Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Данное исследование представляет методологию для подготовки 3D, биоразлагаемый, пенообразный каркасы клеточного на основе биосовместимых жидкокристаллических эластомеров боковой цепи (LCEs). Конфокальные микроскопия эксперименты показывают, что пенообразный LCEs позволяет прикрепление клеток, пролиферации и спонтанного выравниванию C2C12s миобластов.

Abstract

Здесь мы представляем шаг за шагом подготовку 3D, биоразлагаемых, пенообразные клетки строительных лесов. Эти каркасы были получены путем поперечного сшивания звезд блок-сополимеров, показывающие единицы холестерина в боковой цепи боковых групп, в результате чего смектической-А (СМА) жидкокристаллических эластомеров (LCEs). Пенообразный каркасы, подготовленный с использованием шаблонов металлов, имеет взаимосвязанные микроканалы, что делает их пригодными в качестве 3D-клеточной культура каркасов. Объединенные свойства обычной структуры металлической пены и в результате эластомера в клеточном помосте 3D , что способствует не только более высокой пролиферации клеток по сравнению с обычными пористыми шаблонными фильмами, но и более эффективным управлением переносом массы (то есть, питательными веществами, газов, отходы и т.д.). Природа шаблона металла позволяет легко манипулировать пены форм (т.е. рулонов или пленки) , а также для подготовки каркасов различных размеров пор для различных исследований клеток при сохранении interconnecTed пористая природа шаблона. Процесс травления не влияет на химический состав эластомеров, с сохранением их биологически совместимая и биологически разлагаемой природы. Показано, что эти Смектические LCEs при выращивании в течение длительного периода времени, времени, позволит исследование клинически значимых и сложных конструкций ткани, содействуя росту и пролиферации клеток.

Introduction

Есть несколько примеров биосовместимых биологических и синтетических материалов , предназначенных для применения в исследованиях клеток и для регенерации ткани , направленной на прикрепление клеток и пролиферации ^{1, 2, 3, 4, 5.} Там было несколько примеров биосовместимых материалов, известных как жидкокристаллические эластомеры (LCEs), которые могли бы реагировать на внешние раздражители с анизотропной молекулярным упорядочением ^{6, 7.} LCEs являются стимулы-чувствительных материалами , которые сочетают в себе механические и эластичные свойства эластомеров с оптической функциональностью и молекулярным упорядочением жидких кристаллов ^{8, 9.} LCEs может испытывать изменения в форме, механическую деформацию, упругое поведение и оптические свойства в ответ на внешние ститулы (то есть., жара, стресс, свет и т.д.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Более ранние исследования показали , что жидкие кристаллы (ЖК) может ощутить рост и ориентацию клеток ^{4, 17.} Можно тогда предположить, что LCEs может быть пригоден для биологических и медицинских соответствующих приложений, включая клетку леса и выравнивание. Ранее мы уже сообщали о подготовке смектических биосовместимые, биодеградируемые, литье под давлением, и тонкие LCEs фильмов с участием в «типа швейцарского сыра» пористый морфологию ^{6, 18.} Мы также подготовили нематические биосовместимые LCEs с глобулярной морфологией , как каркасы для роста клеток ¹⁹ <SUP> ^20. Наша работа была направлена на настройку механических свойств материалов , чтобы они соответствовали интересующей ткани ^21. Кроме того, эти исследования сосредоточены на понимании эластомер-клеточных взаимодействий, а также клеточный ответ, когда эластомеры подвергается воздействию внешних раздражителей.

Основные проблемы были частично адаптировать пористость LCEs, чтобы обеспечить прикрепление клеток и проникновение через матрицу эластомера и для лучшего переноса массы. Пористость этих тонких пленок ⁶ позволила клеточной проницаемости через объем матрицы, но не все поры были полностью соединены между собой или имели более регулярные (однородный) размер пор. Затем мы сообщили о биосовместимых нематико LCE эластомеры с шаровыми морфологией. Эти нематических эластомеры разрешены для прикрепления и пролиферации клеток, но размер пор в диапазоне от 10-30 только мкм, что помешало или ограничить использование этихэластомеры с более широким разнообразием клеточных линий ^{19, 20.}

