Method Article

Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

DOI:

10.3791/55119

⸱

January 18th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем высокое содержание анализа (HCA) инструмент с открытым исходным кодом с использованием автоматизированного пожизненную флуоресцентной томографии (FLIM) для опробования белковых взаимодействий с использованием Forster резонансного переноса энергии (FRET) отсчеты основе. Сбор данных для этого openFLIM-HCA инструмента контролируется программное обеспечение , написанное в μManager и анализ данных осуществляется в FLIMfit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем инструмент с открытым исходным кодом для анализа высокого содержания, использующий автоматизированную флуоресцентную визуализацию времени жизни (FLIM) для анализа взаимодействий белков с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) на основе считывания неподвижных или живых клеток в многолуночных планшетах. Это обеспечивает средства для скрининга клеточных сигнальных процессов, считываемых с помощью внутримолекулярных биосенсоров FRET или межмолекулярного FRET белковых взаимодействий, таких как олигомеризация или гетеродимеризация, которые могут быть использованы для идентификации партнеров по связыванию. Мы описываем здесь функциональность этого автоматизированного прибора FLIM с несколькими лунками и представляем примеры данных наших исследований олигомеризации белка Gag ВИЧ и временного хода биосенсора FRET в живых клетках. Затем приводится подробное описание практической реализации со ссылкой на список аппаратных компонентов и описание программного обеспечения для сбора данных с открытым исходным кодом, написанного в μManager. Также представлено применение FLIMfit, клиента с открытым исходным кодом на основе MATLAB для платформы OMERO, для анализа массивов данных FLIM многолуночных планшетов. Изложены протоколы визуализации фиксированных и живых клеток, а также продемонстрирован автоматизированный эксперимент с многолуночным планшетом FLIM с использованием клеток, экспрессирующих конструкции FRET на основе флуоресцентных белков. Это дополняется пошаговым обзором анализа данных для этого конкретного набора данных FLIM FRET.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все более широкое использование автоматизированного высокого контент - анализа (ГКА) в обнаружении наркотиков 1 к библиотекам соединений анализа дополняется тенденцией в области наук о жизни фундаментальных исследований в направлении автоматизированных экспериментов визуализации для систематических исследований, например, для фенотипических экранов библиотек миРНК. Автоматизированная HCA также становится все более важным для небольших масштабных биологических исследований, которые, как правило, были реализованы с помощью ручных экспериментов с десятками блюд клеток визуализируют с помощью обычных микроскопов. Статистическая мощность предоставляемое способности для анализа и анализировать сотни тысяч полей зрения позволяет усреднение экспериментального шума (в том числе «биологического шума») и автоматизации сбора и анализа больших выборочных массивов данных изображения может помочь устранить смещения оператора и часто может быть использован для обнаружения возникновения систематических ошибок, таких как изменения в профиле IRF во время сбора данных. Анализы на основе флуоресценциишироко применяются в ГКА, с наиболее коммерчески доступными ГЛК Instrumentation отличая томографию интенсивности флуоресценции в одном или нескольких спектральных каналов для отображения относительного распределения и совместной локализации меченых белков. Более сложные методы флуоресцентной визуализации, такие как время жизни флюоресценции томографии (FLIM), анизотропия поляризации изображения и визуализации анизотропии флуоресценции с временным разрешением, не очень широко использовались в коммерческих инструментов HCA, хотя они предлагают мощные количественные отсчеты, например, белковых взаимодействий. Здесь мы представляем подход источник открытой для реализации FLIM в автоматизированном микроскопа для ГКА.

время жизни флюоресценции обеспечивает по своей сути логометрические спектроскопического считывания, которые могут быть использованы для выделения различных видов молекул или исследовать местную молекулярную среду флуорофором и нечувствителен к концентрации флуорофора, к повышению эффективности возбуждения / обнаружения, а также к воздействию scatteкольцо и образец поглощения 2. Кроме того, поскольку измерения времени жизни флуоресценции могут быть выполнены в одном спектральном канале, они сопоставимы между различными инструментами и образцами без калибровки. Они могут быть применены к действию эндогенных флуорофоров, в том числе некоторых клеточных метаболитов, липидов и компонентов внеклеточного матрикса, чтобы обеспечить внутренние отсчеты биологических процессов и патологий. Таким образом , метка свободной FLIM может отображать метаболические изменения в клетках 3,4 и применяется для контроля стволовых клеток дифференцировки 5,6 и рост коллагеновых лесов 7. Недавно мы показали , что FLIM ГЛК может быть использован для автоматизированных без наклеек анализов клеточного метаболизма с использованием аутофлуоресценцию 8. Чаще всего, однако, измерения времени жизни флуоресценции и FLIM применяются к экзогенных флуорофоров, которые маркируют определенные биомолекулы, часто реализуется с использованием красителей, которые Stain клеточных отсеков, с помощью красителей в сочетании с antibodies, которые ориентированы на конкретные белки в фиксированных клетках, или с использованием генетически выраженных флуорофоров в сочетании со специфическими белками. время жизни флюоресценции, могут быть использованы для обеспечения надежных количественных отсчеты флуоресцентных зондов считывающих их физической или химической среды. Для примеров, красители были развернуты , чтобы почувствовать местный липидной фазы клеточных мембран 9 или вязкости элементов 10 и генетически выраженными флуоресцентного белка на основе биосенсоров были разработаны , чтобы сообщать о концентрации клетки сигнальных молекул в том числе , как IP3 11, PIP2 12 и кальпаином 13 или ионы , такие как кальций, калий 14,15 16 и хлорид 17.

Многие такие биосенсоры используют Ферстер - резонансная передача энергии (FRET) 18,19 , чтобы обеспечить отсчеты изменений в биосенсора конформации. FRET между «донором» и «акцепторных» флуорофоров происходит посредством прямого диполь-дипольного взаимодействия малого радиуса действиядля которых флуорофоры, как правило, разделены менее чем ~ 10 нм. Таким образом, обнаружение FRET указывает на тесную близость надлежащим образом меченых белков и , следовательно , обеспечивает средство для считывания белок-белковых взаимодействий 20, такие как связывание или олигомеризации - либо в качестве конечных точек в фиксированных клетках или в качестве динамических событий при измерениях курса временных живой клетки. Навешивая соответствующую молекулярную конструкцию как с донором и акцептором флуорофоров, также можно считывать конформационные изменения - или расщепление - конструкта посредством изменения FRET , и это является основой многих биосенсоров 21. Измерения эффективности FRET может предоставить информацию о расстоянии донорно-акцепторной и доли населения доноров флуорофоров, подвергающихся ладу. Таким образом, методы визуализации FRET основе может быть использован для отображения и количественного определения молекулярных взаимодействий в пространстве и во времени, например, для выяснения клеточной сигнализации процессов 22. AutomatИНГ такие методы визуализации могут обеспечить высокую пропускную способность анализов на основе считываниями сигнальных путей или сетей.

В ГКА, лада считывания чаще всего осуществляется спектрально ратиометрический изображений, где изменения в соотношении акцептора к интенсивности донора отображаются. Хотя такой подход легко реализован - и доступен во многих коммерчески доступных читателей многоямный плит - количественные спектрально разрешенных измерений FRET требует калибровки спектрального отклика системы 23. Это включает в себя спектральную перекрестные помехи, возникающие из спектрального проступание и прямого возбуждения акцептора, а также характеристик передачи инструмента и образца (внутренний эффект фильтра). В принципе, это влечет за собой измерение дополнительных "контрольных" образцов, которые обозначены как донор или только акцептор-только.

Из таких спектральных измерений логометрических FRET, эффективная FRETЭффективность (продукт фактической эффективности FRET и доли FRETing молекул донора / акцептор) могут быть получены вместе с относительной доли молекул донора и акцептора 24. Спектральный ратиометрический FRET часто используется с мономолекулярному FRET биосенсоров, где донор / акцептор стехиометрии можно считать известными. Для определения доли населения донора FRETing и акцептора, например, чтобы получить кривую зависимости ответа от дозы, знание фактической эффективности FRET требуется. Это может быть получено путем измерения положительного контрольного образца ладу известными свойствами или с помощью другого метода для измерения эффективности FRET, такие как акцепторного фотообесцвечивания или FLIM.

