Методическая статья

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

DOI:

10.3791/54171

⸱

30 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 2Sino-British Research Centre for Molecular Oncology, National Center for International Research in Cell and Gene Therapy, Zhengzhou University, 3School of Basic Medical Sciences, Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус коровьей оспы (VV) широко используется в медико-биологических исследований и улучшения здоровья человека. В данной статье описывается простой, очень эффективный метод для редактирования В.В. генома с использованием системы CRISPR-cas9.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может редактировать определенные геномные локусы, управляемые одной направляющей РНК (гРНК). Система CRISPR/Cas9 успешно используется для редактирования геномов различных организмов. В данной статье мы описываем протокол редактирования генома вируса коровьей оспы (VV) в цитоплазме инфицированных VV клеток CV-1 с использованием РНК-управляемого Cas9. Cas9, управляемый РНК, индуцирует двухцепочечные разрывы ДНК, способствуя эффективной и специфической гомологичной рекомбинации в целевом участке VV, и трансген может быть включен в эти сайты путем гомологичной рекомбинации. С помощью сайт-специфического гомологичного вектора с трансгеном (трансгенами) был получен удаленный геном N1L VV с геном красного флуоресцентного белка (RFP), включенным в эту область, с эффективностью успешной рекомбинации в 10 раз выше, чем при использовании традиционного метода гомологичной рекомбинации. Этот протокол демонстрирует успешное использование РНК-управляемой системы Cas9 для создания мутантных VV с повышенной эффективностью.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус коровьей оспы (VV) представляет собой оболочечный ДНК-вирус, принадлежащий к семейству поксвирусной и играет решающую роль в одном из самых больших достижений в медицине ликвидации оспы. В после ликвидации оспы, В.В. был разработан в качестве вектора для доставки генов для вакцин против ВИЧ и других инфекционных заболеваний , 1-7, вставляя гены от различных патогенов в векторы VV. В.В. также широко используют в качестве вектора для иммунотерапии рака 8-14 особенно для развития онколитической вируса коровьей оспы с опухолью целевой репликации. Для того, чтобы создать эффективную вакцинного вектора с улучшенной селективностью в отношении раковых клеток, модификации в пределах вирусного генома необходимы, в том числе генов, делеции или введение терапевтических генов.

С развитием технологии ДНК и лучшего понимания молекулярной биологии и вирусологии, вставки чужеродной ДНК в ВВ был первоначально достиженияd с использованием гомологичной рекомбинации (HR) в 1980 - е годы 15. Этот метод до сих пор широко используется для построения векторов VV. Введение генетической модификации достигается за счет использования шатл-вектор для HR, который рекомбинирует с В.В. геном в предварительно инфицированных клетках. Тем не менее, этот метод оказался весьма неэффективным (менее 1% эффективности гомологичной рекомбинации 16) , и часто приводит к случайной вставки маркера селекции в нецелевых областей и / или потери маркера при расширении вируса.

Эффективность ДНК гомологичной рекомбинации для вставки экзогенной ДНК в геномных локусов может быть значительно повышена в присутствии двунитевых разрывов (DSBs) 17. Таким образом, технология, которая может вызвать DSBs на мишени локусов имеет большой потенциал для генной инженерии ВВ.

Недавно разработанная система CRISPR-cas9 показывает посыл для запуска DSBs в любой области гена В.В.. CRISPR-cas9 является РНК-руководствуясь нуклеазы участвует в адаптивного иммунитета против вторгшихся фагов и других зарубежных генетических материалов 18-20. Есть три CRISPR-Cas системы в диапазоне видов микроорганизмов 21. Система CRISPR-Cas типа II широко используется для редактирования генома эукариотических клеток и крупных вирусов. Он состоит из РНК - наведением cas9 эндонуклеазы (из Streptococcus Пирролидонилпептидаза), один направляющий РНК (sgRNA) и транс-активирующих crRNA (tracrRNA) 22-24. Комплекс cas9 / sgRNA распознает комплементарную 20-нуклеотидную последовательность геномной предшествующую последовательность 5'-NGG-3 'Protospacer смежный мотив (ПАМ) в клетках млекопитающих 22, 23. Она была успешно использована для эффективной генерации генетически модифицированных клеток, вирусов и животные модели 22-32.

