Методическая статья

Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии

DOI:

10.3791/54396

⸱

29 сентября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем рекомендации по разработке синтетических "химических преобразователей", которые могут индуцировать связь между естественно неродственными белками. Кроме того, представлены подробные протоколы синтеза и тестирования специфического «преобразователя», который позволяет фактору роста активировать детоксикационный фермент и, следовательно, регулировать расщепление противоопухолевого пролекарства.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пути передачи сигнала, которые контролируют реакцию клеток на различные сигналы окружающей среды, опосредованы функцией сигнальных белков, которые взаимодействуют друг с другом и активируют друг друга с высокой специфичностью. Таким образом, синтетические агенты, которые имитируют функцию этих белков, могут быть использованы для генерации неестественных этапов передачи сигнала и, следовательно, для изменения функции клетки. Мы представляем рекомендации по разработке «химических преобразователей», которые могут индуцировать искусственную связь между нативными белками. Кроме того, мы представляем подробные протоколы синтеза и тестирования специфического «преобразователя», который может индуцировать связь между двумя неродственными белками: тромбоцитарным фактором роста (PDGF) и глутатион-S-трансферазой (GST). Также представлен способ, с помощью которого эта неестественная связь PDGF-GST может быть использована для контроля расщепления противоопухолевого пролекарства, что указывает на потенциал использования таких систем в «терапии искусственной сигнальной трансдукции». Данная работа призвана облегчить разработку дополнительных «преобразователей» этого класса, которые могут быть использованы для опосредования внутриклеточной белок-белковой коммуникации и, следовательно, для индукции искусственных клеточных сигнальных путей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансдукции сигнала пути играют важную роль практически во всех клеточных процессов и позволяют клетке быстро реагировать на внешние сигналы. 1 Эти пути часто вызываются связывание сигнальной молекулы с внеклеточным рецептором, что приводит к активации внутриклеточных ферментов. Усиление и распространение этого сигнала внутри клетки опосредовано функцией сигнальных белков, которые образуют сеть белок-белковых взаимодействий, в котором ферменты обратимо активированную с высокой специфичностью. Поскольку дисрегуляция этих сетей часто приводит к развитию рака, наблюдается большой интерес к созданию "сигнальной трансдукции терапии рака ', 2 ' в результате чего препараты предназначены для разрушения злокачественных сигнальных путей. Недавно мы предложили альтернативный подход к сигнальной трансдукции терапии, который зависит от способности препаратов генерировать неестественные пути передачи сигнала.

Для того, чтобы продемонстрировать возможность такого подхода, мы недавно создали синтетический 'химический датчик' 4 , который позволяет тромбоцитарный фактор роста (PDGF) , чтобы вызвать расщепление противоопухолевого пролекарства путем активации глутатион-S-трансферазы (GST), который не его естественный партнер по связыванию. Структура этого «датчика» состоит из анти-PDGF ДНК аптамеров, который модифицирован с ингибитором двухвалентной для GST. Следовательно, этот синтетический агент принадлежит к семейству молекул с сайтами связывания дляразличные белки, 5-7 , таких как химические индукторы димеризации (ИДС) 8-10 , а также к группе белков-связующие на основе олигонуклеотидных конъюгатов-синтетической молекулы. 11-21

Общие принципы, лежащие в основе конструкции таких систем описаны здесь и подробные протоколы для синтеза и тестирования функции этого «датчика» с обычными ферментативных анализов предоставляются. Эта работа предназначена для облегчения разработки дополнительных «преобразователей» этого класса, который может быть использован в качестве посредника внутриклеточный связи белок-белок, и, следовательно, для индукции искусственных сигнальных путей клеток.

