Методическая статья

Синтез биосовместимых жидкого кристалла эластомерных пен, как Cell Каркасы для 3D-пространственных культур клеток

DOI:

10.3791/55452

⸱

11 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование представляет методологию для подготовки 3D, биоразлагаемый, пенообразный каркасы клеточного на основе биосовместимых жидкокристаллических эластомеров боковой цепи (LCEs). Конфокальные микроскопия эксперименты показывают, что пенообразный LCEs позволяет прикрепление клеток, пролиферации и спонтанного выравниванию C2C12s миобластов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем шаг за шагом подготовку 3D, биоразлагаемых, пенообразные клетки строительных лесов. Эти каркасы были получены путем поперечного сшивания звезд блок-сополимеров, показывающие единицы холестерина в боковой цепи боковых групп, в результате чего смектической-А (СМА) жидкокристаллических эластомеров (LCEs). Пенообразный каркасы, подготовленный с использованием шаблонов металлов, имеет взаимосвязанные микроканалы, что делает их пригодными в качестве 3D-клеточной культура каркасов. Объединенные свойства обычной структуры металлической пены и в результате эластомера в клеточном помосте 3D , что способствует не только более высокой пролиферации клеток по сравнению с обычными пористыми шаблонными фильмами, но и более эффективным управлением переносом массы (то есть, питательными веществами, газов, отходы и т.д.). Природа шаблона металла позволяет легко манипулировать пены форм (т.е. рулонов или пленки) , а также для подготовки каркасов различных размеров пор для различных исследований клеток при сохранении interconnecTed пористая природа шаблона. Процесс травления не влияет на химический состав эластомеров, с сохранением их биологически совместимая и биологически разлагаемой природы. Показано, что эти Смектические LCEs при выращивании в течение длительного периода времени, времени, позволит исследование клинически значимых и сложных конструкций ткани, содействуя росту и пролиферации клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько примеров биосовместимых биологических и синтетических материалов , предназначенных для применения в исследованиях клеток и для регенерации ткани , направленной на прикрепление клеток и пролиферации 1, 2, 3, 4, 5. Там было несколько примеров биосовместимых материалов, известных как жидкокристаллические эластомеры (LCEs), которые могли бы реагировать на внешние раздражители с анизотропной молекулярным упорядочением 6, 7. LCEs являются стимулы-чувствительных материалами , которые сочетают в себе механические и эластичные свойства эластомеров с оптической функциональностью и молекулярным упорядочением жидких кристаллов 8, 9. LCEs может испытывать изменения в форме, механическую деформацию, упругое поведение и оптические свойства в ответ на внешние ститулы (то есть., жара, стресс, свет и т.д.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Более ранние исследования показали , что жидкие кристаллы (ЖК) может ощутить рост и ориентацию клеток 4, 17. Можно тогда предположить, что LCEs может быть пригоден для биологических и медицинских соответствующих приложений, включая клетку леса и выравнивание. Ранее мы уже сообщали о подготовке смектических биосовместимые, биодеградируемые, литье под давлением, и тонкие LCEs фильмов с участием в «типа швейцарского сыра» пористый морфологию 6, 18. Мы также подготовили нематические биосовместимые LCEs с глобулярной морфологией , как каркасы для роста клеток 19 20. Наша работа была направлена на настройку механических свойств материалов , чтобы они соответствовали интересующей ткани 21. Кроме того, эти исследования сосредоточены на понимании эластомер-клеточных взаимодействий, а также клеточный ответ, когда эластомеры подвергается воздействию внешних раздражителей.

Основные проблемы были частично адаптировать пористость LCEs, чтобы обеспечить прикрепление клеток и проникновение через матрицу эластомера и для лучшего переноса массы. Пористость этих тонких пленок 6 позволила клеточной проницаемости через объем матрицы, но не все поры были полностью соединены между собой или имели более регулярные (однородный) размер пор. Затем мы сообщили о биосовместимых нематико LCE эластомеры с шаровыми морфологией. Эти нематических эластомеры разрешены для прикрепления и пролиферации клеток, но размер пор в диапазоне от 10-30 только мкм, что помешало или ограничить использование этихэластомеры с более широким разнообразием клеточных линий 19, 20.