Система CRISPR-cas9 оказалась эффективным инструментом для генома таргетирования в сочетании с гомологичной рекомбинации в цитоплазме инфицированных VV CV-1 клеткиs для создания мутантных вирусов осповакцины 33, 34. Для того чтобы расширить потенциальное применение этого метода, мы приводим подробную информацию о методологии этой системы. Описанный протокол может быть использован для создания мутанта VV с определенным делеции гена и / или руку мутантный вирус с терапевтическим трансгенов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение РНК-мишени и cas9 конструктов и Ремонт донора Вектор

  1. Клонирование gRNAs
    1. Разработка целевой последовательности РНК-гид , нацеленную на ген n1l вируса коровьей оспы следующий из принципа , изложенного выше 25. Совместите направляющую-РНК последовательности-мишени против генома вируса коровьей оспы (в данном случае, Листера штамм вируса коровьей оспы), чтобы исключить любые вне цели целевых gRNA последовательности.
    2. Обобщить и клонировать gRNA олигонуклеотиды в клонирующий вектор gRNA , как описано выше 25. Подтвердите последовательность каждого gRNA в полученном векторе Сангером секвенирования 33. Назовите полученный gRNA построить , как gRNA N2 33.
      Примечание: Целевой сайт gRNA находится в пределах гена n1l, и находится в области между левой рукой и правой рукой , что вектор покрывает ремонт донорские (рисунок 1).
  2. Клонировать ген cas9 отсутствует сигнал ядерной локализации (NLS) в полеpST1374 вектора и обозначают конструкцию как ПСТ-cas9 33.
    Примечание: Любой вектор экспрессии клонировании млекопитающих может быть использован для построения вектора экспрессии cas9.
  3. Построение вектора ремонта донора для HR
    1. Используйте ген n1l ВВ в качестве целевой области для модификации 33. Убедитесь в том, что длины левых и правых руках около 500-600 пар оснований каждая, и фланговые целевой регион.
      Примечание: Левая рука / правая рука может иметь до 50 пар оснований с перекрытием целевой области (рисунок 1).
    2. Клонирование область ремонта вектор донора n1l , как описано выше 33, 34 и обозначить вектор доноров ремонт как PT-n1l.
      Примечание: На рисунке 1 вектор ремонта донора и его целевого региона. Другие регионы VV могут быть направлены с использованием области (ген) -специфический gRNA (ы) и ремонт доноров вектор конкретных регионов. Любой клонирующий вектор может быть использован для построения вектора ремонта донора.
    3. Расширение плазмиды
      1. Преобразование плазмиды в химически компетентную E. палочки в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищают плазмиду с использованием набора для экстракции плазмидной со ссылкой на протокол от изготовителя.

    2. Посев клеток (день 1)

    1. Поддержание CV-1 клетки (почки обезьян фибробласты) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, при 37 ° С с 5% CO 2.
    2. Клетки Trypsinize CV-1, которые на 80-90% сплошности
      1. Удалить среду для культивирования клеток, отобранных из Т-175 колбы, содержащие клетки CV-1. Промыть монослой с 5 мл стерильной PBS для удаления остаточного сыворотки и отсасывает PBS. Добавить 2,5 мл раствора 1 × трипсин-ЭДТА, чтобы покрыть клетки и колбу помещают на 37 ° C инкубаторе в течение примерно 5 минут, чтобы помочь открепления клеток.
      2. Добавить10 мл клеточной культуральной среды (см шаг 2.1), чтобы приостановить клетки путем осторожного действия пипетки. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
      3. Посев клеток в 6-луночные планшеты
        1. Семенной 2 × 10 5 CV-1 клеток в 2 мл среды для культивирования клеток в каждую лунку 6-луночного планшета за день до трансфекции.
          Примечание: Дополнительный этап центрифугирования для удаления трипсин не требуется.