Использование жизни флуоресценции отсчеты, FRET могут быть обнаружены и количественно с помощью измерений только излучения донора - устраняет необходимость спектральной калибровки и последующих контрольных образцов. Таким образом, FLIM FRET показания можно сравнить между инструментамиа также между различными образцами - позволяет данным эндоскопии или томографии моделей живых болезней 25 будут сопоставляться с измерениями клеточных анализов. Соответствуя профили затухания флуоресценции донора к соответствующей модели мульти-экспоненциального затухания, соответствующей FRETing и не являющихся FRETing популяций доноров, FRET эффективность и фракции населения могут, в принципе, можно получить непосредственно без дальнейших измерений. Эти значительные преимущества, однако, приходят за счет FLIM требующих более детектируемых фотонов на пиксель, чем спектральным разрешением изображения интенсивности - как правило, сотни фотонов, необходимых для достижения точности в определении продолжительности жизни на 10%, когда прилегают к одной модели экспоненциального распада и когда подгонка профилей затухания флюоресценции до сложных моделей (multiexponential распад), число обнаруженных фотонов требуется увеличивается до тысячи. Это обычно приводит к длительным временем приобретения (от десятков до сотен секунд на поле VIЭВ) для FLIM, особенно при использовании времени коррелировали счета одиночных фотонов (TCSPC), реализованный с последовательным приобретением пикселей в лазерных сканирующих микроскопов. Попытки увеличить скорость обработки изображений с использованием более высоких интенсивностях возбуждения может приводить к значительному фотообесцвечиванию и / или фототоксичности. Вместе с отсутствием соответствующих коммерчески доступных приборов и программных средств, это мешало FLIM от быть использованы в ГКА для обнаружения или систем наркотиков биологии, где сотни до нескольких тысяч полей зрения должны быть отображены. Лазерное сканирование TCSPC FLIM реализован в автоматизированной многоямного пластины микроскопа 26 для вторичных измерений После идентификации "хитов" по стационарной поляризации с разрешением анизотропии флуоресценции изображения 27, которая может достигать подобных скоростей визуализации для спектрального логометрической изображения 28 , с которым она разделяет много преимуществ и недостатков. Флуоресцентная анизотропия изображения использует уменьшениев анизотропии флуоресценции акцептора в присутствии FRET и также чувствителен к спектральному перекрестных помех (например, прямое возбуждение акцептора). Она требует калибровки для учета поляризации перекрестных помех и не обеспечивает прямое измерение эффективности FRET.

Для того, чтобы реализовать преимущества FLIM для ГКА, мы работали, чтобы решить вопросы скорости получения изображения и более широкого доступа к этой технологии. Здесь мы предоставляем полный перечень открытых источников программного обеспечения и аппаратных компонентов, которые могут быть использованы для реализации автоматизированного быстрого FLIM Multiwell планшет-ридер, который описан ниже, вместе с образцом FRET на основе-анализов. В нашем подходе 29, FLIM реализуется с использованием временной селекцией изображений широкого поля с использованием закрытого типа оптического усилителя яркости изображения (ГОИ), который показан на рисунке 1 , который может обеспечить более высокую скорость обработки изображений и более низкую фотообесцвечивание чем однолучевом сканирования TCSPC в связи с параллельный пиксель INTERRogation. Наш openFLIM-HCA инструмент может обеспечить неконтролируемый FLIM, требуя всего несколько секунд , чтобы получить данные FLIM обнаружения несколько 100 фотонов на пиксель ( в зависимости от яркости образца). В сочетании с временем , необходимым для перемещения образца из предыдущего поля зрения, чтобы настроить параметры сбора и поддержания образца в фокусе, это обычно приводит к луночные времени приобретения пластины ~ 10 с на поле зрения 25,28. Оптический секционирования может быть реализован с использованием квази-широким полем Нипкова ( "вращающийся диск") сканера 30.

Для FLIM анализа данных, мы разработали инструмент с открытым исходным кодом под названием FLIMfit 31 , который способен быстро анализировать Multiwell наборов данных пластины FLIM на обычных рабочих станций ПК и представляет собой подключаемый модуль для Omero 32. FLIMfit предоставляет глобальные возможности анализа (обсуждается в разделе 1.2) , которые позволяют FLIM данные для установки на сложных моделей с уплотнительнымNLY несколько 100 фотонов на пиксель в предположении, что компоненты времени жизни флуоресценции инвариантны поперек изображения или области интереса (ROI), тем самым уменьшая количество зарегистрированных фотонов требуется, освещенность на образец и получения изображений времени. Запуск FLIMfit на стандартном настольном ПК, требуется только 10s секунд вычислительного времени для анализа наборов данных , содержащих сотни ПЗ. Таким образом, оба FLIM сбора и анализа данных может осуществляться на временных масштабах, которые являются практичными для ГКА.

openFLIM-HCA аппаратное обеспечение

Наша реализация FLIM HCA состоит из шести основных компонентов: (I) флуоресцентного микроскопа кадр с оптическим автофокусом; (II) моторизованной (хуг) столик микроскопа; (III) источник лазерного возбуждения; (IV) во времени закрытого типа система FLIM широкого поля с закрытого типа оптического усилителя (ГОИ), генератора задержки и камеры; (V) компьютер для сбора и анализа данных и (VI) сканера Нипкова дискаблок для оптически секционного визуализации для подавления вне фокуса света. Это может быть важно при визуализации слабых сигналов, например, от FRET биосенсоров на клеточной мембране плазмы, которая может быть перегружен за счет взносов цитоплазматической флуоресценции или фона от покровных или культуральной среды. Время закрытого данных FLIM приобретается путем освещения образца с ультракороткого импульсного излучения возбуждения, визуализации флуоресцентное излучение на фотокатод ГОИ и приобретая серию ПЗС-изображений люминофора ГОИ для диапазона настройки времени задержки оптический усилитель ворота после прихода импульсов возбуждения. По мере увеличения времени задержки затвора при возбуждении, сигнал флуоресценции наблюдается уменьшение и разные моменты времени селекцией интенсивности изображений флуоресценции, полученных на ПЗС-матрицы формируют набор данных, необходимых для анализа профилей распада всех флуорофоров в поле зрения , Стробирование ГОИ синхронизирован с импульсами возбужденияи, для серии ПЗС-приобретениям, задержка времени затвора относительно импульса возбуждения устанавливается на ряд возрастающих значений в течение требуемого диапазона. Эта синхронизация достигается с использованием генератора задержки, которая содержит «быструю коробку задержки" (при условии задержки до 20 нс с шагом 1 пс) и "грубая ящик задержки", которая обеспечивает задержку с минимальным шагом 25 пс.

Для FLIM, возбуждение может быть обеспечена с помощью любой сверхбыстрого лазера. Для удобства мы обычно используют волоконно-лазерной накачкой источник суперконтинуум, который обеспечивает пикосекундных импульсов, перестраиваемого по всей видимой части спектра, из которого соответствующее возбуждающее излучение может быть выбран для любого флуорофора с помощью моторизованного фильтра колесо с различными полосовых фильтров. Как правило, мы используем среднюю мощность ~ 100-200 мкВт на образце с импульсами с частотой повторения 40 или 60 МГц. Такие полномочия возбуждения также может быть обеспечено сверхбыстрых лазерных источников на основе удвоения частотыс синхронизацией мод титана, легированного сапфировые лазеры. Следует отметить, что длительность импульса возбуждения ниже ~ 100 пс достаточно для большинства экспериментов. Второй моторизованный фильтр колеса оснащены фильтрами нейтральной плотности используется для регулирования интенсивности возбуждения. Для удобства и безопасности, возбуждающее излучение может быть доставлены с помощью одномодового оптического волокна. Конфигурации для широкого поля FLIM и оптически секционного FLIM представлены на рисунках 2 и 3 соответственно. Для получения более подробной информации о точных компонентов , используемых, пожалуйста , посетите openFLIM-HCA вики 33. Копия текущего списка деталей приведен в дополнительных материалах.

