Человека Сетчатка состоит из функционально и молекулярно различных регионов, включая фовеа, макулы и периферийных сетчатки. Здесь мы описываем метод, с помощью биопсии удара и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза вскрыть и собирать эти собственный сетчатки регионов для вниз по течению протеомного анализа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетчатки человеческого состоит из чувств neuroretina и базовой сетчатки пигментированной эпителия (ПЭС), который твердо complexed сосудистой сосудистое слой. Различные регионы сетчатки отличаются анатомически и молекулярно, содействуя уникальных функций и демонстрации дифференциального восприимчивости к болезням. Протеомного анализа каждого из этих регионов и слоев может обеспечить жизненно понимание молекулярных процесса многих заболеваний, в том числе возрастной макулярной дегенерации (AMD), сахарный диабет и глаукома. Однако разделение сетчатки регионов и слоев важно, прежде чем количественные протеомного анализа может быть достигнуто. Здесь мы описываем метод вскрытия и коллекции фовеа, макулы и периферийных регионов сетчатки и лежащие в основе комплекс ПЭС хориоидея, с участием региональных удар биопсии и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза. Одномерный SDS-PAGE, а также ниже по течению протеомного анализа, например жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS), может использоваться для идентификации белков в каждом расчлененных слое сетчатки, выявление молекулярных биомаркеров для сетчатки заболевания.
Введение
Сетчатка, НПП и сосудистое являются сложные ткани, которые демонстрируют важные региональные различия в выражение протеина, физиологические функции и патологических восприимчивости1,2. Например таких заболеваний, как возрастной макулярной дегенерации (AMD), пигментный ретинит и Центральной серозной ретинопатии продемонстрировать характерный локализации в фовеа, макулы или сетчатки периферии1,3, 4,6. Здесь мы представляем метод демонстрирует как собственный сетчатки, регионы самостоятельно предложат. Общая цель данного метода должна служить надежным ориентиром для коллекции образцов ткани из фовеа, макулы и периферийных регионов человеческого сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа. Обоснование для разработки и использования этой методики является то, что помощью протеомного анализа этих конкретных регионов сетчатки, важно, что молекулярные исследования могут быть взяты в физиологических и патофизиологические функции этих регионов.
Этот подход обещает раскрыть proteomic основой для относительного регионального болезни восприимчивости и для облегчения идентификации новых конкретных терапевтических целей. Действительно протеомических исследований стекловидного тела и его взаимодействия с сетчатки предоставили понимание ключевых молекулярного состава и функции здоровые и больные ткани5,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, отсутствуют четкие сравнительные протеомных анализов различных регионов сетчатки. Этот метод поможет поддержать эти столь необходимые исследования, обеспечивая преимущества по сравнению с другими методами, продемонстрировав подход к сбору надежных и воспроизводимых ткани. Более того подход является очень доступным, воспользовавшись удар стандартного размера и легко доступны ткань биопсии инструменты. Наша техника подчеркивает соответствующие сбора и хранения тканей для протеомных обработки, что делает важные соображения для стабильности белка и деградации. Таким образом этот метод является наиболее подходящим для следователей, учитывая течению молекулярный анализ proteomic факторов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
это исследование было одобрено в университете штата Айова ' s институциональных Наблюдательный Совет и придерживается принципов, изложенных в Хельсинкской декларации.
1. Foveal и макулярной биопсии удар
- открытым и бабочка человеческих глаз, таким образом, что он состоит из 4 отдельных закрылки тканей, как описано в предыдущей публикации. 5
- начиная с butterflied человеческий глаз, в чашке Петри, центр инструмент биопсии удара 4-мм над фовеа, нажмите вниз и нежно рулон до тех пор, пока надрез вокруг фовеа.
- Затем создать разрез вокруг макулы, центрирование и нажав вниз инструмент биопсии кожи 8-мм удар в аркады макулы, применяя мягкое давление и прокатки. Это будет производить второй, внешнее кольцо тканей, окружающих первый.
2. Периферических сетчатки биопсии удар
- использования удар 4-мм кожи биопсии инструмент сделать серию ударов в периферийных сетчатки, просто за пределами аркада. Здесь, сделать два Пробойники для каждого квадранта лоскут.
Примечание: После того, как сделаны все пунши, глаз будет иметь два концентрических ударов в центре, представляя фовеа и макулы, и двух ударов на базе каждая на общую сумму лоскут 8 ударов в периферийных сетчатки.