    3. Трансфекция cas9 плазмиды и gRNA плазмиды (2-й день)

    1. Клетки трансфекцию CV-1 (полученного на стадии 2.2.3.1) с 0,5 мкг ПСТ-cas9 плазмиды и 0,5 мкг gRNA N2 плазмиды с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Инкубируйте клетки в течение 24 ч в инкубаторе (37 ° С с 5% СО 2), а затем заменить среду с 2 мл свежей среды для культивирования клеток (описано в шаге 2.1).

    4. Заражение CV-1 клеток и Shuttle доноров VЭктор Трансфекция для HR (3-й день)

    1. Развести магистральную VVL15 вирус с DMEM среде для культивирования клеток в концентрации 2 × 10 5 БОЕ / мл. 24 ч после трансфекции cas9 и gRNA плазмид, добавьте 100 мкл разбавленного вируса в каждую лунку трансфицированных клеток CV-1.
    2. 2 ч после вирусной инфекции, трансфекции 1,0 мкг вектора доноров трансфер в VVL15-инфицированных клеток для HR с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя. Поместите трансфектированных клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч.

    5. Сбор урожая Рекомбинантный Вирус (4-й день)

    1. Через 24 ч после трансфекции с вектором донорского шатл для HR в шаге 4.2, отсоединить трансфектированных клеток CV-1 с помощью мобильного скребок. Сбор суспензии клеток в криопробирку и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вытрите среда для культивирования клеток разлитую жидкость с дезинфицирующим средством немедленно, а затем еще раз протрите 70% Этанол.

    6. Очистка Modified В.В. (I тур)

    1. На 1 -й день, 15 семян 6-луночные планшеты с 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку.
      1. На 2-й день, оттаивают замороженную клеточной суспензии, полученной на стадии 5.1, в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 3 мин и вихревого криопробирки энергично в течение 30 с для получения клеточного лизата без удаления остатков клеток.
    2. Для заражения одного 6-луночный планшет из CV-1 клеток, разбавленные 1 мкл лизата клеток с 3 мл DMEM и добавляют 0,5 мл разведенной клеточного лизата в каждую лунку 6-луночного планшета, на верхней части медиа уже настоящее время. Зараженные 6-луночные планшеты, приготовленным на стадии 6.1.
      Примечание: Удаление остатков клеток не требуется.
    3. После двух дней после заражения (т.е. на 4 -й день), определить RFP-положительных бляшек под флуоресцентным микроскопом с использованием 10X объектива и маркировать бляшки под пластиной с помощью маркера перо, обведя расположение зубного налета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 3 для репрезентативного RFP-положительных бляшек.
      1. Подготовьте шесть меченых криопробирки, содержащие 200 мкл бессывороточной DMEM среда для культивирования клеток, чтобы подобрать шесть различных RFP-положительных бляшек. Аспирируйте среда для культивирования клеток из скважины с меченым бляшки (ы) (шаг 6.3). Прикрепите наконечник 200 мкл на P200 пипетки, установите громкость на 30 мкл и принять ~ 10 мкл среды для культивирования клеток из одного криопробирку.
      2. Удерживайте кнопку пипетка толчок, не отпуская среды и использовать наконечник, чтобы почесать область одной меченой бляшки. Отпустите кнопку пипетка толчок, чтобы поднять отдельные клетки и передать его в криопробирку, содержащую 190 мкл бессывороточной DMEM.
      3. Возьмите еще 10 мкл среды из флакона с поцарапанных клетками (от последнего шага) и повторите процедуру собирания тот же RFP-положительных зубного налета три раза, чтобы собрать как можно больше клеток с царапинами, как это возможно. Перенос всех клеток в тот же флакон и хранить флакон при температуре -80 ° С.
        Примечание: В качестве альтернативы, заморозить криопробирки на сухом льду в течение 10 мин, если второй раунд очистки выполняется немедленно.

