Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вскрытие Личинки данио гонадная ткани

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

26 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол для выделения гонад ткани личиночного данио, что облегчит исследования данио половой дифференциации и обслуживание.

Аннотация

Хотя дикие данио обладают / ZW определением пола ZZ, одомашненные данио потеряли половую хромосому. Они используют полигенную систему определения пола, где несколько генов, распределенных по всему геному совместно определяют половые тождества отдельных рыб. В настоящее время гены участвуют в регуляции развития гонад и как они работают остаются неуловимыми. Как правило, выделение гонадной ткани является первым шагом изучить половые процессы развития. Здесь мы представляем процедуру, чтобы изолировать гонады ткани от 17 дения (дней после оплодотворения) и 25 DPF данио личинок. Изолированная гонадная ткань может быть затем изучена с помощью морфологии и экспрессии генов профилирования.

Введение

Основным фактором , определяющим женского пола в диком данио хромосоме 4 теряется или изменяется в одомашненных данио (например , общие штаммы лаборатории) 1. Вместо этого они имеют полигенную систему определения пола сопровождается экологическими факторами, такие как температура, гипоксия, наличие пищи и плотность населения. Детальные механизмы развития данио пола до конца не изучены. Фундаментальные вопросы , такие как , когда происходит данио определение пола, что основной сигнал определения пола (ы) является / являются, и какие гены регулируют первый шаг преобразования гонад остаются не заполнено 2, 3.

В процессе развития данио пола, несколько важных этапов были признаны. На ранней стадии развития, начиная с 4 часов после оплодотворения (ч после оплодотворения) эмбриональные-клетки (ПКА) претерпевают спецификации, переход к генитальному хребту ипролиферация. PGC число и взаимные взаимодействия между зародышевыми клетками и соматическими клетками имеют важное значение для дифференциации гонад 4. В 13 денье (дней после оплодотворения), гонады находятся в недифференцированной стадии. К 17 денье, гонады развиваются в два раза потенциальных яичников у обоих будущих самок и самцов. Апоптоз-зависимый переход от яичника к семеннику начинается с 21 до 25 дения и может продолжаться в течение нескольких недель. К 35 денье, пол гонады была определена и секс конкретного производства гамет ведется в обоих яичников и семенников 5, 6, 7.

На сегодняшний день, были предложены различные гены и механизмы определения пола кандидатов. Протеомика и анализ транскриптомного выделили множество генов с половым диморфизмом экспрессией и эти гены были использованы для изучения половой дифференциации в данио 8, 9, 10. Например, в личиночной данио, ген cyp19a1a специфически экспрессируется в яичниках , но не в семенниках 11, 12. Кроме того, ген АМГА слабо выражен в овариальных фолликулах зернистых клеток, но сильно в клетках Сертоли семенников 13. В противоположность этому , ген васа непрерывно выражается в зародышевых клетках как женского и мужского данио, что делает его подходящим маркером гонад 14, 15.

Исследование гонадных уровней экспрессии генов важно понять молекулярный механизм определения пола и дифференциации , особенно в би-потенциал яичников стадии 3, 9. Однако небольшой размер личиночной данио и, соответственно, мелких гонад осложнить изоляцию gonadaл ткани для дальнейшего молекулярного анализа. Предыдущие исследования использовали расчлененные весь регион магистрального между opercula и анальной порой 16. Этот препарат, хотя, содержащие гонады, состоит из нескольких тканей и органов. Альтернативно, трансгенные животные с выражением GFP гонад специфические , такие как Vasa: были использованы EGFP для изоляции гонадной ткани с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и лазерного захвата микро-рассечение 17, 18. Но их широкое применение ограничено. Здесь мы опишем простую процедуру, чтобы изолировать гонад ткани от личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Мы демонстрируем позицию гонад по отношению к другим органам и изолировать морфологический интактные гонады от окружающих тканей. Мы также показываем , гонады специфических генов , такие как Vasa и cyp19a1a высоко выражены в изолированных гонадах по сравнению с магистральной тканью через количественный ПЦР (КПЦР) анализа. Настоящий протокол позволяет идентификации, выделения, очистки РНК и амплификации специфических генов гонад из личиночной данио, тем самым позволяя последующего молекулярного анализа гонадной ткани 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты рыбок данио утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Fudan Университетской. Рерио были подняты и разводят в соответствии со стандартными процедурами 20.