Для широкого поля FLIM, излучение возбуждения требуется, чтобы осветить все поле зрения как можно более равномерно. Для этого направляйте лазерный луч возбуждения к голографическим "прямоугольным" диффузор, который вращается при 10-50 Гц до среднего времени лазерный спекл, с плоскостью дифТермоблок изображаемого в задней фокальной плоскости объектива микроскопа объектива. Флуоресцентного изображения с выходного порта микроскопа передается на фотокатод ГОИ и люминофора ГОИ (активная зона по диагонали 18 мм) проецируется на датчик охлаждаемого научной CCD (размер чипа 10,2 мм х 8,3 мм) камерой с помощью пары объективов, обеспечивающих увеличение в размере 0,7. Система управляется с помощью стандартного ПК, сопряженного с измерительных приборов с использованием протоколов RS232. Кроме того, Ардуино микропроцессор используется для управления затвором на пути света возбуждения, который закрыт, за исключением, когда камера CCD приобретает FLIM данных и для записи сигнала с фотодиода, который используется для измерения средней мощности от спектрально отфильтрованный сверхуширенного источник возбуждения. Для оптически секционного FLIM, лазерное излучение возбуждения соединяется в одномодовое с сохранением поляризации оптического волокна, который подключается непосредственно к блоку сканера Нипкова диска, а сhown на рисунке 3. Выход флуоресцентного изображения из блока сканера Нипкова передается на фотокатод ГОИ и остальная часть системы такая же, как для широкого поля FLIM.

Программное обеспечение openFLIM-HCA

Программное обеспечение сбора данных записывается в μManager 34. Она обеспечивает полную HCA данных функциональные возможности приобретения, включая варианты, чтобы изменить последовательность, в которой изображаются лунки пластины, чтобы получить время курсы для любого FOV, чтобы автоматически сохранять фокусировку во время измерений и контроля возбуждения и фильтрации выбросов колеса и дихроичным чейнджером для автоматизированной обработки изображений многоцветной. Кроме того , можно запустить "предварительного сканирования" приобретение интенсивности флуоресценции для того , чтобы автоматически выявлять и фиксировать позиции подходящих для ПЗ последующего FLIM приобретения в соответствии с критериями, например, на основе интенсивности. FLIM данные HCA могут быть сохранены в виде рядаиз TIFF файлов, в виде серии Оме-TIFF файлов (то есть, один за FOV) или в виде одного файла Оме-TIFF включающая в себя все данные из многоямного пластины. Более подробную информацию и подробное описание программного обеспечения μManager можно найти на openFLIM-HCA вики 33.

Программное обеспечение для анализа данных, FLIMfit 31, клиент с открытым исходным кодом на основе MATLAB для платформы 32 управления данными Omero изображений, умеет читать FLIM данные с сервера Omero или с диска компьютера, как показано на рисунке 4. Она была разработана для анализа данных из TCSPC или времени закрытого типа FLIM приборов шириной поля и предоставляет много возможностей, чтобы соответствовать данным из openFLIM-HCA включая прилегают к моноэкспоненциален профили распада, а также двойное экспоненциальное и более высокие профили распада сложности, включая такие модели, как поляризационные разрешением профили затухания флуоресценции. Он может также принять во внимание фиксированных и изменяющихся во времени фоновых сигналов и может ИМПатрических измеряется пространственно-временной функции отклика прибора (МАФ) или может поместиться используя идеализированный МАФ, которые могут быть сдвинуты во времени на пиксель-накрест основе на величину, определяемую из полного экспериментального измерения IRF. Глобальная разница во времени (T 0) между МАФ и флуоресцентной пробе может быть определено исходя из результатов измерения стандарта флуоресценции. Пространственные вариации фоновых сигналов и МАФ также могут быть приняты во внимание. FLIMfit способен соответствовать FLIM данные на пиксельной-накрест основе или с помощью "глобального биннинга" или "глобальной" фитинг для облегчения подгонки данных FLIM со скромными (сотни) фотонов числа сложных моделей распада.

Глобальный бининг влечет за собой агрегирование всех обнаруженных фотонов из пикселей в пределах определенного пользователем ROI в каждый момент времени , чтобы обеспечить достаточное количество фотонов для облегчения подгонки к сложным моделям распада. ROI может быть все поле зрения (FOV), это может быть вручную defined пользователем, или оно может быть определено с помощью сегментации изображений инструментов. ROI также можно определить с помощью масок , импортированные в FLIMfit от другого программного обеспечения сегментации изображений. Для приложений FRET, он является общим для использования глобальной биннинга в соответствии с моделью двойного экспоненциального распада определить компоненты времени жизни флуоресценции, соответствующие FRETing и не-FRETing флуорофоров доноров, которые предполагаются пространственно инвариантны по ROI, а затем переоборудовать на пиксель-накрест основа с этим срок службы компонентов долинами фиксированными для того, чтобы получить фракцию среди доноров FRETing в каждом пикселе.

Глобальная фитинга влечет за собой одновременно насадке элементов жизни , и пиксельные-накрест фракции доноров FRETing населения через весь FOV- или через FLIM набор данных , которые могут содержать множество ПЗ, например, из многоямного эксперимента пластины или временной последовательности жизни флуоресценции изображений. Глобальный фитинга может использовать пространственную variatiна фракций населения по всему изображению , что теряется в глобальном биннинга подходе , чтобы обеспечить более сильные ограничения на оценке компонентов продолжительности жизни - и , следовательно , более надежные результаты - хотя и по стоимости значительно больше вычислений 35. FLIMfit может быстро анализировать Multiwell пластины FLIM наборы данных с глобальными штуцером на обычных рабочих станциях ПК, например, многоямного времени закрытого типа набор FLIM данные, приобретенные с пятью время воротами для каждого из 394 FOV каждая из которых содержит 672 х 512 пикселей, что требует только 32 секунд и 2 Гб оперативной памяти , чтобы соответствовать к двойной модели экспоненциального затухания 31. Это было достигнуто за счет использования сепарабельный нелинейной наименьших квадратов алгоритм , реализованный с использованием многопоточных параллельных алгоритмов для обеспечения эффективного масштабирования на многоядерных процессорах и код FLIMfit был оптимизирован для минимизации использования памяти. На рисунке 5 показан снимок графического пользовательского интерфейса FLIMfitи более подробную информацию можно найти на веб-странице, приведенной в справочнике 36. Дополнительная информация о глобальном фитинга и глобальной биннинга можно найти в ссылке 31.

Следующий протокол для FLIM HCA с помощью нашего openFLIM-HCA приборов и программного обеспечения могут быть адаптированы для широкого спектра экспериментов визуализации клеток с FLIM считываниями. В общем, многоямный пластины FRET эксперименты должны быть разработаны, чтобы включать в себя дублирующие лунки положительного и отрицательного биологического контроля в дополнение к условиям исследуемого. Здесь мы опишем конкретную реализацию для выполнения оптически секционного FLIM (смотри рисунок 3) клеток Cos , экспрессирующих FRET конструкций , состоящий из mTurquoise флуоресцентного белка и Венера флуоресцентного белка , соединенных коротким пептидным линкером. Здесь mTq32V, mTq17V и mTq5V FRET конструкции (обсуждается в разделе репрезентативные результаты) обеспечивают низкую, среднюю и высокую эффективность FRET вместе с не FRETing mTq5A построить.Эти конструкции и другие материалы, необходимые, чтобы следовать этому протоколу, перечислены в списке материалов.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление Multiwell плиты массива

  1. Приготовьте раствор 75 мкМ кумарин 6 в этаноле (т ~ 2,43 нс) для измерения ссылки для того, чтобы определить T 0.
  2. Семя 150000 Cos клеток в четыре лунки 6-луночного планшета и позволяют прикрепить в течение ночи в культуральной среде (см список материалов).
  3. Трансфекцию один хорошо друг с mTq5A, mTq5V, mTq17V и mTq32V с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя и культуры в течение 24 ч.
  4. Отделить клеток с использованием коммерческого раствора трипсин / ЭДТА в соответствии с протоколом производителя.
  5. Пипетка 5000 Cos клеток, суспендированных в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS), выражающие mTq5A в каждую из лунок А1-G3 из в # 1,5 толщины стекла дном 96 многоямного пластины, которая предварительно была обработана с поли-L-лизина. Повторите эти действия для mTq5V экспрессирующих клеток в лунки A4-G6, mTq17V в лунки A5-G9 и mTq32V в лунки А10-G12.
  6. Оставьте лунку H1 пустой (чтобы обеспечить измерение любого статического фона от многоямного пластины).
  7. Пипетка 200 мкл HBSS только в лунку H2 (чтобы обеспечить измерение любого фонового сигнала из культуральной среды клеток).
  8. Пипетка 5000 не-трансфицированных клеток в HBSS в лунку H3 (чтобы обеспечить измерение любого фонового сигнала от сотовой автофлюоресценции).
  9. Внесите 200 мкл раствора 75 мкМ Кумарин красителя в хорошо H4 (чтобы обеспечить проверку любого изменения T 0 при многоямного приобретения пластины, например, из - за изменения температуры окружающей среды или к колебаниям в лазерном или временной схеме.