    7. Очистка Modified В.В. (II тур)

    1. Семенной 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку шесть 6-луночные планшеты и культуры клеток в течение 24 часов.
    2. Разморозить замороженные криопробирки (со стадии 6.3.3) в 37 ° С на водяной бане в течение 3 мин, а затем вихрь криопробирки энергично в течение 30 секунд, чтобы получить клеточный лизат.
      1. Добавить 0,5 мкл смешанного клеточного лизата в одну лунку 6-луночного планшета. Infect один 6-луночный планшет для каждой доски. Инкубируйте VV-инфицированных 6-луночные планшеты при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 2 -х дней (второй очистки круглый налет). Затем повторите раздел 6.3.
        Примечание: Более шести RFP-положительных бляшек может быть подобран; два или более 6-луночные планшеты могут быть использованы для очистки каждого зубного налета.

    8. Дальнейшие раунды игрока Налет Пурификации

    1. Продолжайте еще от трех до пяти раундов очистки следуя тем же протоколом, описанных в пункте 7, пока все бляшки, образованные из одной положительной бляшки, как представляется, ЗП-положительным под микроскопом.
      Примечание: Эта табличка затем считается чистой.
    2. После того , как зубной налет является чистой (рис 4, все инфицированные клетки , экспрессирующие RFP), урожай положительный налет в криопробирку и хранить при температуре -80 ° С , как описано в разделе 6.3. Проверьте зубной налет в соответствии с протоколом, описанным в шаге 9 и 10.

    9. Разверните Очищенная Налет (ы)

    1. Семенной 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку 6-луночного планшета за один день до заражения вирусом.
    2. Разморозить замороженный криопробирку с 8,2 в водяной бане C 37 ° в течение 3 мин для получения клеточного лизата. Добавьте все лизат (без удаления остатков клеток) в одну лунку 6-луночного планшета клеток CV-1 (высевают на шаге 9.1). Инкубируйте инфицированных CV-1 клеток при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 3 дней.
      1. Развернуть все очищенные бляшками (по крайней мере, три бляшки).
        Примечание: Время инфекция варьируется от 1-3 дней в зависимости от количества вируса в лизате.
    3. Урожай VV-инфицированных клеток с помощью клеточного скребка, когда более 50% клеток показывают цитопатический эффект наблюдаемый под микроскопом (клетки округляются, легко отсоединяется и RFP положительный). Собрать обособленные клетки вместе с клеточной культуральной среды в пробирку 15 мл.
      1. Гранул клетки центрифугированием при 300 г в течение 3 мин. Удалить супернатант и держать осадок клеток при -80 ° С до дальнейшего использования или сразу же использовать клеточный осадок на стадии 10.