1. Подготовка

  1. Выращивают 17 DPF и 25 DPF личиночной данио
    1. Передача 2 мужчин и 2 взрослые женщины данио (здоровые, от 3 до 6 месяцев, лаборатория Аб Стрейн) в резервуар пересечения во второй половине дня до дня пересечения. Отдельные самцы и самки с барьером. На следующее утро, обновить резервуар для воды и удалить барьер, чтобы дать им возможность спариваться. Сбор яиц в 100 Мм Петри Петри 1 до 2 ч после оплодотворения.
    2. Хранить около 40 эмбрионов в 100 мм пластины с 40 мл среды эмбриона (ЭМ) при 28,5 ° C в течение раннего периода развития (4 дня) и обновить EM два раза в день. Передача личинок в 1 л танков (40 личинок в 300 мл воды в системе) и кормить с живыми коловраток (полный питания, два раза в день) после того, как 5 денье.Поток живой артемии вместо коловратки диеты после 10 дения. Перенести рыбу в рециркуляции воды системы в 14 денье , 21.
    3. Повысить личиночный данио~d в рециркуляции водной системы до 17 дения или 25 дения. Убедитесь, что цикл свет / темнота в 14/10 ч и рН значение системы воды составляет около 7,2. Измерьте длину тела 17 дения ( от 5,5 до 6,8 мм) и 25 дения ( от 8 до 11 мм) 22 личинок.
  2. Приготовьте 2% агар для рассечения.
    1. Добавить 4 г агара к 200 мл стерильной воды. Смесь нагревают в микроволновой печи, пока он не станет прозрачным.
    2. Охлаждают раствор агара в течение приблизительно 15 мин, а затем залить его в 60 мм в диаметре чашки Петри (приблизительно 1/3 объема пластины). Хранить затвердевший агар при температуре 4 ° С.

2. Протокол 1: Рассеките гонадные ткани 17 и 25 DPF Личинки

  1. Добавить измельченный лед в бак обезболить 17 личинок DPF. Передачаанестезировали личинки до 100 мм охлажденных чашек Петри с раствором 30 мл охлажденного Рингера. Хранить рыбу инкубировали в растворе охлажденного Рингера в течение по крайней мере 15 минут, чтобы полностью обезболить личинки.
  2. Передача личинок к предварительно охлажденной агаровой пластине с небольшой пластиковой ложкой. Погрузите все тело рыбы в 10 мл охлажденный раствор Рингера и аккуратно положите его на бок.
  3. Выполните следующие действия в соответствии с видением поля 25X стерео микроскопа. Закрепить ствол рыбы с помощью пинцета для стабилизации. Rip брюшка в продольном направлении от заднего прохода к сердцу с другим пинцетом. Аккуратно снимите кожу и мышцы на одной стороне тела, чтобы выставить внутренние органы.
  4. Снимите массу органов вентральных в плавательном пузыре тщательно. Избегайте повреждение гонады, прикрепленную к плавательному пузырю.
  5. Отрезать связь между плавательным пузырем и передней тела. Вытянуть весь плавательный пузырь и гонады ткани мягко.
    Примечание: В большинстве случаевс, гонадная ткань в 17 дении содержит окружающую эпителиальную ткань и protonephridium. Они не легко отделяются друг от друга, но в 25 денье, он может быть легко отделена. Гонад также подключен к анусу. Сочленение с левой и правой гонады соединены друг с другом на заднем проходе будет отчетливо виден.
  6. Используйте пинцет, чтобы аккуратно отделить гонады ткани от плавательного пузыря и очистить окружающие ткани жировой ткани.
  7. Сразу передачи выделенной гонадной ткани на prechilled 1,5 мл центрифужной пробирки, содержащей 200 мкл раствором Рингера. Держите трубку на льду, пока все гонад ткани не отделяются от личинок.
  8. Проанализируйте гонадах 25 DPF личинок, как описано в пунктах 2.1 - 2.7.