Предыдущая работа Кунг и др. связанные с формированием графеновых пен с использованием «жертвенную» шаблон металла показал , что полученный графен пена имела очень регулярный пористой морфологии , диктуемой выбранного шаблона 22 металла. Эта методика обеспечивает полный контроль пористости и размера пор. В то же время, пластичность и гибкость шаблона металла позволяют формирование другого шаблона формы перед приготовлением пены. Другие методы, такие как материал выщелачивание 23, газ шаблоны 24 или электрооптического прядением волокон 25, 26 также обеспечивают потенциал для получения пористых материалов, но они больше времени, и, в некоторых случаях, размер пор ограничен лишь несколько микрометров. пена-как 3D LCEs готовили с использованием шаблонов металлов позволяют более высокую нагрузку клеток; улучшенная скорость пролиферации; совместное культивирование; и, наконец , но не в последнюю очередь, лучше массовое управление транспортом (то есть, питательные вещества, газы и отходы) , чтобы обеспечить развитие полной ткани 27. Пенообразный 3D LCEs также появляется, чтобы улучшить выравнивание клеток; это, скорее всего по отношению к LC подвескам зондирования роста клеток и ориентации клеток. Наличие LC остатки в пределах LCE появляется для улучшения выравнивания клеток относительно расположения клеток внутри LCE строительных лесов. Клетки выравнивания в пределах распорок в LCE, в то время как нет четкой ориентации не наблюдаются , где распорки объединяются (переходы) 27.

В целом, наша LCE клетки подмости платформа в качестве опорной ячейки среды открывает новые возможности для настройки морфологии эластомера и упругих свойства и конкретно направлять выравнивание (индивидуальные) типов клеток для создания нумерованных, пространственные расположений оF клетки, похожие на живые системы. Помимо обеспечения лески, способной выдержать и направляя долгосрочный клеточный рост и пролиферацию, LCEs также позволяет для динамических экспериментов, в которых ориентация и взаимодействие клеток могут быть изменены на лета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Следующие шаги для 3D - LCE пенообразного подготовки с использованием 3-рука звезды блок - сополимера показаны на рисунке 1. Для получения ядерного магнитного резонанса (ЯМР) характеристики, спектры записаны в дейтерированном хлороформе (CDCl 3) при комнатной температуре на 400 МГц приборе Bruker DMX и внутренне ссылки остаточные пики при 7.26. Преобразование Фурье инфракрасного спектра (FT-IR) записывается с использованием Bruker Вектор 33 FT-IR спектрометра с использованием режима нарушенного полного отражения. Для каждого шага следующего протокола, важно носить соответствующую защитную одежду (СИЗО).

1. Синтез альфа-хлор-е-капролактон (Мономер) ( В соответствии с процедурой , описанной в Жером и др. 28)