    10. Проверка модификации Mutant В.В. при помощи ПЦР

    1. Извлечение ДНК В.В из клеточного осадка, полученного на стадии 9.3.1 с использованием набора для экстракции ДНК в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с 200 мкл дважды дистиллированной воды.
      Примечание: Используйте половину объема гранул, чтобы извлечь ДНК и сохранить остальные для вирусного производства, если клон проверяется как содержащий правильной модификации / вставки.
    2. Проверка удаления гена n1l и вставки гена RFP в n1l области.
      1. Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающий ген n1l (L025) и L026 гена с использованием праймеров, сконструированных против гена n1l. Amplify ген RFP с использованием праймеров RFP-специфических. Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающую контроль A52R методом ПЦР с использованием A52R специфических праймеров.
        ПРИМЕЧАНИЕ: См Перечень материалов для специфических праймеров.
        1. Выполните ПЦР с использованием набора мастер-микс ПЦР. Установка 25 мкл ПЦР-реакции с использованием 2 мкл ДНК-матрицы, денатурации реакции ПЦР при 94 ° С в течение 2 мин, а затем запустить 30 циклов ПЦР, выполнив следующие действия: денатурации ДНК при 94 ° С в течение 15 секунд, затем отжигают праймеры к ДНК-матриц, при 52 ° C в течение 15 с продлить ПЦР-реакции при 72 ° с в течение 30 сек.
    3. Устранить ПЦР - продуктов с использованием гель 1% -ном агарозном 33. Захват изображения геля с использованием УФ-гель док. Если n1l ПЦР отрицательный и A52R и RFP ДЗП положительны, то налет правильно изменено в n1l области.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для строительства нового вектора VV, ключевой отправной точкой является проектирование и строительство челночный вектор донор, который может предназначаться для конкретного региона генома. В этом исследовании, ген В.В. n1l был использован в качестве примера цели. Кассета челночного вектора донора для рекомбинации и целевой области в VV показаны на рисунке 1. Для повышения эффективности гомологичной рекомбинации, плазмиды , экспрессирующие cas9 и n1l-специфическую gRNA котрансфицируют в CV -1 клетки 48 ч до проведения гомологичной рекомбинации 33. Однажды (24 ч) после трансфекции, была выражена RFP в клетках CV-1 (рисунок 2). После заражения CV-1 клеток со всей лизата из гомологичной рекомбинации (этап 5), ЗП-положительные и отрицательные бляшки и наблюдали в клетках CV-1 (рисунок 3). После протокола очистки, описанный, чистый со бляшка ÜLD быть получен после того, как 3-5 раундов очистки. Как показано на рисунке 4, все бляшки после инфицирования клеточного лизата , полученного из чистого бляшки с мутантным вирусом осповакцины представил сигнал RFP. Для того, чтобы проверить , является ли чистый мутант В.В. имел правильную модификацию гена, использовали ПЦР , чтобы подтвердить отсутствие гена - мишени n1l, как показано на рисунке 5. ПЦР - модифицированного вируса показали положительный сигнал для ЗП и отсутствующий сигнал для n1l ( на рисунке 5 полоса AG), в то время как результаты ПЦР n1l для контрольного вируса (КТР) с интактным n1l области положительна. Фрагменты ДНК управления A52R были положительными для всех рекомбинантных вирусов и вируса Ctr. Эффективность HR в RFP-положительных бляшек составляет 100% (6/6) в этом эксперименте (это было до 94% в предыдущей работе 34). Описанный в настоящем документе способ улучшило эффективность рекомбинации более чем в 100 раз по сравнению с обычными протоколами 33, 34.