Предыдущая работа Кунг и др. связанные с формированием графеновых пен с использованием «жертвенную» шаблон металла показал , что полученный графен пена имела очень регулярный пористой морфологии , диктуемой выбранного шаблона ²² металла. Эта методика обеспечивает полный контроль пористости и размера пор. В то же время, пластичность и гибкость шаблона металла позволяют формирование другого шаблона формы перед приготовлением пены. Другие методы, такие как материал выщелачивание ^23, газ шаблоны ²⁴ или электрооптического прядением волокон ^{25, 26} также обеспечивают потенциал для получения пористых материалов, но они больше времени, и, в некоторых случаях, размер пор ограничен лишь несколько микрометров. пена-как 3D LCEs готовили с использованием шаблонов металлов позволяют более высокую нагрузку клеток; улучшенная скорость пролиферации; совместное культивирование; и, наконец , но не в последнюю очередь, лучше массовое управление транспортом (то есть, питательные вещества, газы и отходы) , чтобы обеспечить развитие полной ткани ^27. Пенообразный 3D LCEs также появляется, чтобы улучшить выравнивание клеток; это, скорее всего по отношению к LC подвескам зондирования роста клеток и ориентации клеток. Наличие LC остатки в пределах LCE появляется для улучшения выравнивания клеток относительно расположения клеток внутри LCE строительных лесов. Клетки выравнивания в пределах распорок в LCE, в то время как нет четкой ориентации не наблюдаются , где распорки объединяются (переходы) ^27.

В целом, наша LCE клетки подмости платформа в качестве опорной ячейки среды открывает новые возможности для настройки морфологии эластомера и упругих свойства и конкретно направлять выравнивание (индивидуальные) типов клеток для создания нумерованных, пространственные расположений оF клетки, похожие на живые системы. Помимо обеспечения лески, способной выдержать и направляя долгосрочный клеточный рост и пролиферацию, LCEs также позволяет для динамических экспериментов, в которых ориентация и взаимодействие клеток могут быть изменены на лета.