  1. Перед началом синтеза, очистки 27 г 3-хлорпербензойной кислоты следующим образом:
    1. В 800 мл дистиллированной воды, добавляют 1,28 г натриямоногидрата одноосновного фосфата и 8,24 г гептагидрата двухосновного фосфата натрия. Доводят рН до 7,4 (с помощью гидроксида натрия или соляной кислоты) и резерв 30 мл этого раствора; это буферный раствор.
    2. С помощью делительной воронки, растворите 3-хлорпербензойной кислоты в 35 мл диэтилового эфира. Промывают органический раствор с 10 мл буферного раствора (полученного на стадии 1.1.1.). Повторите промывочные три раза.
    3. Добавьте 3 г сульфата натрия непосредственно в органическом растворе; Этот сушильный агент поглощает воду из органического раствора.
    4. Фильтр решения, чтобы удалить осушающий агент. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C.
  2. Солюбилизации 18,5 г очищенного 3-хлорнадбензойной кислоты в 150 мл сухого дихлорметана при перемешивании в ультразвуковой ванне; Этот процесс обычно занимает 20 мин. Поместите раствор внутри делительной воронки.
  3. Внутри два-образного выреза, круглое дно колбы,растворения 13,1 г 2-хлорциклогексанона в 15 мл сухого дихлорметана с помощью магнитной мешалки в атмосфере газообразного азота. Продолжайте размешивать.
  4. Установить делительную воронку, содержащую раствор 3-хлорпербензойной кислоты (со стадии 1.2) в двухгорлую колбу на шаге 1.3. Промыть систему с газообразным азотом. Регулировка открытия делительную воронку так, чтобы раствор хлорпербензойной кислоты падает по каплям в раствор 2-хлорциклогексанона (1 капля каждый второй) и продолжают перемешивание смеси при газообразного азота в течение 96 ч.
  5. Реакционную смесь охлаждают до -20 ° С в течение 1 ч для осаждения м -chlorobenzoic кислоты (м -CBA) побочный продукт.
  6. Фильтр м -chlorobenzoic кислоты (м -CBA) и промыть Оставшийся раствор с насыщенными растворами тиосульфата натрия, бикарбонат натрия и хлорид натрия.
  7. Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C. Очищает бледно-желтое вязкое жидкое мылоИдентификатор путем перегонки при пониженном давлении при 2,3 Торр и 96 ° С.
  8. Монитор успех синтеза с использованием следующих 1 Н - ЯМР пики. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 4.75-4.68 (м, 1H, C H ClCO), 4.37-4.26 (м, 1Н, С Н 2 О), 4.18-4.05 (м, 1H , С Н 2 О) и 2.06-1.58 (м, 6Н, Н 2 -С -) 6, 27.

2. Синтез α-Три-рука звезда блок - сополимер (СКИ-αCl) с помощью кольца сополимеризации открытия (Шарма и др. 6 и Амсден и др. 29)

  1. Перед синтезом, silanize 20-мл ампулу, заполняя его с 2% (об / об) раствора 1Н, 1Н, 2Н, 2Н-perfluorooctyltriethoxysilane в толуоле и перемешивают в течение примерно 24 ч. Полоскание с изопропиловым спиртом и высушить его, поместив его в печи при температуре 140 ° С в течение 30 мин.
  2. Добавить 30,64 г дистиллированной -капролактона, 0,5 г α-хлор-е-капролактон, и 0,25 мл глицерина в ампуле. Смешайте использование вихря в течение 1 мин.
  3. Добавьте 4,90 г D, L- -lactide к ампуле и продувают его азотом. Поместите ампулу в печи при температуре 120 ° С , чтобы расплавить D, L -lactide; Этот процесс обычно занимает около 2 часов. Смешайте еще раз , используя воронку , чтобы убедиться , что все содержимое тщательно перемешивают и добавляют 66 мкл олова (II) , 2-этилгексаноат (Sn (Oct) 2) в ампуле.
    Примечание: D, L -lactide будет остывать в течение этого процесса , и необходимо будет повторно нагревают в печи для плавления.
  4. Энергично перемешайте в последний раз, используя воронку и промойте азотом.
  5. Закройте ампулу с резиновой пробкой. Поместите иглу, соединенный с вакуумной трубкой (дом вакуум обычно достаточно) через резиновую пробку. Включите вакуум и, используя пламя, расплавить длинную шею стекла, не скручивания медленно до гдеваха падает на себя. Будьте осторожны, чтобы не расплавить резиновую пробку. После того, как ампула запаянные, поместить его в песчаной бане, печи, или соответствующий нагревательный элемент при 140 ° С в течение 48 ч.
  6. Возьмите ампулу и дайте ему остыть при комнатной температуре.
  7. Перерыв ампулу на запечатанной марке и растворяет высоко вязкую жидкость при добавлении 10 мл дихлорметана. Переносят раствор в делительную воронку.
  8. Готовит колбу, содержащую 100 мл холодного метанола (охлажденный с помощью сухого льда / ацетоном, при температуре около -78 ° С). Закрепить делительную воронку (этап 2.7), в верхней части колбы. Регулировка открытия делительной воронки так, что около двух капель падают каждые другие вторые (по каплям).
  9. Собирают белый осадок путем фильтрации (с помощью бумажного фильтра) и высушить в вакуумной печи между 50 и 60 ° C.
  10. Монитор успех синтеза с использованием следующих 1 Н - ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, Δ [м.д.]): 5.29-5.03 (м, КОК Н С Н 3), 4.43-4.25 (м, C H Cl), 4.24-4.12 (м, С Н 2 О), 4.11-4.03 (т, J = 4,6 Гц, С Н 2 О), 3.80-3.68 (м, C H C H 2), 3.09-2.64 (широкий, S, O Н), 2,39 (т, J = 4,5 Гц, α- Н), 2,33 (т, J = 5,1 Гц, α- Н) и 1.77-1.25 (м, С Н 2, С Н 3); ИК-Фурье (1 / λ [см - 1]): две тысячи девятьсот тридцать два (с), 2869 (м), одна тысяча семьсот сорок-одна (с), 961 (с), 866 и 735 (м) 6, 27.
    Примечание: Для получения более гидрофильный 3D LCE, подготовить линейный блок-сополимер (LBC) вместо SBC, следуя процедуре открытия кольца сополимеризации (ROP), описанной выше.
    1. Добавить 0,3 г полиэтиленгликоля (ПЭГ), 3,15 г -капролактона, 1,0 г α-хлор-е-капролактон, и 5,0 г D, L-лактида к силанизированного флакона смеси.