Содержание "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> figure-results-1
Рисунок 1:. Кассета из челночного вектора донора для гомологичной рекомбинации, а целевая область в геноме В.В. Очистку маркерный ген RFP управляется промотором H5. Вектор ремонта донор ориентированных на результаты региона n1l в гене RFP включаются в n1l области после гомологичной рекомбинации. 'X' указывает на гомологичную последовательность в векторе донора ремонта , который заменит ту же последовательность на геном вируса осповакцины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рис . 2: Визуализация CV-1 клеток через один день после гомологичной рекомбинации Однажды Afteг гомологичной рекомбинации, клетки , инфицированные VV и трансфицированные вектором донора ремонта являются RFP-положительным A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рис . 3: ПНП-позитивных бляшек в первом раунде очистки мутантного вируса В первом раунде очистки мутантного вируса, ЗП-положительные бляшки (обведено красной линией) с удалением целевой области окружены бляшек , образованных вирус дикого типа (обведено желтой линией) A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: флуоресценция микрoscopy изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рис . 4: Чистый мутант В.В. Через 3-5 раундов очистки, чистые бляшки были получены , как и все бляшки были RFP-положительными A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X) , Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Verificatioп чистого мутант VV. ДНК экстрагировали из VV инфицированных CV-1 клеток. Удаление целевой области n1l была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров n1l, введение ЗП в n1l области была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров, RFP. Дорожки AF соответствуют шесть очищенных бляшек, полоса G является контрольным табличка с n1l удаление подтверждено в предыдущей работе 33, полоса Ctr (контроль) является диким типом вируса коровьей оспы (с n1l области нетронутыми). A52R ген амплифицировали в качестве контрольного гена для всех образцов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть две основные цели, касающиеся модификации VV в терапевтических целях. Одним из них является, чтобы удалить конкретный ген, такой как ген тимидинкиназы (ТК) для ослабления вируса для противоопухолевого терапевтического применения. Другой вооружить VV с желаемого терапевтического гена (например, GM-CSF) или маркерный ген (например, ген люциферазы). Достижение любого из них включает в себя удаление целевого региона / гена. Способ лигирования прямой ДНК 35 и в пробирке методом 36 упаковки использовались ранее для создания мутантных вирусов осповакцины с изменениями гена TK. Тем не менее, эти способы имеют ограниченное применение в отношении мутации других областей в геноме из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции по всему геному. В настоящее время подход к созданию мутантный В.В. включает трансфекцию челнока (донор) вектора с маркером селекции (RFP или GFP) в CV-1 клеток через два часа после заражения VV для индукции гомологичной рекомбинации incorporatiнг на маркер селекции в целевом регионе. Выбор маркера положительных бляшек следуют их очистки 24 ч после трансфекции. Процесс очистки зубного налета может занять до 10 раундов, последние 3-4 недели и часто приводит к нежелательным рекомбинантных вирусов с маркерами селекции, вставленных в офф-целевых регионах. ДНК двухцепочечной разрывы могут эффективно индуцировать гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих 37, а также путем использования этого механизма, эффективность генерации мутантного VV может быть значительно улучшена. GRNA наведением система cas9 успешно применяется при редактировании генома и повышает эффективность гомологичной рекомбинации в эукариотических организмах 22, 25. В последнее время в клетках - хозяевах геномы аденовируса и типа I вируса простого герпеса , отредактированные с помощью gRNA-управляемой cas9 система 24. Недавно было показано, что система CRISPR cas9 является мощным инструментом для эффективного редактирования VV генома и конструирования вектора В. В. для выраженияконкретный ген.

Оба n1l gRNA наведением cas9 и метод традиционной гомологичной рекомбинации (HR) привело к успешных HR-событий на одном целевом сайте n1l. Интересно, однако gRNA наведением cas9 индуцированный HR на более высоких уровнях эффективности, чем традиционный метод управления персоналом. Таким образом, использование gRNA-управляемой cas9 устраняет необходимость очистить как можно больше бляшек для получения мутантных VVS. В этой работе, мы значительно повысили эффективность и временные рамки для генерации мутантного VV с использованием gRNA-управляемой системы cas9 33. Следует отметить, что один важный шаг для достижения высокой эффективности гомологичной рекомбинации для трансфекции клеток CV-1 с помощью плазмид, экспрессирующих cas9 и gRNA в течение 24 ч перед выполнением обычной гомологичной рекомбинации. Интервал 24 ч позволяет cas9 и gRNA быть выражены на приемлемом уровне. Кроме того, последовательность gRNA ориентации конкретного гена может должны быть оптимизированы, как мы обнаружили, что различные gRNA последовательности тГен argeting n1l варьировалась в их эффективности 33, 34.

Ограничение для CRISPR / cas9 при редактировании VV является низкая скорость RFP-положительных бляшек в первом раунде рекомбинации. Для того, чтобы получить достаточное количество RFP-положительных бляшек, содержащих рекомбинантный вирус, как правило, по меньшей мере, десять 6-луночные планшеты необходимы, что делает первый круглый скрининг утомительным. Следовательно, по-прежнему существует потребность в оптимизации протокола, чтобы преодолеть это ограничение.