3. Протокол 2: Анализ экспрессии генов обособленных гонадных ТКАНЕЙ

  1. Экстракт тотальной РНК из личиночных тканей гонад.
    1. Передача изолированных гонадных тканей к новому РНКазы 1.5 мл трубки и удалить раствор Рингера. Добавьте 100 мкл раствора для лизиса. Вихревой до тканей полностью лизированы.
    2. Выполните полную процедуру экстракции РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Добавить 1/10 объема 10х ДНКазы I буфера и 1 мкл ДНКазы I к решению РНК и осторожно перемешать. Инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С.
    4. Добавьте 1/10 объема реагента ДНКазы инактивации в растворе РНК. Инкубируют в течение 10 мин при 70 ° С. Измерение концентрации общей РНК с использованием спектрофотометра. Хранить при -20 ° C.
  2. Выполнение первой цепи синтеза кДНК
    1. Используйте олиго (дТ) линкер праймера для выполнения первой цепи кДНК синтеза в соответствии с протоколом изготовления. Добавить 1 до 2 мкг РНК до общего объема реакционной до 20 мкл.
    2. Инкубируйте реакционный раствор в течение 90 мин при 45 ° C. Завершение реакции при нагревании при температуре 70 ° С в течение 5 мин.
    3. Добавить 1 мкл РНКазы H в кДНК такlution для удаления остатков РНК. Осторожно перемешать и центрифугировать в течение 10 с при ~ 13000 х г. Инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С. Добавьте 20 мкл нуклеазы свободной воды. Хранить при температуре -70 ° С.
  3. Выполните флуоресцентный количественный ПЦР
    1. Выполните КПЦР в системе ЦИКЛОВАТЕЛЯ с флуоресцентным красителем. Используйте следующие ПЦР условия велосипедного: 35 циклов при 95 ° С в течение 15 с, Tm-5 ° C в течение 15 с, 68 ° С в течение 30 с. С помощью праймеров последовательностей следующим образом : АМГ (Fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; REV: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (Fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (вперед: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), васа (вперед: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) и β-актина (вперед: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рассечений гонад были выполнены на Аб Стрейн личиночной данио. На рисунке 1 показана типичная гонадной ткани личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Во-первых, кожа и мышцы одной стороны живота разрезают, чтобы обнажить внутренние органы. После удаления массы внутренних органов, плавательный пузырь вместе с гонадой остается в багажнике. Гонад был прикреплен к брюшной стороне плавательного пузыря (стрелка на рисунке 1В &#...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данио стал мощной моделью и широко используется в разработках и исследовании заболеваний, связанные с. Методы выделения органов у взрослых данио , таких как мозг, сердце, гонады и почки, были хорошо документированы 23, 24, 25. Из-за небольшого размера и динамического ремоделирование тканей гонад в личиночной данио, выделение гонадной ткани является сложной задачей. Предыдущие исследования использовали целые рассеченные ткани ту...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим C Zhang для ухода рыбы. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31171074, 31371099 и 31571067 ГПА) и Таланты проект Пуцзяна (09PJ1401900 по ГПУ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка для клеточных культур 100 ммCorning430167Для инкубации эмбрионов
20x EMНа 1 л необходимо: добавить 17,5 г NaCl, 0,75 г KCl и 2,9 г CaCl· 2H2O; затем добавить 0,41 г KH2PO4, 0,412 г Na2HPO4 безводный и 4,9 г MgSO4· 7H2O.
1x ЭМРазвести 20х ЭМ в дистиллированной воде
АГАРОЗА G-10Ген121985Для приготовления пластин 2% агара
Тризол РеагентИнвитроген15596-026Для выделения РНК
Измеритель стеклоШен Бо250 млДля приготовления пластин 2% агара
Микроволновая печьMideaM1-211AДля нагрева АГАР
Пинцет DUMONT#5INOXWorld PrecisionInstrument 500341Для вскрытия
СтереомикроскопMoticSMZ168Для
вскрытия Оборудование для чистой водыMillipore
Ringer' На 1 л необходимо: добавить 6,78 г NaCl, 0,22 г KCl, 0,26 г CaCl2 и 1,19 г Hepes; затем залить до 1 л; Отрегулируйте pH до 7,2. Стерилизуйте с помощью фильтрации и храните в автоклавном контейнере из прозрачного поликарбоната.
Переводной пипеткаSamco202, 204
Металлическая ваннаQiLinbeierМодель GL-150
МикроскопLeica M205 FAДля микрофотографии
ЦентрифугаEppendorf5417R
Набор для выделения микромасштабных РНКAmbionAM1931Для выделения РНК из тканей половых желез
Dnase ISigmaAMPD1-1KTДля расщепления ДНК в растворе РНК
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Scientific#K1631Для синтеза кДНК первой нити
Rnase HThermo Scientific#EN0202Для расщепления остаточной РНК в растворе кДНК.
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201Этот продукт представляет собой мастер-смесь на основе ДНК-полимеразы Taq 2x для ПЦР в реальном времени и  применима для интеркаляционного анализа с SYBR Green I.
СпектрофотометрNe DropOD-2000+Измерение концентрации общей РНК
MastercyclerEppendorfAG 22331 Гамбургпрофилирование экспрессии генов

Ссылки

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Вскрытие Личинки данио гонадная ткани
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.