Protocol

Примечание: Следующие шаги для 3D – LCE пенообразного подготовки с использованием 3-рука звезды блок – сополимера показаны на рисунке 1. Для получения ядерного магнитного резонанса (ЯМР) характеристики, спектры записаны в дейтерированном хлороформе (CDCl 3) при комнатной температуре на 400 МГц приборе Bruker DMX и внутренне ссылки остаточные пики при 7.26. Преобразование Фурье инфракрасного спектра (FT-IR) записывается с использованием Bruker Вектор 33 FT-IR спектрометра с использованием режима нарушенного полного отражения. Для каждого шага следующего протокола, важно носить соответствующую защитную одежду (СИЗО). 1. Синтез альфа-хлор-е-капролактон (Мономер) ( В соответствии с процедурой , описанной в Жером и др. 28) Перед началом синтеза, очистки 27 г 3-хлорпербензойной кислоты следующим образом: В 800 мл дистиллированной воды, добавляют 1,28 г натриямоногидрата одноосновного фосфата и 8,24 г гептагидрата двухосновного фосфата натрия. Доводят рН до 7,4 (с помощью гидроксида натрия или соляной кислоты) и резерв 30 мл этого раствора; это буферный раствор. С помощью делительной воронки, растворите 3-хлорпербензойной кислоты в 35 мл диэтилового эфира. Промывают органический раствор с 10 мл буферного раствора (полученного на стадии 1.1.1.). Повторите промывочные три раза. Добавьте 3 г сульфата натрия непосредственно в органическом растворе; Этот сушильный агент поглощает воду из органического раствора. Фильтр решения, чтобы удалить осушающий агент. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C. Солюбилизации 18,5 г очищенного 3-хлорнадбензойной кислоты в 150 мл сухого дихлорметана при перемешивании в ультразвуковой ванне; Этот процесс обычно занимает 20 мин. Поместите раствор внутри делительной воронки. Внутри два-образного выреза, круглое дно колбы,растворения 13,1 г 2-хлорциклогексанона в 15 мл сухого дихлорметана с помощью магнитной мешалки в атмосфере газообразного азота. Продолжайте размешивать. Установить делительную воронку, содержащую раствор 3-хлорпербензойной кислоты (со стадии 1.2) в двухгорлую колбу на шаге 1.3. Промыть систему с газообразным азотом. Регулировка открытия делительную воронку так, чтобы раствор хлорпербензойной кислоты падает по каплям в раствор 2-хлорциклогексанона (1 капля каждый второй) и продолжают перемешивание смеси при газообразного азота в течение 96 ч. Реакционную смесь охлаждают до -20 ° С в течение 1 ч для осаждения м -chlorobenzoic кислоты (м -CBA) побочный продукт. Фильтр м -chlorobenzoic кислоты (м -CBA) и промыть Оставшийся раствор с насыщенными растворами тиосульфата натрия, бикарбонат натрия и хлорид натрия. Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C. Очищает бледно-желтое вязкое жидкое мылоИдентификатор путем перегонки при пониженном давлении при 2,3 Торр и 96 ° С. Монитор успех синтеза с использованием следующих 1 Н – ЯМР пики. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 4.75-4.68 (м, 1H, C H ClCO), 4.37-4.26 (м, 1Н, С Н 2 О), 4.18-4.05 (м, 1H , С Н 2 О) и 2.06-1.58 (м, 6Н, Н 2 -С -) 6, 27. 2. Синтез α-Три-рука звезда блок – сополимер (СКИ-αCl) с помощью кольца сополимеризации открытия (Шарма и др. 6 и Амсден и др. 29) Перед синтезом, silanize 20-мл ампулу, заполняя его с 2% (об / об) раствора 1Н, 1Н, 2Н, 2Н-perfluorooctyltriethoxysilane в толуоле и перемешивают в течение примерно 24 ч. Полоскание с изопропиловым спиртом и высушить его, поместив его в печи при температуре 140 ° С в течение 30 мин. Добавить 30,64 г дистиллированной -капролактона, 0,5 г α-хлор-е-капролактон, и 0,25 мл глицерина в ампуле. Смешайте использование вихря в течение 1 мин. Добавьте 4,90 г D, L- -lactide к ампуле и продувают его азотом. Поместите ампулу в печи при температуре 120 ° С , чтобы расплавить D, L -lactide; Этот процесс обычно занимает около 2 часов. Смешайте еще раз , используя воронку , чтобы убедиться , что все содержимое тщательно перемешивают и добавляют 66 мкл олова (II) , 2-этилгексаноат (Sn (Oct) 2) в ампуле. Примечание: D, L -lactide будет остывать в течение этого процесса , и необходимо будет повторно нагревают в печи для плавления. Энергично перемешайте в последний раз, используя воронку и промойте азотом. Закройте ампулу с резиновой пробкой. Поместите иглу, соединенный с вакуумной трубкой (дом вакуум обычно достаточно) через резиновую пробку. Включите вакуум и, используя пламя, расплавить длинную шею стекла, не скручивания