3. Фовеа и макулы биопсии коллекции
- как ткани теперь готова к коллекции, собрать все биопсии ткани в отдельном отцентрифугировать трубы и заморозить, с использованием жидкого азота для последующей обработки. Хранить все образцы-80 ° c до утилизации.
- Использовать изогнутые 0.12 Colibri пинцет, чтобы захватить края полупрозрачных тканей сетчатки фовеа. Собирать, поднять и отделить фовеа ткани от базового ПЭС сосудистое.
- Аналогично, используйте 0.12 щипцы Colibri понять внешнее кольцо полупрозрачные макулы ткани. Если ткани до сих пор подключен к основной или прилегающих тканей, используйте Уэсткотт ножницы для тщательно обрежьте края, захват только сетчатки компонента и рассекает прочь любую ткань зрительного нерва, включены в Пунсе.
4. Периферические сетчатки коллекции
- используют изогнутые 0.12 Colibri щипцами осторожно отделить периферических тканей сетчатки диски от базовых ПЭС сосудистое и в рамках отдельных отцентрифугировать трубы.
- В случае остаточного стекловидное тело гель, используйте щипцы для подъема и отдельный гель от как можно больше перед коллекции ткани сетчатки. После того, как был удален сетчатки, пигментированные ПЭС сосудистое остается ниже.
5. Фовеа и макулы ПЭС-Хориоидея коллекции
- использования 0,12 Colibri щипцы понять края темные ПЭС Хориоидея ткани, которая лежит под области удалены фовеа. Осторожно отделить этой ткани от склеры и собирать.
- С использованием же щипцы, понять края наружного кольца темные ткани ПЭС хориоидея, лежащие в основе удалены макулярной области. Тщательно отделяют этой ткани от склеры, схватив края в различных точках вокруг кольца и слегка потянув. В конце концов, кольцо ПЭС Хориоидея ткани будет выбили и могут быть собраны.
Примечание: Вторичные щипцами в противоположной стороны может быть полезным в манипулировании ПЭС Хориоидея ткани во время удаления. Как ткани сетчатки, Wescott ножницы может использоваться для оказания помощи в устранении любой ткани, которая не была полностью резаная, используя средство Панч.
6. Периферических сетчатки ПЭС-Хориоидея коллекции
- использовать 0.12 Colibri щипцы для удаляйте ПЭС сосудистое в 8 районах периферийных Панч.
- Как и ранее, место ПЭС Хориоидея ткани в пробирках, отцентрифугировать и заморозить, с использованием жидкого азота для последующей обработки. Держите все образцы в-80 ° C до утилизации.
7. Ножничные рассечение
Примечание: Если лезвие биопсии удара скучно или инструмент биопсии удара не помещается достаточно трудно, могут не существовать четкие очертания окружающих тканей.
- В этих случаях ткани тронуться насколько это возможно и затем использовать Уэсткотт ножницы для обрезки и отделить.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Тканей ПЭС-сосудистой оболочки и сетчатки могут быть обработаны различными способами, чтобы удовлетворить отдельные расследования. После сбора исследователь будет обладать образцы сетчатки и ПЭС Хориоидея ткани от фовеа региона, внешняя макулы и периферийных сетчатки (рис. 1). В частности удар фовеа региона будет включать фовеа, parafovea и небольшое количество соседних perifovea. Макулы удар включает оставшуюся часть perifoveal региона, а также небольшое кол...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
После ткани коллекции, пробами и лечение являются важнейшим соображения14. Сохранение в жидком азоте отдается предпочтение перед химической фиксации, как последний может привести к повреждению структуры белков, которая может наклонять вниз по течению анализа. Кроме того сохранение жидкого азота является предпочтительным для методов, которые не предусматривают замораживание образцов. В частности, Феррер et al. показали значительные различия между образцов мозга, сохранились на 4 ° C или ко...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Благодарности
ВБМ-при поддержке грантов NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 и R21AG050437], Дорис Дьюк благотворительного фонда Грант #: 2013103 и исследования для предотвращения слепоты (ОБН), Нью-Йорк, Нью -Йорк. MT и GV поддерживаются NIH Грант T32GM007337.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инструмент для биопсии 4 мм Miltex | REF 33-34 | ||
| 8 мм инструмент для биопсии Miltex | REF 33-37 | ||
| 0,12 Щипцы Colibri | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Ножницы Wescott | Хирургические инструменты Sklar 64-3146 | ||
| Микрофуге пробирки | Eppendorf | #022364111 | 1,5 мл |
| Жидкий азот | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [Р] |
Ссылки
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759(2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140(2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567(2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405(2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