На рисунке 1 схематически описывает принципы работы синтетических «химических преобразователей» , которые могут опосредовать неестественные белок-белковые связи. На этой иллюстрации, а 'химический преобразователь », который объединяет синтетические связующие вещества для PROTEins I и II (связующие вещества I и II), позволяет белок II, чтобы вызвать каталитическую активность белка I, который не является ее естественным партнером связывания. При отсутствии белка II, преобразователь связывает каталитический участок фермента (белка I) и ингибирует его активность (Рисунок 1, стенд II). Связывание "преобразователя" к белку II, тем не менее, обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II (рис 1, стенд III), что снижает его сродство к белковой I. В результате эффективная концентрация ' свободный 'датчик в растворе уменьшается, что приводит к диссоциации преобразователя-белка I комплекса и реактивации белка I (рис 1, состояние IV). Взятые вместе, эти шаги выделить три основные принципы, лежащие в основе создания эффективных 'преобразователей': (1) 'датчик' должен иметь конкретное связующее для каждого из белковых мишеней, (2) взаимодействие betweен вяжущего II и белка II должен быть сильнее, чем взаимодействие между связующей I и белка I, и (3) вяжущего я должен иметь возможность взаимодействовать с поверхностью белка II. Этот последний принцип не обязательно требует, чтобы связующее только я бы высокое сродство и избирательность по отношению к белку II. Вместо этого, оно основано на наших недавних исследований , которые показали , что в результате чего синтетическую молекулу , в непосредственной близости к белку может способствовать взаимодействие между этой молекулой и поверхностью белка. 19,22,23

figure-introduction-1

Рисунок 1:. Принцип работы технологии 'химических преобразователей "Когда" химический преобразователь' добавляется в активный белок I (состояние I), он связывается с его активным сайтом через связующее I и ингибирует его активность (состояние II). В присутствии белка II, однако, несвязанный "химический тransducer 'взаимодействует с белком II через вяжущего II, который обеспечивает взаимодействие между связующей I и поверхностью белка II. Это побудило связующее I-II белок взаимодействие снижает эффективную концентрацию связующего вещества I, что приводит к диссоциации "transducer'-белка I комплекса и белка I реактивации (состояние IV). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез '' Chemical Transducer

  1. Предварительные препараты
    1. Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
      Примечание: Этот раствор стабилен в течение многих лет.
    2. Готовят раствор 5 мМ аскорбиновой кислоты путем растворения 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл сверхчистой воды. Используйте свежий раствор; раствор стабилен в течение одного дня.
    3. Приготовьте Трис (Бензилтриазолилметил) Амин раствор 10 мМ Cu (II) / (ТБТА) путем растворения 25 мг бромида меди (II) пентагидрата сульфата в 10 мл сверхчистой воды и 58 мг ТБТА в 11 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Смешайте два решения. Хранить при комнатной температуре и защитить его от света.
  2. Сопряжение Процедура
    1. Растворить 100 нмоль модифицированного олигонуклеотида (ОДН-1) в 80 мклсвежего сверхчистой воды. Добавьте 20 мкл 2 М ТЕАА, рН = 7. Добавляют 80 мкл свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты (5 мМ в воде).
    2. Растворить 1,5 мкмоль (574,5 мкг) азидо-модифицированного этакриновая кислоты в 180 мкл ДМСО и добавить его к решению. Дегазирования раствора с использованием аргона в течение 60 секунд и быстро добавляют 40 мкл из (II) / раствор ТБТА Cu (10 мМ в 55% (об / об) ДМСО / вода).
    3. снова продувают аргоном, плотно закрыть, и перемешивают в течение ночи.
    4. Контроль за ходом реакции и очистки конъюгата с помощью ОФ-ВЭЖХ (подвижная фаза: А) 5% ацетонитрилом, 5% ТЕАА, 90% сверхчистой водой; Б) 65% ацетонитрила, 5% ТЕАА, 30% сверхчистой воды). 24