3. Синтетический Модификация альфа-Cl-Три Arm SBC с 3 -три ап Arm SBC (SBC-ап 3) ( В соответствии с Шарма и др. 6)

  1. В круглодонную колбу в атмосфере азота, растворяют 5 г SBC-αCl в 30 мл сухого N, N - диметилформамид N».
  2. Добавьте 0,22 г азида натрия и позволяют реагировать в течение ночи при комнатной температуре.
    Внимание: азид натрия токсичен; носить соответствующую защитную одежду (СИЗ).
  3. Удалите N, N»диметилформамид при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 11 мбар и 40 ° C. Растворить смесь в 30 мл толуола. Центрифуга раствор трижды при 2800 х г в течение 15 мин, чтобы удалить соль, образованную. Упаривает толуол при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 77 мбар и 40 ° C.
  4. Монитор успеха замещения азида с использованием 1 Н - ЯМР и ИК-пиков.
    ЗАМЕТКА: 1 Н - ЯМР - спектр был похож на родитель СКИ-αCl, за исключением появления пика при 3,90 м.д. , связанного с группой азида; ИК-Фурье (1 / λ [см -1]): 2928, 2108 (с, азид), 1754 (с), +1450 (с), 960 (м), 865 (с), 733 (с), и 696 (м).

4. Синтез 5-холестерина и Hexynoate (ЖХ общие) ( В соответствии с Шарма и др. 6 и Donaldson и др. 30)