Небольшой размер RFP-положительных бляшек является еще одной потенциальной проблемой, что связано с большим объемом лизата, используемого для заражения 6-луночного планшета с. Чтобы преодолеть эту проблему, меньший объем лизата должен быть использован для заражения 6-луночный планшет для получения больший размер RFP-положительные бл шки. Используя меньший объем лизата также позволит для лучшего разделения RFP-положительных бляшек из ППК-отрицательных. Следовательно, меньшее количество раундов очистки бляшек необходимы для получения чистых RFP-положительных бляшек.

Off-мишени эффекты всегда нежелательная проблема в редактировании гена. CRISPR-cas9 показал вне целевых эффектов. Тем не менее, при тщательном проектировании gRNA, вне цели эффектов можно избежать при редактировании В. В. геномов 33, 34. Это особое преимущество использования gRNA-управляемой системы cas9 для редактирования генома VV. Учитывая обещания В.В., используя систему / cas9 CRISPR ускорит развитие мутантных VVS для биомедицинских исследований, так и в трансляционной медицине. Кроме того, такая система будет также ускорить открытия в области клеточной биологии, таких как рассечение сигнальных путей, используемых для VV его актина на основе моторики.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом MRC DPFS (MR/M015696/1) и Министерством науки и технологий Китая (2013DFG32080).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Плазмида #4182441824Addgeneвектор клонирования гРНК
pST137413426AddgeneCas9 вектор
клонирования pGEMT easyA1360promegarepair донорский вектор
клонирование One Shot TOP10 Химически компетентный E. coliC4040-10Трансформация Invitrogen
QIAprep Spin Miniprep Kit 27106QiagenПлазмидная экстракция
Dulbecco' s Eagle' s Среда (DMEM)11965-092Life Technologiesсреда для культивирования
клеток фетальной бычьей сыворотки (FBS) SH30088.03HIГиклонклеточная культура сыворотка
пенициллин, стрептомицин15070-063антибиотики Thermo Scientific
Effectene301425Qiagenтрансфекция
Thermo Scientific Nalgene Криогенный флакон; 2.0  mLW-06754-96Thermo Scientificдля сбора вирусов
флуоресцентный микроскоп Olympus BX51 Флуоресцентный Olympusнашел RFP-положительный plque
DNeasy Blood & Набор для салфеток69506QiagenЭкстракция ДНК
Разгибатель Длинная ПЦР ReddyMix Master MixAB-0794/BThermo ScientificПЦР реактив
10 см чашка для культурыZ688819-6EAсигмаклеточная культура 
6-луночный планшетZ707759сигма-клеточнойкультурой 
скребок для клетокC5981сигмаскребок
1x Trypsin-EDTA растворT4299сигматрипсинизировать клетки
Virkon95015661Anachem Ltdдезинфекционное средство
Falcon tubeCLS430791-500EASigmaудерживать клеточную суспензию
N1L forward 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'SigmaPCR праймер
N1L реверс  5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'SigmaPCR праймер
A52R forward 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'Sigma PCR праймер
A52R обратный 5'-TTGCGGTATATATTATGAGGTG-3'SigmaPCR праймер
RFP forward 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3'    SigmaPCR праймер
RFP обратный 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'SigmaPCR праймер
ArgaroseA7431Sigmaresolve PCR продукт
G:BOX F3G:BOX F3SyngeneUV гель doc

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
  2. Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
  3. Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
  4. Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
  5. Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
  6. Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
  7. Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
  8. Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
  9. Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
  10. Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
  11. Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
  12. Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
  13. Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
  14. Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
  15. Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
  16. Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
  17. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
  18. Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
  19. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
  20. van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
  21. Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997(2014).
  22. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  23. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  24. Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090(2014).
  25. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  26. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
  27. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
  28. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  29. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
  30. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
  31. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  32. Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
  33. Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
  34. Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035(2015).
  35. Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
  36. Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
  37. Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9CV 1RFPN1L

Похожие статьи