2. Управление GST активность по PDGF

  1. Предварительные препараты
    1. Приготовьте 50 мл буфера для анализа путем смешивания 33,9 мл фосфатно-солевом буферном (PBSx1) с 16,1 мл сверхчистой воды для достижения 8 мМ конечной концентрации фосфата и объявлениег 23,8 мг MgCl 2 , чтобы достигнуть конечной концентрации 5 мМ.
    2. Готовят раствор GST M1-1 путем растворения белка в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) и 5 ​​мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 30 мкМ. Разделите это решение в виде небольших аликвот и хранят при -80 ° С. Развести свеже, в соответствии с разделом 2.1.5.1, в буфере для анализа и держать на льду.
      Примечание: Решение будет стабильным в течение приблизительно 5 часов, или до тех пор, пока не будет снижение активности фермента.
    3. Подготовьте субстрат в соответствии со следующими инструкциями:
      1. Растворите 10 мг восстановленного глутатиона (GSH) в 325 мкл сверхчистой воды до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 21 мкл из этого раствора в 979 мкл буфера для анализа до конечной концентрации 2,1 мМ рабочего раствора.
      2. Растворите 10 мг 2,4-динитрохлорбензола (CDNB) в 492 мкл еthanol до конечной концентрации 100 мМ исходного раствора. Развести 43,2 мкл из исходного раствора в 956,8 мкл буфера дл анализа до конечной концентрации 4,32 мМ рабочего раствора.
    4. В 96-луночный планшет, поместить каждую подложку в отдельной линии (12 лунок). Вставьте по меньшей мере, 60 мкл в каждую лунку, чтобы обеспечить быстрый и легкий отвод раствора. Закройте планшет с алюминиевым листом для легкой защиты.
    5. Готовят следующие растворы в буфере для анализа:
      1. Развести GST M1-1 от 50 до конечной концентрации 0,6 мкМ димера.
      2. Развести 'химический датчик' до 30 мкМ маточного раствора.
      3. Развести PDGF до конечной концентрации 40 мкМ.
      4. Развести PDGF аптамер до конечной концентрации 250 мкМ.
  2. Измерьте GST активность в присутствии этого "химического датчика" и PDGF.
    1. Настройка процедуры эксперимента Iп-ридере для кинетического измерения.
      1. Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
      2. Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
      3. В появившемся списке вверх на верхней части окна, выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
      4. Нажмите 'Read' в меню слева.
      5. Что касается метода обнаружения выберите 'Absorbance'.
      6. Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
      7. Написать длине волны 340 нм в окне длин волн.
      8. Нажмите на 'Full Plate' снизу на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
      9. 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
      10. Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
      11. Сделайте во время выполнения 10 мин.
      12. Выберите опцию минимальные интервалы.
      13. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      14. Перетащите "читать" линия, которую яNto кинетического измерения.
      15. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      16. Сохранить эксперимент.
      17. Нажмите на кнопку "играть". Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
    2. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготавливают четыре пробы каждая из которых содержит 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Добавить к каждому образцу 0, 1.2, 2.4 или 4.9 мкл PDGF и 123,5, 122,3, 121,1 или 118,6 мкл буфера для анализа, соответственно.
    3. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетных скважинах или только в четных скважин в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
    5. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл от каждого из тон субстраты, которые были предварительно подготовлены в 96-луночного планшета (раздел 2.1.4). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения. Поскольку кинетика GST довольно быстро, стараются свести к минимуму время между добавлением субстрата и началом кинетического измерения.
  3. GST активации / ингибирования Циклы опосредуется 'химического датчика'.
    1. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить 5 образцов каждый из которых содержит 84,5 мкл буфера для анализа, 3,25 мкл 'химического датчика' и 3,25 мкл GST M1-1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    2. Добавить 3,65 мкл буфера для анализа, чтобы образец 1 и 3,65 мкл PDGF для образцов 2-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    3. Добавить 3,12 мкл буфера для анализа до образцов 1-2 и 3,12 мкл PDGF аптамеров к образцам 3-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    4. Добавить 24,4 мкл буфера для анализа в образцах1-3 и 24,4 мкл PDGF к образцам 4-5. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