  1. В круглодонную колбу, смесь 3 г 5-hexynoic кислоты и 130 мл дихлорметана. Смесь охлаждают до 0 ° С на бане со льдом.
  2. В другом круглодонную колбу, смесь 8,28 г N, N - дициклогексилкарбодиимид N», 10,3 г холестерина и 0,2 г 4-диметиламинопиридина.
  3. Передача по каплям раствора кислоты 5-hexynoic в колбу, содержащей смесь холестерина и поддерживать конечную смесь при температуре 0 ° С в течение 1 ч.
  4. Разрешить смесь нагревали до комнатной температуры в течение ночи.
  5. Удалить полученный осадок дициклогексилмочевины путем фильтрации с использованием бумажного фильтра класса 415 и выбросить его.
  6. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 850 мбар и 40 ° C. Растворите собранный остаток в 150 мл гексана.
  7. Выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 335 мбар и 40 ° C. Добавьте 350 мл этанола к маслянистому остатку собрать конечный продукт. Промыть офф-белое твердое вещество с этанолом и сушат твердый продукт под вакуумом при 50 ° C.
  8. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н - ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 5,39 (д, J = 4,7 Гц, 1H, CH = C), 4.70-4.58 (м, 1H, C H OCO), 2,44 (т, J = 2,5 Гц, 2H, CH 2 СО), 2,34 (м, 2H, CH2 - C = Н), 2,31 (м, 2H, CH 2 СН2 - СОО), 2,28 (с, 1H, ЧАСС ≡), 2,27 (д, J = 2,3 Гц, 2H, ≡CC Н 2), 2.07-1.06 (м, 2H, CH 2, CH), 0,94 (с, 3H, CH 3), 0,89 (д, J = 1,8 Гц, 3H, CH 3 C H), и 0,88 (д, J = 1,8 Гц, 6H, CH 3 -C Н), 0,67 (с, 3H, CH 3). ИК-Фурье (1 / λ [см -1]): 2,830-2,990 (широкий и сильный пик), 2104 (м), 1695 (с), 1428 (м), 1135 (м), 999 (с), 798 (с), и 667 (с).

5. Синтетический Модификация a-N 3 -три рычаг СБК с альфа-холестерил-три рукоятки СБК (SBC-αCLC) через азид-Алкин Huisgen цикло-аддитивной реакции ( «Нажмите» Реакция) , чтобы получить SBC-ХОЛ (По Шарма и др. 6)

  1. В круглодонную колбу, растворить 1 молярный эквивалент СБК-3 ап (1,5 г) в 100 мл свежеперегнанного тетрагидрофурана (ТГФ). Добавить 1,2 молярных equivalenт холестерилпропионата 5-hexynoate (1,94 г), 0,1 молярный эквивалент меди (I) иодида (0,06 г), и 0,1 молярный эквивалент триэтиламина (0,03 г). Смесь перемешивают в течение ночи при 35 ° С в атмосфере азота.
  2. Выпаривают растворитель при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 357 мбар и 40 ° C.
  3. Растворить остаточную смесь в 80 мл дихлорметана и центрифугируют в течение 5 мин при 2800 х г при комнатной температуре, чтобы удалить непрореагировавшие материалы и побочные продукты.
  4. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н - ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 7,54 (с, СН = С-триазола), 5.43-5.34 (м, С = СН холестерина), 5.10-5.06 (м, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (м, O-СН холестерин), 4.24-4.19 (м, СН 2 О), 4.18-4.13 (т, J = 5,0 Гц, СН 2 О), 4.11-4.05 (т, J = 4,4 Гц, СН 2 О), 2.47-2.41 (т, J = 4,9 Гц, СОСН 2), 2.31-2.25 (м, СОСН 2), 2.07-1.02 (м, СН 2 , СН 3), 1.05-1.03 (с, СН 2, СН 3), 0.96-0.92 (д, J = 3,3 Гц, СН 2, СН 3), 0.91-0.87 (дд, J = 1,9 Гц, J = 1,8 Гц, СН 3), и 0.71-0.68 (с, СН 3). ИК-Фурье (1 / λ [см - 1]): 3260 (с), 2920 (с), 1710 (с), 1460 (с), 1370 (с), 1240 (м), 1190 (с), 733 (ы), и 668 (с).

