Мы представляем рекомендации по разработке синтетических "химических преобразователей", которые могут индуцировать связь между естественно неродственными белками. Кроме того, представлены подробные протоколы синтеза и тестирования специфического «преобразователя», который позволяет фактору роста активировать детоксикационный фермент и, следовательно, регулировать расщепление противоопухолевого пролекарства.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пути передачи сигнала, которые контролируют реакцию клеток на различные сигналы окружающей среды, опосредованы функцией сигнальных белков, которые взаимодействуют друг с другом и активируют друг друга с высокой специфичностью. Таким образом, синтетические агенты, которые имитируют функцию этих белков, могут быть использованы для генерации неестественных этапов передачи сигнала и, следовательно, для изменения функции клетки. Мы представляем рекомендации по разработке «химических преобразователей», которые могут индуцировать искусственную связь между нативными белками. Кроме того, мы представляем подробные протоколы синтеза и тестирования специфического «преобразователя», который может индуцировать связь между двумя неродственными белками: тромбоцитарным фактором роста (PDGF) и глутатион-S-трансферазой (GST). Также представлен способ, с помощью которого эта неестественная связь PDGF-GST может быть использована для контроля расщепления противоопухолевого пролекарства, что указывает на потенциал использования таких систем в «терапии искусственной сигнальной трансдукции». Данная работа призвана облегчить разработку дополнительных «преобразователей» этого класса, которые могут быть использованы для опосредования внутриклеточной белок-белковой коммуникации и, следовательно, для индукции искусственных клеточных сигнальных путей.
Введение
Трансдукции сигнала пути играют важную роль практически во всех клеточных процессов и позволяют клетке быстро реагировать на внешние сигналы. 1 Эти пути часто вызываются связывание сигнальной молекулы с внеклеточным рецептором, что приводит к активации внутриклеточных ферментов. Усиление и распространение этого сигнала внутри клетки опосредовано функцией сигнальных белков, которые образуют сеть белок-белковых взаимодействий, в котором ферменты обратимо активированную с высокой специфичностью. Поскольку дисрегуляция этих сетей часто приводит к развитию рака, наблюдается большой интерес к созданию "сигнальной трансдукции терапии рака ', 2 '....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Синтез '' Chemical Transducer
- Предварительные препараты
- Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
Примечание: Этот раствор стабилен в течение многих лет. - Готовят раствор 5 мМ аскорбиновой кислоты путем растворения 18 мг аскорбиновой кислоты в 20 мл сверхчистой воды. Используйте свежий раствор; раствор стабилен в течение одного дня.
- Приготовьте Трис (Бензилтриазолилметил) Амин раствор 10 мМ Cu (II) / (ТБТА) путем растворения 25 м....
- Приготовьте 2 М триэтиламмоний ацетат (TEAA) буфер путем смешивания 278 мл триэтиламина в 114 мл уксусной кислоты и 400 мл сверхчистой воды. Доводят рН до 7 и добавляют воду до конечного объема 1 л Хранить ее в темной бутылке.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дизайн, синтез и механизм действия в «химического преобразователя» , который может вызвать искусственную связь между PDGF и GST представлены на рисунке 2. Структура «преобразователя» интегрирует аптамер PDGF ДНК и бис-этакриновая амид (БЭА ), который является известным ингибитором GST (рис 2а). 19 Эти связующие позволяют 'датчик' , чтобы связывать как PDGF и GST с различным сродством, а именно, с константами диссоциации (K D.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представили метод разработки и тестирования «химического преобразователя», который может индуцировать искусственную связь между двумя естественно неродственными белками, GST и PDGF, без модификации нативных белков. Неестественная связь GST-PDGF может быть обнаружена в режиме реального времени с помощью ферментативных анализов, которые отслеживают изменения активности GST в присутствии «химического преобразователя» и увеличения концентраций PDGF. В дополнение к выявлению активации GST с помощью PDGF, эти анализы исполь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Минерва, Фондом HFSP организации, и научно-исследовательского гранта Европейского Совета (Начиная Грант 338265).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1-хлор-2,4-динитробензол | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| уксусная кислота | Bio Lab | 01070521 | |
| ацетнитрил | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Пентагидрат сульфата меди(II) | Merck-Millipore | 102790 | |
| Диметилсульфоксид | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salt | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Этакриновая кислота | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Глутатион-s-трансфераза M1-1 | Израильский центр структурной протеомики (Научный институт Вейцмана, Реховот, Израиль) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-глутатион восстановленный | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Хлорид магния | J.T.Baker | 0162 | |
| набор для колориметрического анализа нитратов/нитритов | Cayman Chemical 780001 | ||
| Олигонуклеотиды | W. M. Keck Foundation Biotechnology в Йельском университете | по индивидуальному заказу | |
| PDGF-BB | Израильский центр структурной протеомики (Научный институт Вейцмана, Реховот, Израиль) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Триэтиламин | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Обессоливающая колонна | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Колонки | |
| HPLC | Waters | 2695 Модуль | |
| ВЭЖХ колонна | Waters | XBridgeTM OST C18 колонна (2,5 мкм; M, 4,6 мм и раз; 50 мм) | |
| Колонка ВЭЖХ | Waters | XBridgeTM OST C18 колонна (2,5 μ M, 10 мм и раз; 50 мм) | |
| Планшетный считыватель | BioTek | synergy H4 hybrid |
Ссылки
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
