$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
этот протокол следует эксперименты, утвержденных в: (1) люди Комитет этики Монаш медицинский центр, и (2) животных Комитетом по этике университета Мельбурна.
1. макрофаги Бронхоальвеолярный лаваж (BAL)
- использования бал для получения легких макрофагов в: (1) человека предметов, бронхоскопия 6 и (2) мышах с использованием внутри трахеи стремление 13 .
Примечание: Приобретение макрофаги обычно вызывает некоторые активации этих клеток. Макрофаги получаются от пациентов, которые требуют бронхоскопии расследовать потенциальные медицинские проблемы, и не все предметы могут быть пригодны для анализа Мец (это нужно будет определяться для каждого конкретного проекта).
- Взять на бал решения и спин вниз (500 x g 10 мин) в форме гранул, мыть дважды с питательной среды (Розвелл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с сывороткой плода теленка 5% и 1% L-глютамин) при комнатной температуре и затем разбавить клетки в 4 мл medi культуры ум.
- В случае необходимости, запросить официальное дифференциальных игр; большинство клеток (обычно > 80%) будет макрофаги 6.
Примечание: Это будет обычно осуществляться клинические гистология службы с использованием морфологических появление клеток разных типов 6.
- Выполнять жизнеспособной макрофагов ячейки рассчитывать на бал решения, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
Примечание: Бал получено решение от людей и мышей как упомянуто на этапе 1.1.
- Добавить 1-4 x 10 5 макрофагов в 24-ну пластины на coverslips в 500 мкл питательной среды на колодец и оставить на ночь при 37 ° C; клетки будут придерживаться coverslips. Для человека образцов, добавить антибиотики (например, пенициллина и стрептомицина, 10 4 ед/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.
2. Маркировка/иммунофлуоресценции макрофагов бал
Примечание: клетки соблюдаются на coverslips, как упомянуто выше.
- Удалить питательной среды и вымыть клетки один раз с-фосфатный буфер (PBS). Исправить клетки в 2% параформальдегида/Периодат/Лизин (ПЛП) фиксатором для 10 мин
- Мыть клетки кратко в PBS и затем разрушения в 0,2% 20 анимации в PBS на 20 мин
- Блок клеток с 10% курица Сера в 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) разводят в PBS на 30 мин
Антитела - инкубировать с начальной и изотипа управления за 1 ч при комнатной температуре в концентрации 1: 100 (более подробные сведения приведены в Таблице материалов) при 37 ° с.
Примечание: Для образцов бал, конкретные маркер макрофагов обычно не требуется.
- После добавления первичных антител, вымыть клетки в PBS, далее и инкубировать и с соответствующими вторичные антитела для 40 мин при комнатной температуре.
- Мыть в подразделах PBS и горе с среднего на основе DAPI монтажа для визуализации с помощью конфокального микроскопа (как упоминалось выше) в лазерной возбуждений 405, 488, 561 и 647 Нм и 40 X, 1.0 NA масло цель.
3. Образцы тканей легких
Примечание: в vivo исследований легочной ткани, изучение образцов после соответствующего воздействия (например, как описано в O ' Салливан и др. 7). экспозиции, которая является наиболее актуальной для этого эксперимента являются инфекционные микроорганизмы, особенно бактерии. Мышь штаммов, которые могут быть использованы для данного метода являются мышей C57BL/6 или BALB/c, 10-12 недель, вес 25-30 г и мужчины.
- Euthanize мышей, через внутрибрюшинного введения кетамин (400 мг/кг) и ксилазина (40 мг/кг). Откройте грудной полости и разоблачить легких и сердца с помощью Щипцы хирургические и ножницы.
- Влить теплую PBS с помощью 21-иглы в правый желудочек промыть крови из сосудов для 30 сек, затем влить 10 мл 2% ПЛП фиксатором для 30 s (в правый желудочек).
- Использовать теплый PBS (42 ° C) для промывания открытой грудной полости. Интубации трахеи с 21-иглы и кусок трубы 0,8 мм, нарезанные по размеру и придать 800 мкл подогретым (до 42 ° C), легкоплавких пункт 3% раствор агарозы.