медленно до гдеваха падает на себя. Будьте осторожны, чтобы не расплавить резиновую пробку. После того, как ампула запаянные, поместить его в песчаной бане, печи, или соответствующий нагревательный элемент при 140 ° С в течение 48 ч. Возьмите ампулу и дайте ему остыть при комнатной температуре. Перерыв ампулу на запечатанной марке и растворяет высоко вязкую жидкость при добавлении 10 мл дихлорметана. Переносят раствор в делительную воронку. Готовит колбу, содержащую 100 мл холодного метанола (охлажденный с помощью сухого льда / ацетоном, при температуре около -78 ° С). Закрепить делительную воронку (этап 2.7), в верхней части колбы. Регулировка открытия делительной воронки так, что около двух капель падают каждые другие вторые (по каплям). Собирают белый осадок путем фильтрации (с помощью бумажного фильтра) и высушить в вакуумной печи между 50 и 60 ° C. Монитор успех синтеза с использованием следующих 1 Н – ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, Δ [м.д.]): 5.29-5.03 (м, КОК Н С Н 3), 4.43-4.25 (м, C H Cl), 4.24-4.12 (м, С Н 2 О), 4.11-4.03 (т, J = 4,6 Гц, С Н 2 О), 3.80-3.68 (м, C H C H 2), 3.09-2.64 (широкий, S, O Н), 2,39 (т, J = 4,5 Гц, α- Н), 2,33 (т, J = 5,1 Гц, α- Н) и 1.77-1.25 (м, С Н 2, С Н 3); ИК-Фурье (1 / λ [см – 1]): две тысячи девятьсот тридцать два (с), 2869 (м), одна тысяча семьсот сорок-одна (с), 961 (с), 866 и 735 (м) 6, 27. Примечание: Для получения более гидрофильный 3D LCE, подготовить линейный блок-сополимер (LBC) вместо SBC, следуя процедуре открытия кольца сополимеризации (ROP), описанной выше. Добавить 0,3 г полиэтиленгликоля (ПЭГ), 3,15 г -капролактона, 1,0 г α-хлор-е-капролактон, и 5,0 г D, L-лактида к силанизированного флакона смеси. </li> 3. Синтетический Модификация альфа-Cl-Три Arm SBC с 3 -три ап Arm SBC (SBC-ап 3) ( В соответствии с Шарма и др. 6) В круглодонную колбу в атмосфере азота, растворяют 5 г SBC-αCl в 30 мл сухого N, N – диметилформамид N». Добавьте 0,22 г азида натрия и позволяют реагировать в течение ночи при комнатной температуре. Внимание: азид натрия токсичен; носить соответствующую защитную одежду (СИЗ). Удалите N, N»диметилформамид при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 11 мбар и 40 ° C. Растворить смесь в 30 мл толуола. Центрифуга раствор трижды при 2800 х г в течение 15 мин, чтобы удалить соль, образованную. Упаривает толуол при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 77 мбар и 40 ° C. Монитор успеха замещения азида с использованием 1 Н – ЯМР и ИК-пиков. ЗАМЕТКА: <sup> 1 Н – ЯМР – спектр был похож на родитель СКИ-αCl, за исключением появления пика при 3,90 м.д. , связанного с группой азида; ИК-Фурье (1 / λ [см -1]): 2928, 2108 (с, азид), 1754 (с), +1450 (с), 960 (м), 865 (с), 733 (с), и 696 (м). 4. Синтез 5-холестерина и Hexynoate (ЖХ общие) ( В соответствии с Шарма и др. 6 и Donaldson и др. 30) В круглодонную колбу, смесь 3 г 5-hexynoic кислоты и 130 мл дихлорметана. Смесь охлаждают до 0 ° С на бане со льдом. В другом круглодонную колбу, смесь 8,28 г N, N – дициклогексилкарбодиимид N», 10,3 г холестерина и 0,2 г 4-диметиламинопиридина. Передача по каплям раствора кислоты 5-hexynoic в колбу, содержащей смесь холестерина и поддерживать конечную смесь при температуре 0 ° С в течение 1 ч. Разрешить смесь нагревали до комнатной температуры в течение ночи. </li> Удалить полученный осадок дициклогексилмочевины путем фильтрации с использованием бумажного фильтра класса 415 и выбросить его. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C. Растворите собранный остаток в 150 мл гексана. Выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 335 мбар и 40 ° C. Добавьте 350 мл этанола к маслянистому остатку собрать конечный продукт. Промыть офф-белое твердое вещество с этанолом и сушат твердый продукт под вакуумом при 50 ° C. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н – ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 5,39 (д, J = 4,7 Гц, 1H, CH = C), 4.70-4.58 (м, 1H, C H OCO), 2,44 (т, J = 2,5 Гц, 2H, CH 2 СО), 2,34 (м, 2H, CH2 – C = Н), 2,31 (м, 2H, CH 2 СН2 – СОО), 2,28 (с, 1H, ЧАСС ≡), 2,27 (д, J = 2,3 Гц, 2H, ≡CC Н 2), 2.07-1.06 (м, 2H, CH 2, CH), 0,94 (с, 3H, CH 3), 0,89 (д, J = 1,8 Гц, 3H, CH 3 C H), и 0,88 (д, J = 1,8 Гц, 6H, CH 3 -C Н), 0,67 (с, 3H, CH 3). ИК-Фурье (1 / λ [см -1]): 2,830-2,990 (широкий и сильный пик), 2104 (м), 1695 (с), 1428 (м), 1135 (м), 999 (с), 798 (с), и 667 (с). 5. Синтетический Модификация a-N 3 -три рычаг СБК с альфа-холестерил-три рукоятки СБК (SBC-αCLC) через азид-Алкин Huisgen цикло-аддитивной реакции ( «Нажмите» Реакция) , чтобы получить SBC-ХОЛ (По Шарма и др. 6) В круглодонную колбу, растворить 1 молярный эквивалент СБК-3 ап (1,5 г) в 100 мл свежеперегнанного тетрагидрофурана (ТГФ). Добавить 1,2 молярных equivalenт холестерилпропионата 5-hexynoate (1,94 г), 0,1 молярный эквивалент меди (I) иодида (0,06 г), и 0,1 молярный эквивалент триэтиламина (0,03 г). Смесь перемешивают в течение ночи при 35 ° С в атмосфере азота. Выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 357 мбар и 40 ° C. Растворить остаточную смесь в 80 мл дихлорметана и центрифугируют в течение 5 мин при 2800 х г при комнатной температуре, чтобы удалить непрореагировавшие материалы и побочные продукты. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н – ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 7,54 (с, СН = С-триазола), 5.43-5.34 (м, С = СН холестерина), 5.10-5.06 (м, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (м, O-СН холестерин), 4.24-4.19 (м, СН 2 О), 4.18-4.13 (т, J = 5,0 Гц, СН 2 О), 4.11-4.05 (т, J = 4,4 Гц, СН 2 О), 2.47-2.41 (т, J = 4,9 Гц, СОСН 2), 2.31-2.25 (м, СОСН 2), 2.07-1.02 (м, СН 2 </sUB>, СН 3), 1.05-1.03 (с, СН 2, СН 3), 0.96-0.92 (д, J = 3,3 Гц, СН 2, СН 3), 0.91-0.87 (дд, J = 1,9 Гц, J = 1,8 Гц, СН 3), и 0.71-0.68 (с, СН 3). ИК-Фурье (1 / λ [см – 1]): 3260 (с), 2920 (с), 1710 (с), 1460 (с), 1370 (с), 1240 (м), 1190 (с), 733 (ы), и 668 (с). 6. Синтез 2,2-бис (1-капролактон-4-ил) пропан (сшивающий агент, ППГ) ( В соответствии с Гао и др. 27 и Альбертссон и др. 31) В круглодонную колбу, приготовить раствор, содержащий 10,8 г 2-бис (4-гидрокси-циклогексил) пропан и 52 мл уксусной кислоты. Готовят раствор, содержащий 11 г триоксида хрома в 50 мл уксусной кислоты и 8 мл дистиллированной воды. Добавьте этот раствор по каплям к раствору , полученному на стадии 6.1, поддерживая температуру смеси между 17 и 20 ° C (например, вводяная баня); этот процесс по каплям занимает 2 ч. После того, как процесс будет завершен, чтобы раствор перемешивают в течение примерно 30 мин. Добавляют 50 мл 2-пропанола. Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Концентрируют темно-фиолетовый раствор при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 137 мбар и 40 ° C. Добавить 300 мл дистиллированной воды для осаждения; осадок должен быть светло-фиолетового цвета. Фильтрате сырого продукта с помощью бумажного фильтра класса 415. Промывают твердое вещество с ~ 250 мл дистиллированной воды или пока твердое вещество становится белым. Растворите твердый материал в 15 мл бензола при температуре 40 ° C, и пусть он рекристаллизация при температуре 25 ° C. Добавьте 8,34 г сухого дикетона, растворенного в сухом дихлорметане и раствор, содержащий 6,0 г 3-хлорпербензойной кислоты в 75 мл дихлорметана в колбе. Нагревание с обратным холодильником раствора при 40 ° С в течение 24 ч. Реакционную смесь охлаждают до -20 ° С в течение 10 мин для осаждения м </эм> побочный продукт -chlorobenzoic кислоты. Удалить м -chlorobenzoic кислоты путем фильтрации ( с использованием бумажного фильтра) и концентрируют раствор при пониженном давлении. Промыть вискозного сырой продукт с 200 мл 2-гептанона и сухой осадок под вакуумом при 50 ° С в течение ночи. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н – ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 4.42-4.37 (дд, J = 14,2, 7,4 Гц, 2H, CH 2 OC = O), 4.21-4.15 (т, 2H, J = 11,3 Гц, C H 2 OC = O), 2.80-2.75 (ддт, J = 14,3, 6,5, 1,6 Гц, 2H, CH 2 COO), 2.63-2.57 (тт, J = 13,3, 2,1 Гц, 2H, CH 2 СОО), 2.04-1.93 (m, 4H, -C Н 2 СН 2 OC = O), 1.70-1.56 (м, 4H, -С 2 Н С Н 2 СОО), 1,48-1,38 (м, 2H, – C H С (СН 3) 2), и 0,84 (с, 6H, CH 3 С-). </ол> 7. Создание пористых 3D эластомерных строительные леса , используя либо гексаметилендиизоцианат (HDI) или 2,2-бис (1-капролактон-4-ил) пропан (BCP) 27 в качестве сшивающих агентов ( В соответствии с Гао и др. 27) Подготовьте три рычага эластомерной смеси с использованием 0,75 г SBC-αCLC добавлением 0,25 мл HDI (или 0,45 мл ППГ) и 0,24 мл дистиллированной ε-капролактона мономера. Добавить 60 мкл Sn (Oct) 2. При использовании BCP вместо HDI, смешать SBC-αCLC и BCP с помощью вихря и поместить их в сушильном шкафу при 140 ° С до тех пор, пока ППГ полностью плавится и растворяется (этот