6. Синтез 2,2-бис (1-капролактон-4-ил) пропан (сшивающий агент, ППГ) ( В соответствии с Гао и др. 27 и Альбертссон и др. 31)

  1. В круглодонную колбу, приготовить раствор, содержащий 10,8 г 2-бис (4-гидрокси-циклогексил) пропан и 52 мл уксусной кислоты.
  2. Готовят раствор, содержащий 11 г триоксида хрома в 50 мл уксусной кислоты и 8 мл дистиллированной воды. Добавьте этот раствор по каплям к раствору , полученному на стадии 6.1, поддерживая температуру смеси между 17 и 20 ° C (например, вводяная баня); этот процесс по каплям занимает 2 ч. После того, как процесс будет завершен, чтобы раствор перемешивают в течение примерно 30 мин.
  3. Добавляют 50 мл 2-пропанола. Раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.
  4. Концентрируют темно-фиолетовый раствор при пониженном давлении с использованием роторного испарителя при 137 мбар и 40 ° C. Добавить 300 мл дистиллированной воды для осаждения; осадок должен быть светло-фиолетового цвета.
  5. Фильтрате сырого продукта с помощью бумажного фильтра класса 415. Промывают твердое вещество с ~ 250 мл дистиллированной воды или пока твердое вещество становится белым.
  6. Растворите твердый материал в 15 мл бензола при температуре 40 ° C, и пусть он рекристаллизация при температуре 25 ° C.
  7. Добавьте 8,34 г сухого дикетона, растворенного в сухом дихлорметане и раствор, содержащий 6,0 г 3-хлорпербензойной кислоты в 75 мл дихлорметана в колбе.
  8. Нагревание с обратным холодильником раствора при 40 ° С в течение 24 ч.
  9. Реакционную смесь охлаждают до -20 ° С в течение 10 мин для осаждения м побочный продукт -chlorobenzoic кислоты.
  10. Удалить м -chlorobenzoic кислоты путем фильтрации ( с использованием бумажного фильтра) и концентрируют раствор при пониженном давлении.
  11. Промыть вискозного сырой продукт с 200 мл 2-гептанона и сухой осадок под вакуумом при 50 ° С в течение ночи.
  12. Монитор синтеза с использованием следующих 1 Н - ЯМР и ИК-пиков. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3, δ [м.д.]): 4.42-4.37 (дд, J = 14,2, 7,4 Гц, 2H, CH 2 OC = O), 4.21-4.15 (т, 2H, J = 11,3 Гц, C H 2 OC = O), 2.80-2.75 (ддт, J = 14,3, 6,5, 1,6 Гц, 2H, CH 2 COO), 2.63-2.57 (тт, J = 13,3, 2,1 Гц, 2H, CH 2 СОО), 2.04-1.93 (m, 4H, -C Н 2 СН 2 OC = O), 1.70-1.56 (м, 4H, -С 2 Н С Н 2 СОО), 1,48-1,38 (м, 2H, - C H С (СН 3) 2), и 0,84 (с, 6H, CH 3 С-).

    13. 7. Создание пористых 3D эластомерных строительные леса , используя либо гексаметилендиизоцианат (HDI) или 2,2-бис (1-капролактон-4-ил) пропан (BCP) 27 в качестве сшивающих агентов ( В соответствии с Гао и др. 27)

