или плазмы крови с использованием коммерчески доступных наборов.

1. Протокол Общую РНК (включая микроРНК) Изоляция

1. Оттепель образцы сыворотки / плазмы на льду.
2. Добавляют 1 мл лизирующего реагента (например., QIAzol) до 200 мкл сыворотки / плазмы.
3. Смешайте встряхиванием и поместите пробирку, содержащую гомогената на скамье при комнатной температуре в течение 5 мин.
4. Добавьте 3 мкл 4,16 нМ раствора синтетического микроРНК Cel-MIR-39-3p из C. Элеганс.
5. Добавить 200 мкл хлороформа. Встряхнуть пробирку энергично в течение 15 сек. Место йе трубки на скамье при комнатной температуре в течение 2 мин.
6. Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С для получения разделения фаз: верхняя водная фаза содержит РНК.
7. Передача водной фазы в новую пробирку, около 700 мкл, избежать переноса любого белого межфазного материала.
8. Добавьте 1 мл 100% этанола и перемешать с помощью инверсии.
9. Пипеткой до 700 мкл образца в мини-ротационную колонку помещают на пробирку 2 мл. Закройте крышку и центрифуге при 12000 мкг в течение 15 сек. Выбросьте проточные.
10. Повторите этот шаг, используя оставшуюся пробу.
11. Добавить 700 мкл буфера RWT в мини-ротационную колонку, закройте крышку и центрифуги в течение 15 сек при 12000 мкг для промывки колонки. Выбросьте проточные.
12. Пипеткой 500 мкл буфера RPE в мини-ротационную колонку. Закройте крышку и центрифуге в течение 15 секунд при 12000 оборотов в минуту. Выбросьте проточные. Повторите этот шаг еще раз.
13. Центрифуга мини-колонки спина на полной скорости в течение 2 мин, чтобы высушить колонку отжимаМембрана из остаточного этанола.
14. Перенести мини-колонки спиновый на новый 1,5 мл пробирку для сбора и пипетка 35 мкл РНКазы без воды на мембране колонны.
15. Центрифуга в течение 1 мин при 12000 х г, чтобы элюировать РНК.
16. Хранить РНК при температуре -80 ° С.
    Примечание: Поскольку концентрация РНК не может быть определена точно, использование фиксированных объемов в качестве меры внесенной суммы.

2. микроРНК с обратной транскрипцией

1. Растаяйте обратной транскрипции (RT) компонентов смеси реагентов: 5х реакционного буфера, нуклеазы без воды. Смешайте аккуратно перевернув пробирки и место на льду. Непосредственно перед использованием, удалите смесь фермента из морозилки и поместить на лед. Спин вниз все реагенты.
2. Приготовьте смесь реагентов RT на льду , как описано в таблице 1. Подготовьте по крайней мере , на 10% превышающую смеси.
3. Смешайте реакцию пипеткой, а затем спином вниз.
4. Инкубировать в течение 60 мин при 42 ° С.
5. Тепло-инактивировать REVERС. Е. транскриптазы в течение 5 мин при 95 ° С.
6. Остудите до 4 ° C.
7. Хранить кДНК при -20 ° С.

3. кДНК Разбавление

1. Развести количество матрицы кДНК, необходимой для запланированных реакций ddPCR в нуклеазы свободной воды. Разбавляют реакционную смесь кДНК между 1:50 и 1: 500 в воде, в зависимости от целевой микроРНК изобилия. Хранить разбавленный кДНК при -20 & deg; С. Разбавленный кДНК оказалась стабильной в течение по крайней мере 3 месяцев при -20 ° С.

4. Капелька Генерация и ПЦР

Примечание: Капелька поколение должно быть выполнено на 8 образцов одновременно. Технические повторности не требуется, в связи с высокой воспроизводимостью этой технологии ^12,15 .A Нет Шаблон управления (НТК) образец должен быть запущен в каждой пластине и для каждого различного состояния ddPCR.