2. openFLIM-HCA сбора данных

Примечание: Более подробную информацию можно найти на openFLIM-HCA вики 33.

  1. Start μManager и OpenFLIM-HCA плагин
  2. Выберите файл калибровки для конкретной комбинации генераторного блока задержки иЧастота повторения лазера под "FLIM управления: Задержка калибровки окно файла: Calibration Files".
  3. Установите папку , в которой данные будут сохранены в папке "Файл: Set Base Folder".
  4. Проверьте пути луча возбуждения, чтобы обеспечить сцепление в оптическое волокно доставки является стабильным и что эффективность связывания максимизируется путем измерения мощности, передаваемой через доставки волокна с помощью измерителя мощности. Флуктуации ниже 5%, являются приемлемыми.
  5. Убедитесь, что ГОИ запуска стабильно, показывая выходной сигнал монитора с ГОИ на осциллографе, инициированной ГОИ входного сигнала триггера.
  6. Проверьте визуализацию ГОИ люминофора на ПЗС-сенсор, покрывая фотокатод ГОИ, установив его усиление до 750 В и фокусировки один из релейных линз таким образом, что изображения редких одиночных фотонов событий (из-за фонового света протекающие хотя ГОИ крышки ), записанную на ПЗС столь резким, как это возможно.
  7. Убедитесь, что в образцеполе зрения равномерно освещается с помощью получения изображения однородный флуоресцентного образца, такие как капли раствора опорного красителя на покровное, используя достаточно низкую мощность возбуждения (<1 мкВт), чтобы гарантировать, что ГОИ не насыщен.
  8. Выберите соответствующий файл определения знака, то есть, выберите вариант для 96-луночные планшеты ( "Файл: Load Plate свойства").
  9. Использование μManager GUI, убедитесь , что нет дихроичный светоделитель куб в кадре микроскопа, выбрав пустое место.
  10. Вручную выбрать ширину ворот 4 нс в ГОИ в течение всего эксперимента.
  11. Приобретать данные изображения IRF:
    1. Использование μManager GUI, убедитесь , что нет никакого объективного микроскопа на пути луча, выбрав пустое место. Вручную поместите черный блок анодированного луча над объективной башни, чтобы предотвратить вытекание лазерного луча и угол его, чтобы минимизировать любые отражения обратно в корпуса микроскопа.
    2. Использование μManager GUI, установите фильтры в CSUX (возбуждение, дихроичным, излучение) таким образом, что доля возбуждения рассеянного света от прядильной Нипкова диска может быть изображаемого , но обеспечить интенсивность не достаточно , чтобы насытить систему 200 мс CCD время интегрирования. Это, чтобы не подвергать ГОИ фотокатод слишком много света, который может повредить фотокатод.
    3. Используйте функцию Find MaxPoint по всему диапазону задержек , охватываемых программируемым быстрой коробкой задержки. Проверьте выходную схему отображения, а затем настроить окно задержки конечно вручную нажатием кнопки вперед так, чтобы полный профиль МАФ находится в пределах диапазона сканирования коробки быстрой задержки.
    4. Настройте параметры измерения (нейтральной плотности, время экспозиции, накопление кадров) , так что CCD не насыщается в ярчайшей времени ворот и эффективное время интегрирования> 200 мс.
    5. Установить шаги задержки от 25 пс более полной задержки зазвониле ( "FLIM управления: коробка Быстрая задержка: Заполняем задержки").
    6. Приобретать IRF изображение, нажав кнопку "Привязать FLIM изображение".
    7. Приобретать фоновое изображение, блокируя лазер ( "Light путь управления: нейтральной плотности: заблокирован"), уменьшение числа задержек ( "FLIM управления: коробка Быстрая задержка: текущая настройка задержки (PS)"), оставьте все другие свойства неизмененном и нажмите "Привязать FLIM изображение".
  12. Приобретать данные эталонного красителя:
    1. Выберите хорошо H4 с помощью графического интерфейса пользователя μManager ( "контроль XYZ: Перейти к хорошо: H4").
    2. Использование μManager GUI, выберите фильтры (434/17 нм возбуждения, дихроичная, эмиссия 482/25 нм) для визуализации mTqFP.
    3. Используйте функцию Find MaxPoint по всему диапазону коробки быстрой задержки , а затем отрегулировать коробку грубой задержки , так что полный профиль распада находится в пределах диапазона задержки коробки быстрой задержки.
    4. Установите задержкудо точки максимальной интенсивности путем изменения "управления FLIM: окно Быстрая задержка: Установка текущего задержки (PS)". Настройте параметры измерения (нейтральной плотности, время экспозиции) , так что CCD не насыщен.
    5. Установить шаги задержки от 25 пс более полного диапазона задержки ( "FLIM управления: коробка Быстрая задержка: Заполняем задержки).
    6. Приобретать данные опорного красителя, нажав кнопку "Привязать FLIM изображение".
    7. Приобретите второй фон CCD камеры изображения путем блокирования лазерного возбуждения (см 2.11.7)
  13. Приобретать FLIM данные многоямного образца пластины с использованием программного обеспечения сбора μManager:
    1. Набор , который скважины должны быть отображены и количество FOV приобретаемых на лунку ( "Setup ГКА виртуализированного приобретения: XYZ позиции").
    2. Вручную выбрать экземпляр FOV, содержащую образец для включения в образ. Используйте эту FOV, чтобы определить оптимальный фильтр нейтральной плотности, ширины ворот в ГОИ ивремя интегрирования камеры так, чтобы достичь 75% динамического диапазона ПЗС-камеры.
    3. Установка автоматической фокусировки ( "XYZ управления: Автофокус"): Нажмите кнопку "Return только управление фокусом", а затем вручную сосредоточиться на клетки или структуры , представляющей интерес. Установите в разделе "Автофокус диапазон поиска" до 2000 мкм и нажмите "Enter". Нажмите "AF сейчас" , чтобы начать процедуру автоматической фокусировки. Значение смещения будет отображаться в поле "FocusOffset (автофокусировка)".
    4. Введите значение смещения , полученное в 2.13.3 в "AF смещение" и повторите процедуру автоматической фокусировки дважды ( "AF сейчас") , чтобы проверить , что значение смещения теперь равно нулю, что указывает на правильность работы системы автоматической фокусировки.
    5. Используйте функцию "AutoGate" в программном обеспечении приобретения OpenFLIM-HCA выбрать логарифмической выборки точек задержки. В качестве альтернативы, они могут быть выбраны вручную, см смEnce 36 для более подробной информации.
    6. Набор "накапливать кадры" на значение, доходность желаемого общее время сбора данных. Увеличение количества накопленных кадров увеличивает отношение сигнал-шум данных FLIM за счет также увеличения общего времени сбора данных FLIM.
    7. Запуск приобретение FLIM из многоямного пластины, нажав на кнопку "Пуск" последовательность HCA.
  14. Приобретать дополнительный фон CCD камеры изображения путем блокирования лазерного возбуждения (см 2.11.7) с идентичными настройками приобретения, которые используются для сбора данных FLIM.