    1. Подготовьте три рычага эластомерной смеси с использованием 0,75 г SBC-αCLC добавлением 0,25 мл HDI (или 0,45 мл ППГ) и 0,24 мл дистиллированной ε-капролактона мономера. Добавить 60 мкл Sn (Oct) 2. При использовании BCP вместо HDI, смешать SBC-αCLC и BCP с помощью вихря и поместить их в сушильном шкафу при 140 ° С до тех пор, пока ППГ полностью плавится и растворяется (этот шаг может занять до 2 часов). После того , как ППГ растворится, вынуть из печи и, в Sn (Oct) 2, и вихрь.
    2. Подготовка «жертвенный» шаблон пеноникеля путем разрезания 1 х 4 см металлической детали. Ролл его от одного из коротких концов так, чтобы конечный рулон приблизительно 1 х 1 см кусок металла (смотри рисунок 4).
      3. <литий> Поместите пену никеля в упаковке из фольги стекла флакона или алюминия и вылить смеси, полученные на стадии 7.1, чтобы полностью покрыть пену в течение 2 мин. Удалить излишки смеси с пипеткой Пастера. Оставьте его в печи в течение ночи при 80 ° C.
    3. Лупиться алюминиевую фольгу или разбить стекло. С помощью лезвия бритвы, бритье эластомера вокруг металлической пены подвергать металлический никель.
    4. Подготовьте 1 М железа (III) хлорид (FeCl 3) раствор в 100 мл воды. Поместите пену в колбу и добавляют 70 мл раствора FeCl 3. Перемешивают в течение трех дней при комнатной температуре и изменить решение FeCl 3 каждый день. Перед каждым изменением, перемешать пену с ионизированной водой в течение 0,5 ч.
      Примечание: Процесс травления обычно завершается через три дня. Для того, чтобы гарантировать, что процесс травления завершен, выполнять тактильные испытания на сжатие до пены не чувствовать себя мягкой. устойчивость пены к тактильных испытаний на сжатие указывает на наличие шаблона остаточного металла.
    5. Промыть ELASTгомор пена с этанолом и место в вакуумной печи в течение ночи при 40 ° C.
    6. Охарактеризуйте материалов с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM), дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), механические испытания сжатия и термогравиметрический анализ (ТГА) 27.
      Примечание: Для получения более гидрофильный 3D LCE, замените SBC с LBC (убедившись, что LBC также содержит LC-фрагмент) в соответствии с шагами, описанными в пункте 7.5.

    8. Посев эластомерных строительные леса с SH-SY5Y клеток нейробластомы и культура Использование стерильности

    1. Стерилизация эластомера путем промывки его дважды с 1 мл 70% -ного этанола. Выполнение УФ-облучение в течение 10 мин и промывают 1 мл 70% этанола. Промыть дважды с 1 мл стерильной воды и 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Поместите эластомеры в 24-луночные культуральные планшеты.
    2. Готовлю среду для роста клеток для SH-SY5Y, содержащего 90% Дульбекко модификации Дульбекко (DMEM) supplem10 подарил% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep).
    3. После подсчета клеток с использованием гематоцитометр, подготовить 1,5 х 10 5 SH-SY5Y клетки суспендируют в 100 мкл среды роста (семян раствора). Добавить раствор поверх эластомеров, убедившись, что для образования капли.
    4. Инкубируйте семенами эластомеры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 2 ч , чтобы способствовать адгезии клеток. Добавить 0,5 мл ростовой среды. Инкубируйте снова при 37 ° С с 5% CO 2.
    5. Изменение среды через день после мытья с 1 мл PBS.