- Галстук покинуть трахеи с плетеные шелковые (4.0 USP). Поместите нить вокруг трахеи, чуть ниже точки вставки канюля и закрепите его через простой зашитый узел. Чтобы укрепить агарозы, администрировать ледяной PBS вокруг легких. Удаление легких и сердца как блок из грудной полости, используя ножницы и тупым рассечение. Удаление каждого легкого индивидуально и исправить их для 16 h в 2% ПЛП или формалина в 4 ° C.
- Хранить образцы в PBS на 4 ° C до разрезания ткани. Эти методы для получения легочной ткани были ранее описанных 13.
- Подготовить легочной ткани образцы выполните следующие действия.
- Исправить ткани легких тканей (резецируется шаге 3.1) в природных амортизированное формалина 10% за 24 ч при комнатной температуре. Трансфер в 75% этанола и положить в процессоре ткани на 12 h цикла, (2,5 ч в 75% EtOH, 3 h в абсолютной EtOH, 3.5 h в жидкостной 3B и 3 h в парафин).
- Вставить Стандартный парафин для создания формалин исправлена, парафин врезанных блоков (FFPE), которые хранятся при комнатной температуре.
Примечание: На данном этапе, это обычно удобно вырезать легких разделы для стандартных слайды.
- Сократить разделы легких FFPE толщиной 4-5 мкм, используя микротом и смонтировать на обвинение, покрытые слайды, как описано ранее, O ' Салливан и др. 7
- монтировать слайды, положить 3 капли среднего монтажа на coverslips 60 x 24 мм (размер 1.5), инвертировать слайд на coverslip и вытолкнуть превышение среднего. Герметично печать с лаком и хранить при комнатной температуре.
4. Подготовка/микроскопия образцов ткани легких
- де воск, увлажняет и предварительной обработки образца ткани легких FFPE антигена поиска решения.
- Печь сухой FFPE горки для 60 мин при 60 ° C. Затем положите слайды в ксилоле решение для 30 мин и передачи 70% этанола раствор для 5 мин при комнатной температуре. Промыть в воде из крана.
- Место в жаропрочной пластиковой пленкой и при условии получения HIER-антигена в скороварке 10 мин в 10 м/моль/Л трис, 1 ммоль/ЭДТА рН 9,0. Cool для 20 мин мыть дважды в проточной воде в течение 5 мин на рокер, затем один раз с PBS на качалку.
- Блок с курицей 10% сыворотки в 5% BSA/PBS на 30 минут при комнатной температуре.
- Пятно ткани.
- Определить Мец в макрофагах, добавить первичного антитела (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 1% BSA/PBS для 16 ч при температуре 4 ° C при разбавлении 1/100 (конкретные сведения о суммах антитела, перечислены в Таблице материалов). Мыть два раза с PBS для 5 мин на рокер.
- Достичь Флюоресцентная детекция инкубации с соответствующей средней антител в 1% BSA/PBS для 40 мин при комнатной температуре. Антитела являются: (1) курица анти мышь 488 (зеленый), Коза (2) курица анти 594 (красный), (3) осла анти мышь и 647 (далеко красный).
- Мыть в подразделах PBS и горе с DAPI-содержащих монтажа средних для окрашивания хроматина.
- Получения флуоресцентных изображений с помощью Конфокальная лазерная сканирующая головка, придает инвертированным микроскопом.
- Excite подготовку с 405, 488, 561 и 647 нм лазеры. Захватить один самолет 512 x 512 пикселей изображения, нажав на линии последовательный, выравнивание кнопки (2 линии в среднем) с помощью 20 X 0.1 NA воздуха и 40 X 1.0 NA масло целей.
- Получить по крайней мере десять полей зрения на секцию для анализа и данных для каждого результата (т.е., 10 мощных поля зрения (ВОВЛ) для элемента управления, 10 для стимулировали образца, и т.д., для каждой мыши).
Примечание: Для получения репрезентативной выборки поля целиком, матричная система может использоваться в котором поле делится на различные разделы и для каждой другой образец, же матрица используется для выбора поля зрения (например, поле можно разделить на 9 разделов, и от центра и 4 углах, принимаются два ВОВЛ).
