Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка антикоагулянт и противовоспалительных свойств эндотелиальных клеток с использованием 3D клеточной культуры и не антикоагулянтом цельной крови

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56227

⸱

5 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Research, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern, 3Immunology Research Centre, St. Vincent's Hospital Melbourne, 4Institute of Pathology, University of Bern, 5Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Ludwig-Maximilian University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем в vitro модель, которая позволяет изучение и анализ свертывающей системы в целом, не антикоагулянтом крови. Антикоагуляционную в системе зависит от природных Антисвертывающая эффект здоровых эндотелиальных клеток и активации эндотелиальных клеток приведет к свертывания.

Аннотация

В естественных условиях, эндотелиальные клетки имеют решающее значение для естественной антикоагуляционную циркулирующей крови. Следовательно активацию эндотелиальных клеток приводит к коагуляции крови. Это явление наблюдается во многих клинических ситуациях, как трансплантация присутствии предварительно сформированных антитела анти доноров, включая ксенотрансплантации, а также в ишемии/реперфузии травмы. Для того, чтобы уменьшить экспериментов на животных согласно 3R стандартов (сокращение, замена и уточнение), в пробирке модели для изучения влияния эндотелиальных клеток весьма желательно активации на свертываемость крови. Однако общие бортовой системы эндотелиальных клеток культуры обеспечивают отношение поверхности к объему 1-5 см2 эндотелия на мл крови, который не является достаточным для естественных, эндотелия опосредованной антикоагуляционную. Культивирование эндотелиальных клеток на microcarrier бисер может увеличить отношение поверхности кобъему/2мл 40-160 см. Это увеличение соотношения достаточно для обеспечения «естественных» антикоагуляционную цельной крови, так что можно избежать использование антикоагулянтов. Здесь описан в пробирке microcarrier систему на основе для изучения последствий генетической модификации свинину эндотелиальных клеток на свертываемость крови человека целиком, не антикоагулянтом. В описанных assay, первичный свинину аорты эндотелиальных клеток, либо дикого типа (WT) или трансгенных человеческих CD46 и Тромбомодулин, были выросли на microcarrier бусы и затем подвергается свежезаваренным нарисованные не антикоагулянтом человеческой крови. Эта модель позволяет измерение и количественное определение цитокинов выпуска, а также активации маркеры дополняют и коагуляции в плазме крови. Кроме того визуализация активированного эндотелиальных клеток и отложения иммуноглобулинов, дополнением и коагуляции белков на эндотелизированных бусины были исполнены confocal микроскопии. Этот assay может также использоваться для проверки наркотиков, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. На вершине ее потенциал, чтобы уменьшить количество животных, используемых для таких расследований описанных assay легко выполнять и последовательно воспроизводимость.

Введение

Эндотелия состоит из монослоя эндотелиальных клеток (ЕС), которые линия просвета кровеносных сосудов. В состоянии физиологического покоя EC отвечает за поддержание антикоагулянт и противовоспалительными среды. 1 это опосредовано выражением антикоагулянт и противовоспалительными белков на поверхности ЕС. Например, ЕС активации, вызванные ишемии/реперфузии травмы или сосудистая неприятие (xeno-) пересадки органов результаты изменения эндотелиальных поверхности от антикоагулянт и противовоспалительными состояние про коагулянта и про воспалительных состояние. 1

Для изучения увлекательный и сложные взаимодействия между эндотелия и коагуляции факторы, в пробирке модели, которые имитируют как максимально близко в естественных условиях ситуация весьма желательно. Общие ограничения, которое характеризует обычные в vitro коагуляции анализов является использование антикоагулянтом крови, что делает анализ коагуляции опосредованной эффекты напряженных и даже recalcification citrated цельной крови невозможно воспроизвести результаты получить свежие номера антикоагулянтом кровью. 2 Кроме того, в системах культуры традиционных безбортовой ячейки невозможно эксплуатировать антикоагулянт свойства эндотелия, как не может быть достигнуто достаточно эндотелиальных клеток поверхности на единицу объема крови. Модель, представленная здесь преодолевает эти ограничения, культивирование ЕС на поверхности сферического microcarrier бусы, так что отношение поверхности к крови EC > 16 см2/мл может быть достигнуто, которая похожа на ситуацию в небольших артериол или Вены, и который был описан быть достаточным, чтобы позволить «естественных» антикоагуляционную крови поверхности ЕС. 3 , 4 цельной крови может использоваться без добавлена антикоагулянтов в этот параметр. Образцы крови могут быть собраны в ходе эксперимента и цитокины, факторы свертывания крови и растворимых дополнение активации маркеры могут быть обнаружены и количественно. Кроме того EC-покрытием microcarrier бусы могут быть проанализированы для дополнения и иммуноглобулина осаждения, а также выражение маркеров активации EC confocal микроскопии. Другое интересное приложение включает в себя тестирование препаратов, которые должны предотвратить активацию эндотелиальных клеток и, таким образом, коагуляции. 5 хотя эта модель не может полностью заменить экспериментов на животных, он предоставляет метод для проверки конкретных функциональных гипотезы ex vivo с использованием клеток и таким образом уменьшить количество животных, используемых в фундаментальных исследований по ишемии/реперфузии травмы или (xeno) трансплантации.

Описывается модель использовалась для имитации ксенотрансплантации, в котором свинину аорты эндотелиальных клеток (паек) вырос на microcarrier бусы и инкубировали с весь, не антикоагулянтом человеческой крови. Различные трансгенных паек, перевозящих несколько генов человека как CD46 для регулирования системы комплемента и/или Тромбомодулин (hTBM) для регулирования системы коагуляции, были проанализированы на предмет их антикоагулянт свойств. Эндотелиальные клетки активации, дополнением и коагуляции системы плотно контролируются и взаимосвязаны. 6 поэтому важно понять, как различные трансгенных клетки ведут себя после воздействия на кровь человека выражение молекулы адгезии и релиз цитокинов, пролития Гликокаликс и потери антикоагулянт белков. 7

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

свиней породы Ландрас немецкий (дикого типа разводят в местном фермерском доме и трансгенных разводят в институте молекулярной животноводство и биотехнологии, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия), весом от 30 кг до 40 кг, были использованы в Это исследование. Все животные были размещены в стандартных условиях с водой и продовольствием экспромтом. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Закон о животных Великобритании (научные процедуры) и низ руководство для ухода и использования лабораторных животных, а также закон Швейцарии защиты животных. Все исследования на животных соответствует руководящим принципам прибытия. Комитет экспериментов на животных кантональных ветеринарной службы (кантон Берн, Швейцария) одобрил всех животных процедур, разрешение нет. BE70/14. Анестезии искусства и боль управления использовались свести к минимуму количество животных и уменьшения подверженности животных, стресс и боль во время экспериментов и экспериментальные протоколы были уточнены в соответствии с принципами 3R.

кровь была взята из здоровых лиц путем венепункции закрытой системы в соответствии со швейцарской юрисдикции и этики руководство больницы университета Берна. Выражение " не антикоагулянтом крови " означает, что кровь не обращались с любой антикоагулянт.

следующие шаги выполняются в стерильных условиях. Знакомство с основной ячейкой культуры стерильных требуется.

1. изоляция паек

Примечание: от Усыпленных свиней породы Ландрас немецкий 3-6 месяцев возраст (используется для других экспериментов в естественных условиях) и сразу же были получены грудной аорты сегментов 6 до 10 см переведены в 500 мл стеклянной бутылке, содержащие транспортной среды (DMEM + пенициллин/стрептомицина 1%).

  1. Предварительно покрыть 6-ну плита с фибронектин 12,5 мкг/мл в PBS 1 x и поместить его в инкубаторе при 37 ° C за 1 ч.
  2. Предварительно теплые стерильные PBS 1 x и клетки культуры среднего (DMEM).
  3. Брать свинину аорты с транспортной средой.
  4. Место аорты на плиты пенополистирольные.
  5. Нежно заранее промойте теплой PBS.
  6. Продольно разрезать аорты и исправить ее с иголками.
  7. Добавить теплой клеток питательной среды на поверхности внутренний сосуд.
  8. Аспирационная фибронектин клеточной культуры среднего и добавить свежие клетки культуры среднего (с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина 1% и 0,4% эндотелиальных клеток роста среднего дополнение смеси DMEM).
  9. Замочить один ватный тампон в среде культуры клеток. Тампоном осторожно и медленно ваты бутон на самой верхней части поверхности внутренний сосуд в том же направлении.
  10. Руб клетки в одной скважиной пластины 6-хорошо раунд раунд.
  11. Сделать то же самое для остальных скважин.
  12. Проверить клетки под микроскопом и место пластину 6-Ну в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Изменения среды на второй день и изменить его снова каждые 2-3 дня.
  14. Когда клетки собираются быть вырожденная, trypsinize клетки и семян их в колбе T75 (паек P1).

2. Характеристика паек

  1. предварительно покрыть 8-хорошо chamberslide с фибронектин 12,5 мкг/мл в PBS 1 x и поместить его в инкубаторе при 37 ° C за 1 ч.
  2. Семян 5 х 10 4 клетки/Ну и инкубировать на ночь в инкубаторе 37 ° C.
  3. Мыть ячейки дважды с PBS ++ (PBS дополнена CaCl 2 и MgCl 2), 300 мкл/а.
  4. Исправить клетки с параформальдегида 3,7% за 10 мин при комнатной температуре, 200 мкл/а.
  5. Вымыть клетки 3 раза с PBS ++, 300 мкл/а.
  6. Добавить 300 мкл PBS 1 x-3_% BSA (блокирующий буфер) и оставить 30 минут при комнатной температуре.
  7. Применять первичного антитела (анти VE-Кадгерины, анти CD31, анти vWF) разводят в PBS 1x-1%BSA-0.05% моющее средство, 160 мкл/Ну и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  8. Мыть 3 раза с PBS ++ (200 мкл/а).
  9. Применять вторичные антитела и DAPI разводят в PBS 1x-1%BSA-0.05% моющее средство, 160 мкл/хорошо и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  10. Мыть 3 раза с PBS ++ (200 мкл/а).
  11. Монтировать слайды с глицерином на основе монтажа средних и проверять маркеры выражение эндотелиальных клеток под микроскопом флуоресцирования.
    Примечание: Культура свинину аорты эндотелиальных клеток в T175 колбу (DMEM глюкозы низкий средний + 10% FBS, пенициллин/стрептомицина 1% и 0,4% эндотелиальных клеток роста среднего дополнение смеси) до 90% слияния будет достигнута. (заполнение плотность 1 x 10 6 клеток, 90% слияния соответствуют примерно 5 х 10 6 клеток).

3. Покрытие из бисера Microcarrier

  1. Mix 7 мл microcarrier бусы с 42 мл раствора коллагена в 50-мл (100 мкг/мл, разбавленных в 0,2% раствора уксусной кислоты) и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  2. Мыть бусины два раза с 25 мл PBS рН 7,4 (Добавить 25 мл PBS, хорошо перемешать с пипетки и ждать, пока бисер обосновалась затем удалить супернатант и повторить) и один раз с 25 мл среды DMEM.
  3. Покрытия бисера в 50-мл пробирку с 10 мл среды 199 с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина 1%, 1% L-глютамином, 0,4% эндотелиальных клеток роста среднего дополнение смеси и 25 мкл гепарина (5000 МЕ/мл) и позволяют уравновешивания 10 мин перед дальнейшим использованием.

4. Сбор клетки

  1. удалить средство культуры клеток от T175 флакон, содержащий паек и добавьте 5 мл PBS рН 7,4.
  2. Удалить PBS из колбы T175.
  3. Добавить 5 мл Trypsin-0.05% ЭДТА и Инкубируйте 3-4 минут при 37 ° с.
  4. Собирать клетки, промыв флакон 15 мл среды культуры клеток и передачи подвеска в 50-мл.
  5. Центрифуга клетки на 1200 x g 8 мин при комнатной температуре, удалить излишки среднего и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл среды культуры клеток.

5. Заполнение ячеек в колбу мешалка

  1. добавить 20 мл среды культуры клеток в суспензии клеток и Ресуспензируйте.
  2. Добавить ячейки 20 мл питательной среды (без клетки) в флакон 500 мл магнитной мешалкой.
  3. Добавить клетки промывают microcarrier бусы из шага 3.3 и тщательно перемешать с 25 мл Серологические Пипетки.
  4. Передача смеси бусы/cell в колбу магнитный волчок.
  5. Промыть 50 мл с 10 мл клеток питательной среды для сбора оставшиеся ячейки.
  6. Добавить еще 85 мл среды культуры клеток в колбу спиннер и поместить его в инкубатор на ночь при 37 ° C на шейкере (100 x g, смешивая интервал: 3 мин каждые 45 мин).
  7. Добавить 50 мл среды культуры клеток (общий объем 200 мл) и продолжать перемешивание на дополнительные 24 часа при 37 ° C на шейкере (100 x g, смешивая интервал: 3 мин каждые 45 мин).
  8. Добавить бесцветный RPMI среднего (с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина 1%, 1% L-глютамином, 0,4% эндотелиальных клеток роста среднего дополнение смеси и 25 мкл гепарина) вплоть до 320 мл общего объема.
  9. Заменить носитель каждые 48 h: удалить 100 мл старой среды и добавить 100 мл свежих дополнениями бесцветный RPMI.
  10. Культура клетки для 5-7 дней. Время зависит от состояния слияния клеток покрытием бусины.
< класс p = «Джоve_title «> 6. Проверка слияния

  1. собирать 200 мкл клеток покрытием бусы с помощью пипетки и передачи их в полипропиленовых труб.
  2. Мыть бисер 3 раза с 600 мкл PBS 1 x (добавить PBS, наклона трубки и смесь осторожно, чтобы избежать отряд клеток, подождите бисер успокоиться, отменить PBS и повторить).
  3. Исправить бисер на 10 мин, добавив 200 мкл parapicric кислоты.
  4. Вымойте 3 раза с 600 мкл PBS 1 x.
  5. Добавить DAPI разводят в PBS 1 x и инкубировать на 10 мин
  6. Передачи бисер на слайде стекла и применить coverslip, с использованием средств крепления на основе глицерина.
  7. Визуализировать бусины под конфокального микроскопа.

7. Экспериментальная процедура

  1. Удалить ячейки покрытием бусы из магнитной мешалкой колбу (процедуры не должны осуществляться в условиях стерильности) с 10-мл Серологические Пипетки и перенести их в раунд дно 12 мл полипропиленовые пробирки.
  2. Пусть бусы успокоиться (около 1-2 мин) и удалите избыток среднего.
  3. Добавить больше шариков для труб до тех пор, пока каждая трубка содержит точно 2 мл бисера.
  4. Добавить 5 мл ясно RPMI к каждой пробке и смешайте тщательно с помощью Пипетки серологические 10-мл.
  5. Пусть бусы успокоиться и удалите избыток среднего.
  6. Стирки повторить еще раз с RPMI и удалить все избыточные среднего.