3. Анализ openFLIM-HCA данных с помощью FLIMfit

  1. Проверьте , что файлы , необходимые для вспомогательных FLIM анализа данных присутствуют (т.е., МАФ и измерение опорного красителя).
  2. Загрузить данные из пустого колодца (H1), скважина, содержащий культуральную среду (Н2) и хорошо содержащие немаркированные клетки в культуральной среде (H3) в FLIMfit( "Файл: Загрузить FLIM данные") , чтобы проверить , есть ли какие - либо справочные материалы больше , чем 1% сигнала из клеток , выражающих "донор-только", то есть, в колодцах A1-G3.
  3. Подготовьте файл изменяющегося во времени фона (TVB) путем загрузки хорошо культуральной средой в FLIMfit ( "Файл: Загрузка FLIM данных"). Загрузите камеры фоновые данные , полученные в разделе 2.14 ( "Справочная информация : Load Background") и используйте параметр FLIMfit "Инструменты: Создать TVB Intensity Map" для создания TVB. См ссылку 31 для получения дополнительной информации о TVB.
  4. Подготовьте пространственно изменяющуюся IRF Map Shift, путем загрузки данных IRF, приобретенных в разделе 2.11 и вычитания фона CCD камеры, приобретенное в разделе 2.11.7. Используйте опцию FLIMfit "Инструменты: Создать IRF Сдвиг карты" для расчета пространственно различной IRF Сдвиг карты. См ссылку [31] Более подробно о смещении карты IRF.
  5. Установить monoexponenциал Распад данным ссылка на красителях, приобретенных в разделе 2.12. Нагрузка опорного красителя и пространственно различной IRF карте рассчитывается в разделе 3.4, установите подходящие параметры ( "Срок службы: Нет Опыт: 1") с т 0 множество в качестве подогнанной параметра ( "Продолжительность жизни: FIT IRF Сдвиг: встроенная"). Величина T 0 получена затем приводится в таблице , показанной на вкладке "Параметры".
  6. Проанализировать FLIM данных путем загрузки экспериментальных данных FLIM приобретенных в разделе 2.13, пространственно различными МАФ Карта рассчитывается в разделе 3.4, фоновая камера приобрела в разделе 2.14, файл TVB подготовлен в разделе 3.3 и типа в отрицательном значении T 0 , полученного в разделе 3.5 ( "МАФ: IRF сдвиг: т 0"). Затем установите экспериментальные данные желаемой модели распада с использованием FLIMfit 36 в соответствии с требованиями эксперимента.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проиллюстрировать возможности openFLIM-HCA приборов, мы представляем три приложения-образцы ладу. Первый из них касается FRET конструкции, которые адаптированы из FRET типовых конструкций , разработанных лабораторией Стивена Фогеля 38. Они включают в себя ряд генетически выражаемых флуоресцентных конструкций, в которых донор флуоресцентный белок (mTurquoise) связан с акцептором флуорофора (Венера) короткими длинами контролируемых 5, 17 и 32 аминокислот (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Различные длины линкера между донорными и акцепторными флуорофоров приводят к различной эффективностью и поэтому FRET различными временами жизни доноров. Для того, чтобы обеспечить отрицательный контроль, Венера в короткий 5-амино - линкера кислоты конструкции заменяется Амбера - нефлуоресцентного мутации YFP (mTq5A) , которые не могут выступать в качестве FRET акцептором 38. Мы заменили Лазурная в оригинальных pCXV и pC5A векторов ограничением переваривание VectПРС с NheI и BglII ферментами и лигирования фрагментов mTurquoise переваривали с использованием тех же ферменты из вектора pmTurquoise-N1. Область линкер немодифицированного этой заменой.

На рисунке 6 представлен образец FLIM FRET анализ с использованием этой модели системы , экспрессированный в клетках COS, в котором многоямного пластина выстроенных с 3 столбцами каждой из клеток , трансфецированных с отрицательным контролем (столбцы 1-3), линкер 5-аминокислоты FRET построить (столбцы 4-6), линкер 17-аминокислоты FRET построить (столбцы 7-9) и линкер 32 аминокислоты FRET конструкцию (столбцы 10-12). Ряд H содержит скважины для оценки TVB. На рисунке 6 (а) показаны примеры автоматического приобретенными время жизни флюоресценции , как образы обычных полей зрения в каждой лунке. Очевидно, что в качестве отрицательного контроля (столбцы 1-3) представляют самые длинные сроки службы и что время жизни донора является самым низким для лада построить с кратчайшим линкер ленаGTH (столбцы 4-6). Рисунок 6 (б) показывает , как в среднем по всем ПЗ в каждом среднее время жизни хорошо варьируется в зависимости от многоямного пластины. На рисунках 6 (с) и (d) показывают флуоресценции донора - образцы интенсивности слитый карты продолжительности жизни для FOV из mTq5A и mTq17V соответственно. Рисунок 6 (е) показывает донор флуоресценции профиля затухания интенсивности усредненное по всем клеткам отображенных в хорошо A1, вместе с пригонкой к моноэкспоненциален модели распада и МАФ ( в котором преобладают ГОИ ширины ворот). На рисунке 6 (е) представляет среднее время жизни флуоресценции для каждого столбца многоямного пластины , полученной из пиксельной-накрест моноэкспоненциальный подгонки. Таблица средней продолжительности жизни и стандартное отклонение (STD) можно найти в приведенной ниже таблице 1. Сбор данных для изображений , показанных на рисунке 6 потребовалось приблизительно 160 минут , чтобы приобрести. Анализ взял 92 с на компьютере под управлением 2,6 ГГц с 10 ядрами и 64 гВ оперативной памяти.

Второй образец анализа демонстрирует применение FLIM FRET зачитать олигомеризации ВИЧ-1 Gag при сборке ВИЧ-1 вирионов в качестве средства для тестирования ингибиторов этого процесса 25,42. Выражая ВИЧ-1 Gag в соответствующих клетках-хозяевах обеспечивает модельную систему для этой стадии жизненного цикла ВИЧ-1, так как это приводит к образованию вирусных частиц (VLPs), которые похожи на незрелых ВИЧ-1 вирионов. Для этого теста мы выразили ВИЧ-1 Gag белок слит с СФП в клетках HeLa и сравнивали действие различных ингибиторов посредством их влияния на FRET сигнал, что в результате олигомеризации Gag. Подробная информация о ингибиторов, используемых предусмотрены в 42.

Детали подготовки образцов и экспериментальных измерений описаны комплексно в работе 25, где мы показали, что мы могли бы использовать FLIM зачитать бого heteroFRET между агрегирование Gag белки меченых стохастически с CFP и YFP, а также homoFRET в клетках, экспрессирующих только Gag, меченного CFP. Хотя homoFRET обычно не представляют изменение времени жизни донора, он делает для специального случая CFP где флуорофор существует в двух изомеров с различными средними флуоресцентных времен жизни 40,41. КФП гомо ладов считывания имеет преимущества упрощенной подготовки проб по сравнению с CFP / YFP гетероатомом ладов и является более спектрально эффективной, что может быть важно для мультиплексных FRET считываний.

Наша предыдущая работа применяется FLIM FRET для анализа кляп олигомеризации в присутствии N-myristoyltransferase (NMT) ингибитор 42. Этот ингибитор разрушает эндогенные ферменты , ответственные за добавление миристиновой кислоты к Gag, что позволяет Gag белки связываться с плазматической мембраной и является предпосылкой 43 в формировании вирионов ВИЧ илиVLPs. Мы показали, что оба heteroFRET и homoFRET может достичь показания г '> 0,6 в исследованиях доза-ответ с ингибитором NMT. Z 'представляет собой параметр , используемый в фармацевтической промышленности для определения качества твердофазного иммуноферментного анализа и представляет различия в средних значениях положительных и отрицательных контролей и их относительные спредов для генерации одного значения метрики качества для анализа - с Z'> 0,5 рассматривается "отлично" для фармацевтического анализа 44. Отметим, что это отличная производительность была достигнута с образцами, для которых изменение среднего времени жизни донора была порядка 300 пс - демонстрируя статистическую мощность анализа данных FLIM для большого числа клеток, что позволяет полезные отсчеты быть реализованы с использованием гораздо меньше изменения в жизни флуоресценции, чем это возможно с типичными количества клеток отображенных в ручном экспериментах микроскопии.