5. Трехмерной (3-D) Imaging Мец
Примечание: как 3-D структуры, Мец, принимая несколько z стек изображений, которые являются восстановленный, может дать ценную информацию.
- Раздел образцов легких от парафиновых блоков, на 200 мкм, с помощью vibratome в амплитуде в 1,8 мм, скорость 0,1-0,5 мм/s.
- Блок легочной ткани с 20% соответствующих сыворотки (10% плода телячьей сыворотки и куриные 10% сыворотки) и затем разрушения в PBS дополнены и 3,75% Тритон-X 100 для 7 ч при комнатной температуре под нежным агитации.
- Пятна в разделах 16 ч при температуре 4 ° C с соответствующих первичных антител (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 200 мкл томах в microcentrifuge трубы (концентрации антитела, перечислены в Таблице материалах).
- Вымойте разделы в PBS, 3 раза за 10 мин до инкубации с соответствующими вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Пятно легких разделы для DAPI (1:5, 000) в растворе для 20 минут, прежде чем Добавление обложки скользит в Микроскоп слайды в PBS.
- Получить флуоресценции изображения с помощью Перевернутый конфокального микроскопа (40 x 1.3 NA) оснащены 405 нм, 440 Нм, 473 Нм, 543 Нм и 635 нм лазеры.
- Запись 3-D z стеки 0,54 микрон толщины с оптимальной z секционирование для цели нефти NA 40 x 1.3.
Примечание: Программное обеспечение, используемое будет варьироваться в зависимости от индивидуальных микроскопа. Пример как программное обеспечение может использоваться для одного Микроскоп приводится в дополнительных файлов 1.
6. Анализ изображений
Примечание: анализ образцов требует использования конкретных изображений программного обеспечения анализа и примеры перечислены в Таблице материалов. Хотя анализ результатов будет зависеть от конкретной программы используется, перечисленные ниже моменты важны.
- Анализ бал образцы
- определить количество макрофагов, выбрав синий канал для DAPI и назначение минимальный размер для ячеек (например, > 18 мкм в диаметре). С помощью соответствующего программного обеспечения, измерять общее количество макрофагов в поля.
- Подсчитать количество ячеек, которые имеют функции ВСТРЕТИЛ наличием внеклеточного хроматина, обнаруженных DAPI с одним выражением других маркеров (например, MMP12, PAD2 и H3Cit).
Примечание: Количество маркеров, которые могут быть проанализированы зависит количество лазеров доступно, но в идеале помимо DAPI, по крайней мере два других маркеры должны быть включены. Другие менее конкретные параметры для ВСТРЕТИЛ выражение (например, количество ячеек с внеклеточного хроматина и расширенного ядро) может быть использован.
- Сравнить ВСТРЕТИЛ выражение в BAL образцы (между управления, дыма и дыма/DNase рассматриваться группами), анализировать как минимум 100 бал макрофагов на сэмпл.
- Для измерения вторичного антитела и изотипа контролировать уровни флюоресценции; измерить минимум 100 клеток в каждом образце для их флуоресценции. Измерить средний уровень фона флуоресценции для каждого маркера (например, H3Cit) с помощью стандартного программного обеспечения.
- Для определения выражения MET, подсчитать количество ячеек с типичной фенотипу (например, внеклеточная хроматина с одним выражением, H3Cit и MMP9) и для каждого MET, измерить уровень флюоресценции маркеров (например, H3Cit и MMP9). Исключить клетки, вырабатывающие Мец, если их окрашивания не был выше управления фон и изотипа.
- Для человека бал образцов, анализировать как минимум 100 клеток для каждого образца для процент макрофаги, которые делают Мец. Для мышиных образцов, как клетки меньше и Мец труднее определить, анализировать большее количество клеток для каждой выборки (например, 200 макрофаги).
- Анализ образцов ткани легких
- для определения наличия Мец в легочной ткани, используйте маркер конкретных макрофагов например F4/80.
- Определить наличие Мец в легочной ткани с помощью совместного локализации F4/80 в клетках, которые выражают внеклеточного хроматина с другими параметрами, перечисленных в разделе 6.1.
- Определяют уровни фона флуоресценции в образцах с вторичные антитела и изотипа элементов управления. Исключить из анализа, что не выше фона Мец.