шаг может занять до 2 часов). После того , как ППГ растворится, вынуть из печи и, в Sn (Oct) 2, и вихрь. Подготовка «жертвенный» шаблон пеноникеля путем разрезания 1 х 4 см металлической детали. Ролл его от одного из коротких концов так, чтобы конечный рулон приблизительно 1 х 1 см кусок металла (смотри рисунок 4). <литий> Поместите пену никеля в упаковке из фольги стекла флакона или алюминия и вылить смеси, полученные на стадии 7.1, чтобы полностью покрыть пену в течение 2 мин. Удалить излишки смеси с пипеткой Пастера. Оставьте его в печи в течение ночи при 80 ° C. Лупиться алюминиевую фольгу или разбить стекло. С помощью лезвия бритвы, бритье эластомера вокруг металлической пены подвергать металлический никель. Подготовьте 1 М железа (III) хлорид (FeCl 3) раствор в 100 мл воды. Поместите пену в колбу и добавляют 70 мл раствора FeCl 3. Перемешивают в течение трех дней при комнатной температуре и изменить решение FeCl 3 каждый день. Перед каждым изменением, перемешать пену с ионизированной водой в течение 0,5 ч. Примечание: Процесс травления обычно завершается через три дня. Для того, чтобы гарантировать, что процесс травления завершен, выполнять тактильные испытания на сжатие до пены не чувствовать себя мягкой. устойчивость пены к тактильных испытаний на сжатие указывает на наличие шаблона остаточного металла. Промыть ELASTгомор пена с этанолом и место в вакуумной печи в течение ночи при 40 ° C. Охарактеризуйте материалов с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM), дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), механические испытания сжатия и термогравиметрический анализ (ТГА) 27. Примечание: Для получения более гидрофильный 3D LCE, замените SBC с LBC (убедившись, что LBC также содержит LC-фрагмент) в соответствии с шагами, описанными в пункте 7.5. 8. Посев эластомерных строительные леса с SH-SY5Y клеток нейробластомы и культура Использование стерильности Стерилизация эластомера путем промывки его дважды с 1 мл 70% -ного этанола. Выполнение УФ-облучение в течение 10 мин и промывают 1 мл 70% этанола. Промыть дважды с 1 мл стерильной воды и 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Поместите эластомеры в 24-луночные культуральные планшеты. Готовлю среду для роста клеток для SH-SY5Y, содержащего 90% Дульбекко модификации Дульбекко (DMEM) supplem10 подарил% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep). После подсчета клеток с использованием гематоцитометр, подготовить 1,5 х 10 5 SH-SY5Y клетки суспендируют в 100 мкл среды роста (семян раствора). Добавить раствор поверх эластомеров, убедившись, что для образования капли. Инкубируйте семенами эластомеры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 2 ч , чтобы способствовать адгезии клеток. Добавить 0,5 мл ростовой среды. Инкубируйте снова при 37 ° С с 5% CO 2. Изменение среды через день после мытья с 1 мл PBS. 9. Микроскопическая Визуализация эластомерных Construct Закрепить клетки, выращенные на эластомеров с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин. Промыть 3 мл PBS три раза в течение 5 мин каждых и поместить эластомер с фиксированными клетками в культуральной чашке с прикрепленным покровным. Внимание: ПФ является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). станцияв фиксированных образцах с 0,1% 4' , 6-диамидино-2-фенилиндолы (DAPI) в 500 мкл PBS в течение 10 минут и промыть в два раза с 1 мл PBS в течение 5 мин. Сразу изображение эластомеры с использованием конфокальной микроскопии с DAPI флуоресценции, приобретая изображения стеки, которые охватывают образец. Примечание: При этом изображения стеки были приобретены с использованием объектива 20X и 60X цели. Анализ стеки оптических конфокальных изображений с использованием ImageJ 32.

Representative Results

Этот отчет показывает способ получения пористой 3D LCE в качестве каркаса для культуры клеток с использованием шаблона никель-металл. Полученный 3D ХПЛ демонстрирует сложную взаимосвязанную сеть каналов , что позволяет легко клеточной инфильтрации, а также более подход…

Discussion

Жидкокристаллические эластомеры недавно были исследованы в качестве биосовместимых каркасов клеток из-за их стимулы к реагированию. Они оказались идеальными платформами, как мобильные строительные леса. Тем не менее, является важным фактором, чтобы иметь в виду при подготовке и разр?…

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000