Здесь мы представляем многоямного пластина FLIM FRET набор данных сравнения 4 ингибитора соединений для ВИЧ Gag олигомеризации (обозначенный ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). Для этого эксперимента мы использовали homoFRET считывания с клетками HeLa, трансфицированных скоротечно плазмиды Затычка-CFP. В общей сложности девять различных доз каждого ингибитора были применены в соответствии со стандартным протоколом, изложенным в ссылке 32, позволяя двум повторных лунок каждое условие. В качестве положительного контроля, колонка 1 представляет клетки, экспрессирующие Миэр-Gag, мутантный белок Gag, в которых отсутствует фрагмент миристиновой кислоты, которые не могут образовывать VLPs и поэтому симулирует полное торможение. Отрицательный контроль был обеспечен дозирующих клеток, экспрессирующих Gag-CFP только с только транспортное средство, используемое для доставки ингибиторов в других столбцах (колонка 11). В общей сложности восемь FOV были приобретены на лунку.

Данные были установлены с одной экспоненциальной модели распада на основе пиксель за пикселем и времени жизни флуоресценции Platе карта , показывающая среднюю продолжительность жизни на лунку (по всем пикселей выше порога интенсивности по восьми полей зрения) показан ниже на рисунке 7 (а). На рисунке 7 (б) показывает соответствующий график времени жизни флуоресценции в зависимости от концентрации ингибитора. Три из ингибиторов показывают тормозящее действие (ICL13, ICL15 & ICL16) при инкубации с клетками, экспрессирующими Gag-CFP. Один ингибитор (ICL14) не проявляет никакого эффекта в любой испытанной дозе. Z ', вычисленная для этой пластинки была 0,51. Значения , полученные для положительного и отрицательного контролей показаны на рисунке 7 (б) в качестве точки в черном при 100 мкМ и 0,1 нМ.

Кривые доза - ответ для ICL13, ICL15 и ICL16 , показанные на рисунке 7 (б) , а затем были установлены на 4 - параметрической логистической модели нелинейной регрессии с коэффициентом Хилла , прикрепленного к 1 45 с максимальным и минимальным временем жизни , прикрепленной кЗначения, полученные от положительного (колонка 1) и отрицательной (колонка 11) контролирует соответственно. Возвращаемые значения IC 50 для трех кривых были тогда: 38 нм, 24 нм и 116 нм для ICL13, ICL15 и ICL16 соответственно. Для сравнения с 50 значениями IC , полученных через внутриклеточных FLIM FRET измерений, мы определили , IC 50 для ингибирования ферментативной активности рекомбинантного человеческого NMT1 в нашем ранее сообщалось биохимическом анализе фермента 42. Три соединения , найденные быть активными по FLIM FRET также являются наиболее активными в этом тесте (IC 50 значения 17 нМ, 51 нМ и 39 нМ для ICL13, ICL15 и ICL16 соответственно), с ICL14, который не показал никакого существенного ответа в анализе FLIM FRET, будучи около 100 раз менее активен в отношении NMT1 (IC 50 1700 нМ). Для активных соединений, значения IC 50 , полученные с помощью этих независимых методов анализа удивительно похожи, с незначительными изменениями , вероятно , относящихся к differences в поглощении или метаболизма соединения в клетках.

Это небольшое исследование подчеркивает способность FLIM HCA различать эффективность различных соединений, которые действуют на той же самой цели, представляющей интерес. Мы считаем, что это первая демонстрация экрана с помощью автоматизированной FLIM в контексте высокого содержания для создания нескольких кривых доза-ответ, и иллюстрирует потенциал для FLIM, наносимая на экране и / или характеризуют полезные терапевтические соединения.

Третий эксперимент FLIM образец FRET относится к генетически выраженной FRET биосенсор для белкового обмена, активированного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ (ЕПАК)), которая является Rap-1 гуанин фактор обмена, который специфически связывается с цАМФ. Это EPAC FRET биосенсор (EPAC-S H188) использует mTurquoise2 флуоресцентный белок (mTq2FP) в качестве донора флуорофора и включает в себя две Венеры-FP осуществить совместноеmposite акцептора 46. цАМФ является повсеместным второй мессенджер и участвует в многочисленных внутриклеточных процессов на протяжении многих различных организмов. Он синтезируется аденилатциклазы из превращения АТФ в клеточной мембране. Здесь мы демонстрируем нашу способность считывать и количественно оценить его активность в клетках HEK293T живых после добавления форсколина, с адентилатциклазы активатора, который активирует внутриклеточные производство цАМФ и, следовательно, увеличивает его цитоплазматическую концентрацию. Этот датчик EPAC подвергается FRET в его инактивированной (несвязанного) государства и его доноров жизни увеличивается с концентрацией цАМФ как цАМФ приводит к открытию биосенсора. Моно-экспоненциальный профиль распада mTq2FP делает этот биосенсор лучше подходит для количественного анализа продолжительности жизни , чем СФП на основе биосенсоров 45. На рисунке 8 показан пример временного хода , записанного с использованием автоматизированной многоямный пластины FLIM микроскопа , где нанесены измененияв средней продолжительности жизни и изменения доли населения донора FRETing течением времени после добавления 100 мкМ форсколина. Для простоты будем считать, что суммарный сигнал может быть описан с помощью смеси моноэкспоненциален FRETing и не являющихся FRETing доноров и доли населения активированного EPAC FRET биосенсора был получен путем установки двойного экспоненциального профиля затухания по всему временному ряду.

Для получения данных цАМФ (ЕПАК) пять задержек ворот, с шириной затвора 4000 пс, были выбраны с временем задержки, установленного до 1300 пс, 4,300 пс (пик интенсивности), 4,919 пс, 6,656 пс, 8,035 пс, 1, 0391 пс и 16 000 пс. Время интегрирования камеры для каждой задержки составляла 250 мс. На одном хорошо, мы приобрели FLIM тайм-курс с изображений, полученных через каждые 10 секунд в течение 10 мин. Точки данных, полученных при времени 120 с и 130 сек, были удалены, так как добавление форсколина вызвало небольшой сдвиг в фокальной положения образца и из-за этогое интенсивности флуоресценции, записанной во время FLIM приобретения в этих временных точках.

Для анализа данных были загружены изображения в FLIMfit и сегментирован на клетку. Данные жизни флуоресценции был установлен на модели двойной экспоненциального затухания с использованием МАФ и фиксированного T 0 значением , полученным из эталонного красителя (75 мкМ кумарин 6). Флуоресценции донора Средний срок службы в среднем по всем ячейкам показано на рисунке 8 (а). На рисунке 8 (б) показывает изменение доли FRETing популяции с течением времени , рассчитанное путем подгонки же FLIM данные одной и той же модели двойного экспоненциального распада

figure-results-1

где β является донором фракция FRETing. Мы предполагаем, смесь FRETing и не-FRETing ElemeNTS для временных точек перед добавлением форсколина. Для того, чтобы получить эти времена жизни, двойной экспоненциальной форме был применен к первым трех временных точек , дающих времена жизни т 1 = 3964 ± 21 пс для донора , не FRETing, и τ 2 = 3022 ± 27 пс для донора FRETing. Они были установлены для последующей подгонки цельных набора данных для получения значений & beta ; в каждой временной точке.