1. Оттепель и уравновешивания основной смеси (например., EvaGreen Master Mix), набор праймеров микроРНК и кДНК при комнатной температуре.
2. Смешайте ю Master Mixoroughly путем переворачивания пробирки несколько раз. Спин вниз все реагенты.
3. Приготовьте смесь ddPCR , как описано в таблице 2. Когда несколько реакций ddPCR выполняются, подготовить ddPCR смешивать рабочее-решение. Подготовьте по крайней мере, на 10% превышающую смеси.
4. После сборки, тщательно перемешать и спин вниз смесь ddPCR.
5. Налейте 12 мкл ddPCR перемешивать в 96-луночный планшет для ПЦР или ПЦР-пробирки.
6. Добавить 8 мкл разведенного матрицы кДНК в каждую пробирку / лунку.
7. Вставьте картридж генератора капель в держатель.
8. Передача 20 мкл каждого подготовленного образца к образцу скважин (средний ряд) картриджа генератора капель осторожно, избегая при этом воздушные пузырьки на дне колодца.
9. Заполните каждую нефтяную скважину (нижний ряд) с 70 мкл генератора капель масла.
10. Крючок прокладку над держателя картриджа и вставьте в генератор капель.
11. Закройте крышку, чтобы начать капельной поколения в соответствии с пр производителяotocol. Когда поколение капелька закончена, откройте крышку, снимите одноразовую прокладку. Верхние скважины картриджа содержат капли.
12. Пипеткой медленно и плавно 40 мкл содержимого восьми верхних лунок (капель) в одну колонку пластины 96-луночного ПЦР.
13. Уплотнение пластины ПЦР с фольгой сразу после переноса капель, чтобы избежать испарения. Используйте прокалыванию уплотнения плиты фольги, которые совместимы с иглами в считывающее капельным.
14. Начинают Амплифицируйте (ПЦР) в течение 30 мин после герметизации пластины.
15. Выполнение протокола велосипедный в соответствии с таблицей 3.

5. Капелька Чтение

1. Мощность на читателя капель.
2. Переместить пластинку из термоциклеру к читателю капельным.
3. Поместите 96-луночный ПЦР планшет, содержащий пост-ПЦР капель в основание держателя пластин.
4. Поместите верхнюю часть держателя пластины на пластине ПЦР. Твердо нажмите обе защелкивниз, чтобы закрепить пластину ПЦР в держателе.
5. Запустите программу из системы ПК.
   1. Нажмите Setup, чтобы определить эксперимент (абсолютная количественная оценка) нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать чтение капель.
   2. При чтении капелька будет завершена, нажмите кнопку "Анализ" кнопку, чтобы открыть и анализировать данные.
   3. Используйте амплитудной участок 2D в программное обеспечение для анализа , чтобы выбрать положительные капли (лассо) (рис 1б).
   4. Используйте вкладку События, чтобы проверить количество положительных и полных капель. Общее количество 18.000 - 21000 капель обычно достигается с probeless ddPCR.
   5. После того, как положительные капли выбраны, экспортировать значения концентрации микроРНК с использованием экспортных .csv опции на вкладке концентрации.

Results

Абсолютное количество специфических микроРНК на мл плазмы или сыворотки крови может быть определена с использованием зеленого флуоресцентного ДНК-связывающий краситель и капелька цифровые технологии PCR. На рисунке 1 представлен процесс положительного-капельным отбора, который определяет конечную концентрацию микроРНК (копий / мкл ) в реакции амплификации, рассчитанной с помощью программного обеспечения для анализа. Сумма каждого микроРНК в крови сильно отличается, будуч...

Discussion

Циркулирующие микроРНК присутствуют в крови при очень низких концентрациях, и количество РНК, которые могут быть извлечены из плазмы и сыворотки крови низка. По этой причине, их трудно количественно с другими методами, такими как микрочипов и РНК-последовательности. Кроме того, существует общее отсутствие соглашения о нормализации данных и наличие эндогенных "эталонных" микроРНК в крови. В этом контексте, чувствительная технология, как капельной цифровой ПЦР, способный подсчета количества микроРНК копий на мл ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Колонки для общей РНК, включая микроРНК, экстракцию из сыворотки/плазмы
100 нмоль РНК олиго Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Набор для микроРНК с обратной транскрипцией
MicroRNA LNA PCR набор праймеров	Exiqon	204000-206xxx и 2100000-21xxxxx	Праймеры для амплификации микроРНК внутри капель
QX200 Генератор капель BioRad		186-4002	Прибор для считывания капель
QX200 Считыватель капель	BioRad	186-4003	Прибор для генерации капель
Программное обеспечение QuantaSoft	BioRad	186-3007	Программное обеспечение для сбора и анализа данных
Запайщик пластин PX1 PCR	BioRad	181-4000	Герметик
пластин DG8 генератор капель картриджи и прокладки	BioRad	186-4008	Картриджи, используемые для смешивания проб и масла для генерации капель
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 генератор капель масло для красителя	EvaGreen BioRad	186-4005	Масло для генерации капель