    5. Добавить 7,8 мкл буфера для анализа в образцах 1-4 и 7,8 мкл PDGF аптамеров для образца 5. инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 40 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только в четных скважин в той же строке.
    7. С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из каждой подложки (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет). Осторожно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
    8. Вычислить V 0 [MOD / мин] при каждом условии вычитанием OD измеренной при длине волны 340 нм при Т = 0,5 мин от OD , измеренной при длине волны 340 нм при Т = 1,5 мин для оценки активации / ингибирования рециркулируемости. 25
  4. Оценка в режиме реального времени отклика "химического преобразователя" к изменениям в окружающей среде.
    1. В режиме реального времени эффект PDGF дополнение
      1. Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
      2. Повторите шаги 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Сделайте время автономной работы 3,5 мин.
      4. Выберите опцию минимальные интервалы.
      5. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      6. Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
      7. Выберите Plate Out / In в меню слева.
      8. Выберите опцию 'осаждаются (без диалога) ".
      9. Выберите опцию 'Delay' в меню слева и введите 30 сек.
      10. Выберите Plate Out / In в меню слева.
      11. Выберите опцию 'пластину в (без диалога) ".
      12. Создание второго кинетического измерения, повторяя шаги 2.2.1.4 - 2.2.1.14, но в разделе 2.2.1.11 установить кинетическую быть 25 мин вместо 10 мин.
      13. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      14. Сохранить эксперимент.
      15. Нажмите 'PLAКнопка Y '. Появится диалоговое окно появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
      16. Готовят два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1 и 1 мкл 'химического датчика' в 38 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
      17. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
      18. Когда пластина открывает (через 3,5 мин), быстро добавить 1,125 мкл PDGF в одну из лунок, осторожно перемешивают и оставляют пластину , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
    2. В режиме реального времени эффект от добавления аптамер PDGF
      1. Повторите шаги 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Подготовить два образца путем смешивания 1 мкл GST M1-1, 1 мкл 'химический датчик ', и 1,125 мкл ФРПТ в 36,9 мкл буфера для анализа. Вставить образцы в две лунки 384-луночного планшета для прозрачной, оставив пустой колодец между этими двумя скважинами.
      3. Использование 12-канальный мульти-дозаторов, быстро добавить 10 мкл из каждой подложки, аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырей, вставить пластину в считывающее устройство, и начать кинетического измерения.
      4. Когда пластина открывает (через 1,5 мин), быстро добавляют 1,2 мкл PDGF аптамеров в одну из лунок, осторожно перемешать и дать пластины , чтобы закрыть для остальных кинетических измерений.
  5. Мера JS-K в качестве пролекарств активации с помощью GST в Присутствия 'химического датчика' и PDGF.
    1. Установите экспериментальную процедуру в ридере для кинетического измерения.
      1. Создайте новый эксперимент в качестве "стандартного протокола".
      2. Нажмите на "процедуры", чтобы открыть окно настройки процедуры.
      3. В появившемся списке вверх на верхней части окна выберите тип '384' пластины в зависимости от производителя плиты.
      4. Нажмите 'Read' в меню слева.
      5. Что касается метода обнаружения выбрал 'Absorbance'.
      6. Что касается типа чтения выберите 'Конечная точка'.
      7. Написать 305 нм на окне длин волн.
      8. Нажмите на кнопку "Full Plate" на верхнем правом углу и выберите хорошо, чтобы быть измерена.
      9. 'OK', чтобы закрыть 'Read' окно Press.
      10. Выберите 'начать кинетический' в меню слева.
      11. Сделайте во время выполнения 10 мин.
      12. Выберите опцию минимальные интервалы.
      13. Нажмите «ОК», чтобы закрыть окно кинетическую.
      14. Перетащите "читать" линию в кинетическую измерения.
      15. Нажмите кнопку "Подтвердить", а затем кнопку «ОК».