Таким образом, мы представили результаты FLIM-образцы HCA для трех экспериментальных образцов. Первым был 96-луночный планшет выстроены с клетками Cos, экспрессирующих FRET конструкции, содержащие донор mTqFP связанный либо акцептором Венера FP или нефлуоресцентной Янтарная построить путем изменения длины пептидного линкера. Изменение FRET эффективности и, следовательно, срок службы донора с длиной линкера ясно видно, а стандартное отклонение среднего времени жизни для каждой конструкции была меньше 36 пс. Второй экземпляр ассаY был "экран" из четырех потенциальных ингибиторов для миристоилированию белка ВИЧ Gag, для которого ингибирование% рассчитывали по изменению средней продолжительности жизни флуоресценции донора с концентрацией ингибитора, измеренного в клетках Hela, экспрессирующих белок Gag, меченного CFP. Данное показание основано на homoFRET, который не будет обычно присутствует изменение в жизни донора, но это делает для CFP, так как это существует в нескольких изомеров с различными флуоресцентными жизни. Это может быть полезным с точки зрения спектральной эффективности, например, для мультиплексирования различных FRET считываниями 25. Третий образец для анализа было время, конечно мониторинга живых клеток HEK293T, выражающие биосенсора цАМФ ладу ЕПАК. Это показало , ожидаемый ответ после лечения форсколина и применения FLIMfit с использованием двойной экспоненциальной модели распада с числом обнаруженных фотонов, соизмеримы с изображениями живых клеток - как мы уже показали , с Биосен ВЕСЫ FRETсор для IP3 47.

figure-results-2
Рисунок 1. Схема широкого поля во времени закрытого типа FLIM с использованием закрытого типа оптического усилителя изображения (ГОИ). Левая сторона, показана схема экспериментальной системы. Вверху справа, схематическое изображение импульса возбуждения, положение во времени закрытого типа изображений и моноэкспоненциален подходят к данным. Внизу справа, мультфильм, показывающий затухания флюоресценции от двух объектов, показанных в экспериментальной системе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 2. Схема широкого поля openFLIM-HCA с использованием закрытого типа оптического усилителя изображения (ГОИ). Смотрите основной текст для более подробного описаниясистемные компоненты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 3. Схема оптически секционного openFLIM-HCA с использованием закрытого типа оптического усилителя изображения (ГОИ) с блоком сканера диска Нипкова. См основной текст для более подробного описания компонентов системы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 4. Схема изображения потока данных из программы приобретения Менеджер по Omero сервер или компьютерный диск и в FLIMfit для анализа. Поток данных начинается в верхней л EFT уголок, где данные изображения приобретается в программном обеспечении приобретения μ-Manager. Элементы внутри пунктирного прямоугольника представляют собой этапы анализа данных FLIM, в то время как за пределами соответствуют приобретения и хранения данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 5. Снимок экрана пользовательского интерфейса FLIMfit. Слева вверху, список полей зрения в настоящее время загружены и интенсивность флуоресценции изображение выбранного поля зрения. Внизу слева, выбор модели арматуры и фитингов условий. Вверху справа, затухания флюоресценции для текущей области интереса (синие круги), подходят к данным (красная линия), МАФ (красная пунктирная линия) с отделкой остаткам ниже (синяя линия).g5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 6. многолуночные пластина FLIM модели FRET конструкции mTq5V, mTq17V, mTq32V экспрессируется в клетках Cos. (А) Exemplar жизни флуоресценции изображения FOV в каждую лунку для различных FRET конструкции , выраженные в клетках Cos , как описано в тексте. (Б) тепловая карта средняя флуоресценция жизни Венеры , усредненное по всем клеткам в каждую лунку. (С) интенсивность изображения mTurquoise Amber перекрывается с пожизненной карты (масштаб бар 20 мкм). (D) интенсивность изображения mTurquoise Венеры (17 аминокислот) , облицованная с пожизненной карты (масштаб бар 20 мкм). (Е) измерявшемся затухания интенсивности (синие кружки) из mTq5A построить (отрицательный контроль) флуоресценции , усредненное по всем клеткам отображенных в хорошо1, вместе с подгонки данных к моноэкспоненциален распада (синяя сплошная линия) и МАФ (пунктирная оранжевая линия). (Е) график средней продолжительности жизни , усредненное по каждой колонке через многоямного пластины с погрешностями , показывающие стандартное отклонение времени жизни флуоресценции между полями зрения. Значения времени жизни для (объявления) представлены с использованием ложной цветовой шкалы с указанными пределами в пикосекунд. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-8
Рисунок 7. Exemplar многоямный пластина FLIM экран ингибиторов Gag с использованием клеток HeLa , экспрессирующие Gag-CFP. (А) Тепловая карта среднего времени жизни флуоресценции донора на лунку для многоямного пластины выстроены с колонкой 1 представляющих клеток , трансфицированных MYR-Gag-CFP как Позитив Контроль е для ингибирования, колонка 11 представляющих клеток, трансфицированных Gag-CFP подвергается воздействию транспортного средства только, а пунктирные цветные квадраты, обозначающие скважины, которые были питателем с одним из четырех различных ингибиторов с концентрацией в пределах от высокой колонны дозы 2 к низкой колонке дозы 10 . ложное цветовая гамма представляет собой среднее время жизни флуоресценции в диапазоне от 2,200 до 3,100 пс пс. (Б) участки жизни флюоресценции для каждого ингибитора с Столбики ошибок показывает стандартное отклонение между повторными скважин. Точки в черный на 2 и -4 на горизонтальной оси, соответственно, полученные из колонн 1 и 11, соответственно положительные и отрицательные контрольные точки. Сплошные линии показывают подгонку к кривой данных доза-ответ для различных ингибиторов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

8 цифра "SRC =" / файлы / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
Рисунок 8. Exemplar использование FLIM зачитать биосенсора EPAC FRET в измерении времени покадровой с использованием HEK293T клеток. Изменение в пунктах (а) означает , время жизни флюоресценции , и (б) фракцию FRETing донора в зависимости от времени после добавления форсколина , обозначенную зеленой панели. Столбики ошибок показывают стандартную ошибку на ячейку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

на лунку STD ERR на лунку STD ERR
mT5A 4008 32 12 MT17В 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11

Таблица 1. Среднее время жизни и стандартное отклонение (STD) лада конструкций.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали автоматизированную Multiwell пластину микроскопа, предназначенный для ГКА с использованием времени закрытого типа FLIM. Этот прибор управляется с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом , написанный на μManager с возможностью сохранения данных на сервер Omero и анализа данных FLIM реализуемую с помощью FLIMfit 36, с открытым исходным кодом программы , написанной на MatLab и доступный в качестве клиента Omero 32 μManager инструмент Управляющее программное обеспечение, openFLIM-HCA, доступен в Интернете 33 со списком компонентов системы 48 , чтобы дать возможность академических исследователей строить свои собственные FLIM HCA инструменты.

Для того чтобы получить надежные данные FLIM, необходимо оптимизировать настройки приобретения ГОИ и CCD и принимать во внимание любые вариации в т 0. Как описано в разделе 3.8.2, ГОИ установка усиления и CCD камеры времени интегрирования должна быть установлена, чтобы достичь ~ 75% от CCD динамического диапазона. Uпеть более высокое напряжение ГОИ и множественные накопления ПЗС кадра в каждом времени задержки затвора увеличивает соотношение сигнал - шум 49 , но это увеличивает общее время захвата FLIM (так как меньше фотонов флуоресценции, приобретенные за кадр перед насыщается CCD камеры и поэтому количество скоплениями кадров должны быть увеличены) и поэтому этот компромисс должен решаться для каждого эксперимента. Калибровка генератора задержки зависит от скорости лазерного повторения и, следовательно, необходимо, чтобы гарантировать, что правильный файл калибровки для частоты повторения, используемого загружается в программное обеспечение сбора данных. Процедура калибровки коробки задержки можно найти на openFLIM-HCA вики 33.

Если сотовый аутофлуоресценция мала по сравнению с сигналом флуоресценции, мы используем сигнал из хорошо, содержащей только питательную среду для обеспечения изменяющегося во времени фона (TVB). Для того, чтобы свести к минимуму фоновой флуоресценции из клеточной культуральной среды, мы избегаемносителей, содержащих фенол красный. Если сотовый аутофлуоресценция значительна, то TVB может быть получена из измерений немеченых клеток. Тем не менее, в этом случае необходимо позаботиться о том, как это предполагает, что фон аутофлуоресценция является одинаковым для каждого пиксела в изображении. Это предположение не будет действительным, если аутофлуоресценция значительно варьируется в зависимости от ячейки или, если луч возбуждения или чувствительность обнаружения не является равномерным по полю зрения.