    9. Микроскопическая Визуализация эластомерных Construct

    1. Закрепить клетки, выращенные на эластомеров с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин. Промыть 3 мл PBS три раза в течение 5 мин каждых и поместить эластомер с фиксированными клетками в культуральной чашке с прикрепленным покровным.
      Внимание: ПФ является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
    2. станцияв фиксированных образцах с 0,1% 4' , 6-диамидино-2-фенилиндолы (DAPI) в 500 мкл PBS в течение 10 минут и промыть в два раза с 1 мл PBS в течение 5 мин.
    3. Сразу изображение эластомеры с использованием конфокальной микроскопии с DAPI флуоресценции, приобретая изображения стеки, которые охватывают образец.
      Примечание: При этом изображения стеки были приобретены с использованием объектива 20X и 60X цели.
    4. Анализ стеки оптических конфокальных изображений с использованием ImageJ 32.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот отчет показывает способ получения пористой 3D LCE в качестве каркаса для культуры клеток с использованием шаблона никель-металл. Полученный 3D ХПЛ демонстрирует сложную взаимосвязанную сеть каналов , что позволяет легко клеточной инфильтрации, а также более подходящее массоперенос 27. Было обнаружено, что клетки способны проникать полностью взаимосвязанную сеть каналов, а также возможность для выравнивания в LCE. Здесь, металлический никель пены (99% Ni, плот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жидкокристаллические эластомеры недавно были исследованы в качестве биосовместимых каркасов клеток из-за их стимулы к реагированию. Они оказались идеальными платформами, как мобильные строительные леса. Тем не менее, является важным фактором, чтобы иметь в виду при подготовке и разработке нового LCE эшафот пористость. Введение вымываемых твердых веществ или газов 23 не всегда приводит к однородной пористости или полностью соединенных между собой поры. Использование шаблона металла, который может ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Kent State University (совместный грант исследований и поддержку Инициативы по регенеративной медицине в Kent State - ReMedIKS) за финансовую поддержку данного проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктилтриэтоксисиланАльфа АэсарL16606Силанизационный агент
2-бис(4-гидроксициклогексил)пропанTCIa href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928Реагент
2-хлоргексанон Альфа АесарА18613Реагент
2-гептанон Sigma AldrichW254401Растворитель
2-пропанолСигма Олдрич278475Растворитель
3-хлорпербензойная кислота, м-ЦПБАСигма Олдрич273031Реагент
4-диметиламинопиридинАльфа Аэсар А13016Реагент
4',6-диамидино-2-фенилиндол, DAPI InvitrogenD1306Ядерный краситель
5-гексиновая кислота Alfa AesarB25132-06Реагент
Уксусная кислотаVWR36289Растворитель
Ацетон SigmaAldrich34850Сольвентный
спирт 200 proof ACS Grade VWR71001-866Реагент
бензолальфа аэзарAA33290растворителем
ε-капролактоном Альфа АэсарA10299-0EРеагент
ХлороформVWRBDH1109растворитель Холестерин
Сигма ОлдричC8503Реагент
Оксид хрома(VI)Сигма Олдрич232653Реагент
Медь(I) йодидStrem Химикаты100211-060Реагент
<эм>Д, <эм>Л-лактид Альфа АэсарL09026Реагент
дихлорметансигма Олдрич320269растворителем
диэтиловый эфир Emd MilliporeEX0190Растворитель
N,N-диметилформамидSigma Aldrich270547растворитель
Dulbecco' s модифицированный Eagle medium, DEME CORNING Cellgo10-013Фильтрующий материал
ЭтанолАльфа Аэсар33361Растворитель
формальдегид SIGMA Life ScienceF8775Фиксирующая
фетальная сыворотка крупного рогатого скота, FBS HyCloneSH30071.01Фильтрующая
бумага, Класс 415, качественная, креповаяVWR28320Фильтрация
ГлицеринSigma AldrichG5516Центральный узел (3 руки)
Гексаметилендиизоцианат, HDISigma Aldrich52649Сшивающий
Хлорид железа (III)  Alfa Aesar12357Травитель
Изопропиловый спиртVWRBDH1133Растворитель
МетанолAlfa AesarL13255Растворитель
N,N'-дициклогексилкарбодиимидAldrichD80002Растворитель
N,N-диметилформамидSigma Aldrich270547растворитель
Металлический никель-металлический шаблонAmerican ElementsNi-860Пенопластовый шаблон
Нейробластомы клетки (SH-SY5Y)ATCCCRL-2266Клеточная линия
Пенициллин стрептомицин Thermo SCIENTIFIC15140122Антибиотики
Полиэтиленгликоль 2000, ПЭГАльфа АэсарB22181Реагент
Азид натрияVWR97064-646Реагент
бикарбонат натрияAMRESCO865Соль высыхающая
Хлориднатрия BDHBDH9286Соль сушка
Фосфат натрия двухосновной гептагидратFisherScientific S-374Соль сушка
Одноосновной моногидрат фосфатанатрия Sigma AldrichS9638Соль сушка
сульфат натрияСигма Олдрич239313Соль для сушки
ТетрагидрофуранАльфа Аэсар41819Растворитель
Тиосульфат де натрияAMRESCO393Соль для сушки
Олово (II) 2-этилгексаноатОлдричS3252Реагент
ТолуолАльфа Аэсар22903Растворитель
ТриэтиламинСигма Олдрич471283Реагент
ТрипсинHyCloneSH30042.01Отслоение клеток
Olympus FV1000
< агент

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи