Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56256

⸱

23 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Infectious Disease, J. Craig Venter Institute

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод измерения активации Fc опосредованной эффекторных функций антителами, предназначенных гемагглютинина вируса гриппа. Этот assay также может быть адаптирована для оценки способности моноклональных антител или поликлональных сыворотки против других вирусных поверхностных гликопротеинов побудить Fc опосредованный иммунитет.

Аннотация

Антитела играют решающую роль в муфты врожденного и адаптивного иммунного ответа против вирусных патогенов через их антиген связывания доменов и Fc регионы. Здесь мы опишем, как измерить активации ФК эффекторных функций моноклональные антитела против гемагглютинина вируса гриппа с использованием генетически Jurkat клеточной линии, выразив активации типа 1 Fc-с помощью этого метода, FcγR. вклад специфических взаимодействий Fc-FcγR, предоставленных иммуноглобулины могут быть определены с помощью assay в пробирке .

Введение

Иммунитет, предоставляемый вакцины против сезонного гриппа традиционно были оценены гемагглютинации ингибирование (HI) пробирного1, который измеряет наличие антител, которые целевой сайт связывания рецептора гемагглютинина. Эти Привет активные антитела могут наделять стерилизации иммунитет, но обычно узкие в их масштабы защиты, предоставляя иммунитет к только выбрать несколько штаммов вируса гриппа. Выделение и характеристика широко реактивной моноклональных антител, которые признают гемагглютинина (HA) предлагаю развития универсальной вакцины от гриппа в пределах досягаемости2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. одной из основных целей универсальной вакцины от гриппа является сильным антител ответ к сохраняемой регионах гриппа вирус9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. широко реактивной антитела, которые признают эти сохранены epitopes, состоящий из нейтрализовать и не нейтрализуя антитела17,18было показано требуют взаимодействия Fc-FcγR для оптимального защита в естественных условиях и выделить вклад Fc опосредованный иммунитет на общий иммунный ответ на гриппа вирус19,20.

Коррелляты защиты играют решающую роль в оценке иммунитет к инфекции. Эти метрики позволяют ученых и клиницистов, для оценки эффективности вакцин, значение данных и курс лечения. Только установленные коррелятом защиты от инфекции вируса гриппа является пробирного торможение гемагглютинации. Титр 1:40 ассоциируется со снижением риска болезни1,21 – 50% и отражает наличие антител, которые препятствуют склеиванию путем привязки сайта, расположенный на шаровых голову HA рецептора. Однако следует также отметить, что Т-клеток ответов может быть лучше коррелируют защиты от инфекции вируса гриппа в пожилом возрасте. Интересно, что недавний доклад свидетельствует о том, что нейраминидазы ингибирование активности может быть лучше предсказатель иммунитета к гриппа22. К счастью типичных в vitro assays такие, как нейтрализация или нейраминидазы ингибирование анализов можно измерить ха стебель или нейраминидазы специфических антител. Однако, большинство этих обычных в vitro анализов, только принимать во внимание функции регионе связывания антигена антитела и не измерить роль региона Fc. Кроме того вклад-нейтрализующих антител, которые защитить через Fc рецептор участия в естественных условиях , не обнаруженных17,18. Для того чтобы измерить защиты, обеспечиваемой антител, которые индуцируют Fc опосредованный иммунитет как зависимые ячейки при посредничестве цитотоксичности антител (ADCC), необходим надежный в vitro пробирного.

Описанный ниже метод оценивает способность мышиных моноклональных антител побудить Fc опосредованной функций с использованием генетически модифицированных линия клетки Jurkat, выразив активации мышиных типа 1 FcR, FcγRIV. Антитело участие FcγR передает, внутриклеточная сигнализация ядерный фактор что триггеры активированные Т-клетки опосредованной Люцифераза деятельности. Assay имеет ряд преимуществ над традиционными методами, которые требуют изоляции и культуры основных эффекторных клеток и использования проточной цитометрии для выявления активации Fc опосредованной эффекторных функций19,23,24 25, ,26. Во-первых протокол, описанные здесь может быть легко адаптирована для включения различных вирусных цели, FcγRs и антитела от разных видов (человека и мышиных). Во-вторых использование модифицированных клеток Jurkat линия, выражая, FcγR с Люцифераза Репортер ген под ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) позволяет для assay большого формата, который может быть легко проанализирован с помощью пластины читатель измерения люминесценции. Здесь традиционной активации основного эффекторных клеток заменяется индукции NFAT-Люцифераза на антитела участие FcγR на поверхности клетки Jurkat. Этот assay формат 96-луночных пластина позволяет для измерения до четырех различных образцов в triplicates с семи разведения – количество выборок, которые могли бы быть громоздким, с использованием традиционных методов. Есть дополнительные очки рассмотреть этот assay, которые могут повлиять на дизайн экспериментов и интерпретации данных. Вирусная цели должны быть выражены на поверхности клеток, в порядке признания антитела. Чтобы избежать этого, целевой антиген (например внутренних вирусного белка) могут наноситься непосредственно на поверхности плиты. Однако это не еще не протестирована тщательно. Кроме того изменение линии клетки Jurkat выражает только один тип активации FcγR и не выразить любой тормозной FcγRs, в то время как главной ячейки линии Экспресс всех рецепторов в физиологических условиях.

Ранее мы использовали этот assay продемонстрировать что epitope специфики в рамках поликлональных играет решающую роль в регулировании Fc опосредованной эффекторных функций и оптимального активации антител зависимых клеточный ответ требует две точки контакт2827,. Здесь мы описываем метод, который оценивает способность стебель специфических моноклональных антител и активировать Мурина, активация FcγRIV. Хотя есть исключения29,30, большое количество широко реактивной антител целевых регионе антигенно сохранены стебель гемагглютинин и таким образом играют важную роль в развитии всеобщего гриппа вакцина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты, предварительно отформованных в этой рукописи были сделаны следующие Icahn школы медицины в институциональных кодекс этики и правил.

1. выражение гемагглютинина вируса гриппа через Transfection или инфекции

Трансфекция:

  1. Пластина человеческих эмбриональных почек (ГЭС 293T) клетки на плотности 2 х 104 клетки/хорошо в белой культуры ткани лечение 96-луночных пластины и дайте ему сидеть в течение 4 ч в инкубаторе 37 °C (с 5% CO2).
  2. Transfect клетки с 100 нг ДНК кодирования для вирусных гемагглютинин и 0,2 мкл Реагента трансфекции за Ну в общем объеме 50 мкл.
    Примечание: Оба плазмиды и transfectant реагент разводят в 1 x Opti-минимум основных СМИ (MEM) сокращение сыворотке среднего.
  3. После инкубации пластины в инкубатор 37 °C с 5% CO2 для 18 h, удалите трансфекции СМИ.

2. инфекции

  1. Плита A549 или Darby Мадин собак почечных клеток на плотности 2 х 104 клетки/хорошо в белой культуры ткани лечение 96-луночных пластины и расти по крайней мере 18 ч 37 °C инкубатор с 5% CO2.
  2. Разбавить вирус в 1 x MEM и заразить клетки на разносторонности инфекции 3, 1, или 0,33 за 1 ч в инкубаторе 37 °C с 5% CO2. Общий объем должен быть равен 100 мкл.
    Примечание: 10 x MEM разбавляется с водой, чтобы сделать 1 x MEM рабочей сток для разбавления вирус, упомянутых выше.
  3. После заражения, удалите посевным материалом и добавьте 100 мкл 1 x мем в пластину в отсутствие трипсина.
  4. Растут инфицированных клеток для 18-24 ч, 37 °C инкубатор с 5% CO2.

3. Оценка FcRg/NFAT-опосредованной активации деятельности Люцифераза моноклональные антитела или сера

  1. Во-первых замените средства роста transfected или зараженных клеток 25 мкл пробирного СМИ (1 x RPMI 1640 с 4% (vol/vol) низкая IgG плода говядину сера).
  2. В отдельную тарелку 96-луночных выполняют четырехкратное разведений антител интерес, начиная с 30 мкг/мл, с помощью анализа СМИ. Выполните разведений в triplicates и макетом плита пример иллюстрируется на рисунке 1A. Убедитесь в том включить элемент управления, что исключает антитела (без управления антитела), а также фон управления (только Пробирная буфера).
    Примечание: для обоих «не антитела» и фона элементов управления, добавить 25 мкл аналитического буфера вместо антитела.
  3. Передать 25 мкл антител серийно разреженных от шаг 3.2 соответствующие скважин на табличке transfected клеток или инфицированных клеток.
  4. Инкубируйте пластины в инкубатор 37 °C (с 5% CO2) за 15 мин.
  5. Добавьте 25 мкл соответствующие модифицированных эффекторных Jurkat ячейки, выражая мышиных FcgRIV или человеческого FcgRIIIa (75000 клеток/хорошо). Общий объем для каждого должно быть 75 мкл и начальный конечная концентрация антител в 10 мкг/мл (рис. 1B).
    Примечание: Для фона элемента управления, добавьте 25 мкл аналитического буфера вместо эффекторных клеток. Для изучения антитела зависимых клеточный фагоцитоза, может использоваться измененные ячейки Jurkat выражением человеческого FcgRIIa.
  6. Инкубируйте пластины в 37 ° C инкубатор с 5% CO2 на 6 ч.
  7. Оттепель и теплых Люцифераза субстрата буфер в воды 37 °C около 1 часа перед использованием.
    Примечание: Чтобы сделать буфер субстрата Люцифераза, воссоздания лиофилизированные Люцифераза пробирного субстрат в Пробирной буфер, предоставленный. Восстановленный субстрата буфер может храниться при-30 °C до-10 °C до шести недель.
  8. Добавление 75 мкл/хорошо Люцифераза субстрата буфера для всех скважин за исключением фона элемента управления.
  9. Читайте на люминометра.
  10. Рассчитать индукции сложить с помощью следующего уравнения: Сложите индукции = (индуцированные значение фона значение) / (стоимость фона значение не МАБ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы продемонстрировали, что стебель конкретных МАБ, 6F12, но не голова конкретных конкретного головы МАБ, PY102, смогла активировать первичной естественных клеток-киллеров по upregulating CD107a и интерферона гамма19. Для моделирования стебель специфические антитела способность активировать первичных человеческих НК-клеток, мы показываем, что стебель конкретных МАБ, 6F12, энергично можно активировать модифицированных клеток Jurkat, выражая мышиных FcγRIV, ~ четырнадцатикратное. С другой стороны рук...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный здесь позволяет измерить ха специфических моноклональных антител способность привлекать мышиных FcγRIV. Цель антигена, гемагглютинина вируса гриппа, выражается на поверхности клеток после заражения вирусом или трансфекции плазмидной ДНК. Assay далее поддается с использованием различных вирусных белков, поверхность выразил в сочетании с другими FcγRs (людей или Мурина). Кроме того, мы использовали образцы сыворотки для оценки способности в контекст поликлональных антител побудить ФК эффекторных функций (д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ячейки А549 ATCCCCL-185Аденокарциномные альвеолярные базальные эпителиальные клетки человека
HEK 293T клеткиATCCCRL-3216Эмбриональные клетки почек человека
Липофектамин 2000Life Technologies 11668019Реагент для трансфекции
1X Opti-MEM Восстановленная сыворотка MediumThermoFisher Scientific51985-034
Культура белых тканей обработана 96-луночнымпланшетом Corning, Inc. 3917Планшеты
для анализа 10X MEMGibco11430-030
Jurkat cell экспрессирующие мышиные клетки FcgRIVPromegaM1201Набор включает клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferasese, 1X RPMI и сыворотку с низким уровнем IgG
Jurkat cell экспрессирующую человеческий FcgRIIIaPromegaG7010Набор включает клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferasese, 1X RPMI и сыворотку
с низким уровнем IgGНабор Jurkat cell экспрессирующий человеческий FcgRIIaPromegaG9901включает в себя клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI и сыворотку с низким уровнем IgG
Люминометр BioTekSynergy H1 Multi-ModeReader Люминесцентный планшет Система
анализа Bio-Glo Luciferase PromegaG7940Содержит буфер для анализа люциферазы и субстрат анализа люциферазы
Клеткипочек собак Madin DarbyATCCCCL-34Клетки почек собак

Ссылки

  1. Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
  2. Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942(2008).
  3. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  4. Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
  5. Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
  6. Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
  7. Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
  8. Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
  9. Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).
  10. Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
  11. Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
  12. Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95(2016).
  13. Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
  14. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
  15. Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
  16. Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
  17. Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
  18. Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).
  19. DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
  20. DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
  21. Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
  22. Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417(2016).
  23. Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
  24. Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
  25. Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
  26. Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
  27. He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
  28. Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225(2016).
  29. Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
  30. Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
  31. He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610(2015).
  32. Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
  33. Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
  34. Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
  35. de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
  36. Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ADCCJurkat FcFcin vitro
Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.