8. Инкубация с Non антикоагулянтом крови

  1. тщательно и медленно (с использованием реактивных ни вакутайнеров) рисовать крови от здоровых добровольцев и сбор в 9 мл нейтральной полипропиленовые трубы (не антикоагулянт).
  2. Медленно передачи 8 мл крови серологические пипетки 10 мл в каждую из полипропиленовые пробирки, содержащие 2 мл клеток покрытием бусины (общий объем будет 10 мл). Всегда Избегайте грубой обработки крови или бусины, чтобы избежать преждевременной активации ЕС. Процедура занимает 1-2 мин
  3. Осторожно наклоните смесь крови/шарик обеспечения равных смешивания и опечатать крышку с парафином фильм.
  4. Место трубы на горизонтальной наклона таблицы (с нежным наклона только параметры) внутри инкубатора 37 ° C и запись свертывания раз.
    1. Промежутки времени, например после 10, 20, 30, 50, 70, 90 мин, удалите по крайней мере в 1,5-2 мл смеси крови шарик для сыворотки или плазмы анализа.
      Примечание: для 6 точек времени мы предлагаем, имеющих более чем 3 реплицирует в пределах одной группы клеток, как забор крови будет осуществляться в разных пробирках.
    2. Для сбора сыворотки, оставить крови свертываться. Для сбора плазмы, добавить ЭДТА или цитрата 2 мл трубки перед добавлением образцы крови.
    3. Хранить трубы на льду, центрифуги на 2500 x g 10 мин при температуре 4 ° C и хранить сыворотки/плазмы при 80 ° C до использования.
      Примечание: Подробная информация по материалам приводится в Таблице материалов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 7-10 дней культуры в колбу счетчика (рис. 1) клетки были вырожденная, охватывающих всю поверхность microcarrier бусины (рис. 2). Проверка confluency государства представляет собой важный шаг, потому что без притока монослоя ЕС на микрошарики приведет к заметному снижению время свертывания, учитывая microcarrier бусы поверхность сильно про коагулянта (свертывания время: 4 ± 1 мин) ( Рисунок 3).<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель, представленная здесь подходит для коагуляции соответствующих исследований, позволяя анализ различных аспектов коагуляции и его взаимодействие с ЕС. 8 в ксенотрансплантации исследований, это удобная система для тестирования антикоагулянт свойства различных генетически модифицированных свиней ECs после инкубации с человеческой крови 9.

Наиболее важные шаги протокола являются те обеспечение охвата полным клеток (confluency) микрошарики перед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF, Грант № 320030_156193). Авторы благодарят доктор Бенуа Werlen за предоставление бусы microcarrier Biosilon. Мы также благодарим профессор Ганс Петер Колер и профессор Андре Haeberli за помощь в настройке модели бисера microcarrier.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PAECВыделен из аорты свиньи в наших лабораторных
микроносителях (Biosilon)Thermo Fisher Scientific160-250
Collagen I, BovineGibcoA10644-01
DMEMGibco21885-025
Medium 199SigmaM7528
RPMIGibco32404-014
Нейтральные пробиркиSarstedt02.1726.001
Полипропиленовые тубыSimportT406-2A
Мешалкиколбы Tecnomara
Биологическая мешалкаBrouwerMCS-104S
Rat anti CD31R& D SystemsMAB33871Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3Jackson Immuno Research112-166-003Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherinSanta Cruzsc-6458Dilution 1:100
Rabbit anti vWFDAKOA0082Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488Молекулярные зондыA11055Разведение 1:500
Козий антикролик - FITCSouthern Biotech4050-02Разведение 1:500
DAPISigma32670-25MG-FРазведение 1 &микро; г/мл
0,05% Трипсин-ЭДТАGibco25300-054
FBSGibco10270-106Концентрация: 10% в среде для культивирования клеток
АдаптерSarstedt14.1205
Конфокальный микроскопCarl ZeissLSM 710
Программное обеспечение для анализа изображенийImage JДоступно бесплатно по адресу: https://imagej.net
Добавка для роста эндотелиальных клетокMixPromoCellC-392162 мл в 500 мл DMEM
Пенициллин стрептомицинGibco15140-122Концентрация: 1% в среде для культивирования клеток
L-глутаминGibco25030-024Концентрация: 1% в среде для культивирования клеток
Heparinun natricumDrossa Pharm AGИсходная концентрация: 5000 ЕД/мл
ChamberslidesBioswisstec AG30108
CaCl2 x 2H2OMerck2382.0500
MgCl2 x6 H2OMerck1.5833.1000
Tween 20Axon Lab AG9005-64-5
Бычий сывороточный альбумин (BSA)SigmaA7030
Глицегелевый монтажный носительDakoC0563

Ссылки

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка антикоагулянт и противовоспалительных свойств эндотелиальных клеток с использованием 3D клеточной культуры и не антикоагулянтом цельной крови
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.