Приобретение изображения IRF с использованием рассеянного света возбуждения импульсов обеспечивает временной профиль IRF, который свернут с моделью данных в процессе подбора, а также обеспечивает отображение пространственного изменения МАФ по полю зрения. МАФ может быть измерена с помощью построения изображения рассеивающего образца, такие как коллоидная суспензия, хотя, в нашем приборе, с использованием возбуждения рассеивание света с диска Нипкова обеспечивает более чистое измерение IRF. Точное определение сроков выводае МАФ имеет важное значение, так как ошибки в временной задержки между возбуждением и времени стробирования может существенно повлиять на процесс подбора, особенно при монтаже сложных моделей экспоненциального распада. МАФ, приобретенный с помощью рассеянного света возбуждения не точно, что необходимо для процесса подгонки, так как он был записан при длине волны возбуждения, а не на длине волны излучения флуоресценции, что может повлиять на ее сроки, несмотря на то пространственные вариации МАФ должны быть одинаковыми на обеих длинах волн. Кроме того, рассеянный МАФ может быть глобально сдвинуты во времени по отношению к истинному IRF из-за отличающимися длиной оптического пути от рассеивающего объекта, как это имеет место для IRF приобретенного с диска Нипкова в оптически секционного FLIM. Эта поправка, т 0, что требуемое глобальное временной сдвиг , который должен быть применен к приобретаемой рассеянного света возбуждения IRF, рассчитывается по данным моноэкспоненциален ссылка на красителях , как указано в Protocшаг ол 4.4. Следующие красители могут быть использованы для различных длин волн возбуждения: 75 мкМ Кумарин 153 раствор в метаноле (τ ~ 4,3 нс 50) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 295-442 нм; 6 раствор 75 мкМ Кумарин в этаноле (т ~ 2,43 нс 37) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 430-500 нм; и 75 мкМ родамина В раствор в воде (т ~ 1,7 нс 37) может быть использовано для возбуждения в диапазоне 488-575 нм. Заметим , что, хотя возможно в FLIMfit использовать различные IRF для каждого пикселя системы, как правило , имеет смысл сделать предположение о том , что пространственно различной МАФ имеет тот же временной профиль для каждого пикселя в изображении , но представляет ряд пространственно изменчивостью временных смещений относительно глобального T 0. Мы описываем это как карта сдвига IRF, которая определяется из рассеянного света МАФ. Вместе профиль МАФ, т 0 и отображение IRF сдвига используются для ваннойУбедитесь, что каждый пиксель в FOV оснащен соответствующим МАФ. Важно отметить, что т 0 может медленно меняться с течением времени , поэтому она должна быть измерена перед любым приобретением FLIM данных.

Пользователь должен решить, как образец профили затухания флюоресценции и требуется установить ширину временных ворот и их относительные задержки после возбуждения. В общем, желательно использовать большую ширину ворот, чтобы максимизировать обнаруженный сигнал и, как правило, мы используем воротных ширины установлено в 4 нс для FLIM клеток, меченных флуоресцентными белками. Число временных задержек затвором должно быть достаточным, чтобы образец флуоресцентного профиль распада (в том числе одни ворота набор для измерения сигнала непосредственно перед импульсом возбуждения) с учетом сложности подгонки модели, которая будет использоваться в анализе. Оптимальное значение может зависеть от времени жизни и относительных амплитуд составляющих распада. В общем, 4 ворот достаточно для подгонки моноэкспоненциален распадов в то время как 7 или более ворота могутбыть использованы для более сложных моделей распада.

Заметим , что FLIM могут быть реализованы с использованием целого ряда методов во временной области или частотной области и автоматизированных FLIM HCA из луночные массивов пластин впервые была реализована в (без секционирования) широкого поля микроскопа с использованием прижизненные частотной области отсчеты из FRET 51. Первый автоматизированный оптический секционирования FLIM считыватель многоямный пластина для ГКА с использованием широкого поля во времени закрытого типа изображений 28 затем сообщается. Впоследствии, широкого поля (не секционирования) частотной области FLIM HCA был применен для скрининга на пост трансляционных модификаций (фосфорилирование тирозина) через библиотеки генов с использованием FRET 52 и времени закрытого FLIM HCA был применен к FRET анализы на ВИЧ-1 Gag олигомеризации 53 и SUMOylation из FOXM1 54 и из Raichu RhoA и RAC1 биосенсоров 33. Кроме того , можно использовать для TCSPC многоямного пластины FLIM 26 , но на сегодняшний день это оказалось сложной задачей , чтобы соответствовать Tон пропускной способности методов обнаружения эксплуататорских широкого поля. Одной из новых подход , который мог бы решить эту проблему , является использование массивов одиночных детекторов подсчета фотонов , таких как SPAD массивы 55.

Заметим , что любые показания из FRET с использованием флуоресцентных белков следует относиться с осторожностью и что абсолютные значения параметров , полученных из FLIMfit или любого другого программного обеспечения для анализа FLIM будет зависеть от предположений , связанных с фитинга моделью. Например, когда донор FRET, имеет значительную второй компонент распада, использование биэкспоненциальному модели, чтобы соответствовать данным FRET FLIM может привести к вкладу быстрее распада компонента, как правило, связанной с населением FRETing появляться выше, чем должен. Поэтому желательно использовать доноров с монофонической экспоненциальный жизни, таких как mTq2FP. Даже тогда, недавние исследования показали, что анализ FRET все еще могут быть затронуты темные состояния акцептора флуоресцентных белков или путемНеоднородность коэффициента ориентации х 2 в связи с распределением флуорофора конформаций с различными углами хромофора и расстояния 56. Тем не менее, мы и другие показали, что время жизни флуоресценции от FRET показания действительно производят полезные результаты, которые коррелируют с биохимическими измерений и могут быть использованы для скрининга белковых взаимодействий или следовать динамике биосенсоров. Таким образом , эта openFLIM HCA платформа может быть применена к широкому кругу жизни флюоресценции на основе анализов с использованием FRET или клеточного аутофлюоресценция 8, а также предоставление количественных отсчеты на основе красителя зондов 25.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность за финансирование от Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук Соединенного Королевства (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 и BB/M006786/1), Совета по технологической стратегии Великобритании (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, в партнерстве с AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) и Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG признает стипендию аспиранта Совета по исследованиям в области инженерных и физических наук Великобритании (EPSRC). DA, DK и SW признают стипендии аспирантов Центра подготовки докторантов Института химической биологии, финансируемого EPSRC.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
рамка для микроскопаOlympusIX81http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
оптический автофокусOlympusZDChttp://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
моторизованный (x-y-z) предметный столик для микроскопаMarzhauser00-24-565-0000Столик с Corvus управляющим
возбуждением лазерным источникомFianiumSC400-4Суперконтинуумный лазер http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
стробированный оптический усилитель KentechHigh Rate Imager (HRI)
генераторы задержкиKentech---Смотрите гибкий генератор задержки и прецизионный генератор задержки
камераHamamatsuORCA-ER-II
Nipkow дисковый сканер YokogawaCSU-X1 http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Цилиндровый диффузорThorlabsED1-S20-MDИнженерные диффузоры
mTq5V Oxford GeneticsP3850mTurquoise Venus конструкт с 5 аминокислотами линкером
mTq17VOxford GeneticsP3847mTurquoise Venus конструкт с 17 аминокислотами линкером
mTq32VOxford GeneticsP3848mTurquoise Venus конструкт с 32 аминокислотами линкером
mTq5AOxford GeneticsP3849mTurquoise Amber конструкт
HEK293T------Тип клеток используемый
фенол без красных HBSSSigma Aldrich55021C-1000MLсреды для визуализации
культуральных средDMEM + 10% FBS + 0,5% антибиотики
DMEMSigma AldrichD6046-500MLдля культуральных сред
FBSSigma Aldrich12003C-500MLдля культуральных сред
xTremeGene9Sigma Aldrich6.37E+09для трансфекции следуйте онлайн-протоколу от La
Roche trypsin/EDTA SolutionThermo FischerR001100для отделения клеток, следуйте онлайн-протоколу от Thermo Fischer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848(2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2(2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231(2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687(2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11(2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204(2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513(2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103(2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAutomated Multiwell PlateOpen Source SoftwareFRET BiosensorsProtein OligomerizationFLIM AnalysisInstrument Response FunctionReference Die DataFLIMfit SoftwareHIV Gag Protein

Related Articles