      16. Сохранить эксперимент.
      17. Нажмите на кнопку "играть". Диалог бох появится - нажмите кнопку «ОК» только тогда, когда измерение должно быть начато.
    2. Для NO производства измерений используют комплект калориметрическое нитрита / нитрата. В 96-луночный планшет вставки 50 мкл буфера для анализа в один ряд, 70 мкл фенилантраниловая я реагента во второй ряд, и 70 мкл реагента Грисса II в третьем ряду.
    3. Для проведения эксперимента трехкратном повторе, подготовить четыре образца каждая из которых содержит 4,8 мкл 'химического датчика'. Для образца 1, добавляют 155,2 мкл буфера для анализа; к образцу 2, добавить 3,2 мкл GST-M1-1 и 152 мкл буфера для анализа; к образцу 3, добавьте 9,6 мкл PDGF и 145,6 мкл буфера для анализа; и к образцу 4, добавьте 3,2 мкл GST-M1-1, 9,6 мкл PDGF и 142,4 мкл буфера для анализа.
    4. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. В 384-прозрачной луночного планшета, вставки 50 мкл образца в каждую лунку. Вставьте образцы только в нечетные или только вдаже скважины в той же строке, чтобы разрешить использование мульти-дозаторов для добавления субстрата.
    6. Добавить 0,54 мкл JS-K (5 мМ в ДМСО) в каждую лунку.
    7. С помощью 12-канального мульти-дозаторов, быстро добавляют по 10 мкл из раствора GSH (предварительно приготовленный в 96-луночный планшет), аккуратно перемешать и быстро, чтобы избежать пузырьков. Вставьте пластину в считывающее устройство и начать кинетического измерения.
    8. Сразу же после того, как кинетического измерения, с использованием 12-канального мульти-дозаторов, принимать по 50 мкл каждого образца в буфера для строки в заранее подготовленные 96-луночный планшет и быстро добавить к нему 50 мкл фенилантраниловая I реагента и 50 мкл Грисс II реагент. Выдержите, защищая от света в течение 10 мин при комнатной температуре и измеряют поглощение при 550 нм.
      Примечание: Буфер для анализа и объемы реагентов зависят от протокола Аптечки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дизайн, синтез и механизм действия в «химического преобразователя» , который может вызвать искусственную связь между PDGF и GST представлены на рисунке 2. Структура «преобразователя» интегрирует аптамер PDGF ДНК и бис-этакриновая амид (БЭА ), который является известным ингибитором GST (рис 2а). 19 Эти связующие позволяют 'датчик' , чтобы связывать как PDGF и GST с различным сродством, а именно, с константами диссоциации (K D 'ы) от ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представили метод разработки и тестирования «химического преобразователя», который может индуцировать искусственную связь между двумя естественно неродственными белками, GST и PDGF, без модификации нативных белков. Неестественная связь GST-PDGF может быть обнаружена в режиме реального времени с помощью ферментативных анализов, которые отслеживают изменения активности GST в присутствии «химического преобразователя» и увеличения концентраций PDGF. В дополнение к выявлению активации GST с помощью PDGF, эти анализы исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Минерва, Фондом HFSP организации, и научно-исследовательского гранта Европейского Совета (Начиная Грант 338265).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-хлор-2,4-динитробензолSigma-Aldrich237329
уксусная кислотаBio Lab01070521
ацетнитрилJ.T.Baker9017-03
Аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA4544
Пентагидрат сульфата меди(II)Merck-Millipore102790
ДиметилсульфоксидMerck-Millipore802912
Dulbecco's Phosphate Buffered SaltBiological Industries02-023-5A
Этакриновая кислотаTokyo Chemical Industry Co. LtdE0526
Глутатион-s-трансфераза M1-1Израильский центр структурной протеомики (Научный институт Вейцмана, Реховот, Израиль)
JS-KSigma-AldrichJ4137
L-глутатион восстановленныйSigma-AldrichG4251
Хлорид магнияJ.T.Baker0162
набор для колориметрического анализа нитратов/нитритовCayman Chemical 780001
ОлигонуклеотидыW. M. Keck Foundation Biotechnology в Йельском университетепо индивидуальному заказу
PDGF-BBИзраильский центр структурной протеомики (Научный институт Вейцмана, Реховот, Израиль)
TBTASigma-Aldrich678937
ТриэтиламинSigma-AldrichT0886
Обессоливающая колоннаGE Healthcareillustra MicroSpin G-25 Колонки
HPLCWaters 2695 Модуль
ВЭЖХ колоннаWatersXBridgeTM OST C18 колонна (2,5 мкм; M, 4,6 мм и раз; 50 мм)
Колонка ВЭЖХWatersXBridgeTM OST C18 колонна (2,5  μ M, 10 мм и раз; 50 мм)
Планшетный считывательBioTeksynergy H4 hybrid
разделения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GSTPDGF

Похожие статьи