Методическая статья

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56459

⸱

19 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

В этой статье

Краткое содержание

Макрофагов внеклеточного ловушки являются недавно описан сущности. Эта статья будет сосредоточена на confocal микроскопии методов и как они отображаются в пробирке и в естественных условиях от образцов легких.

Аннотация

Основной метод, используемый для определения присутствия нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) является confocal микроскопии. Мы изменили методы установленных confocal микроскопии визуализировать макрофагов внеклеточного ловушки (Мец). Эти внеклеточные ловушек определяются наличием внеклеточного хроматина с одним выражением других компонентов, таких как зерно протеаз, citrullinated гистонами и peptidyl arginase deiminase (PAD). Выражение Мец обычно измеряется после воздействия на раздражитель и по сравнению с ООН стимулировали образцов. Образцы также включены для фона и изотипа управления. Клетки анализируются с помощью программного обеспечения для анализа четкие изображения. Конфокальная микроскопия может использоваться для определения присутствия Мец как in vitro , так и в естественных условиях в легочной ткани.

Введение

Нейтрофильные внеклеточного ловушки (сетки), были впервые описаны, Бринкманн et al. 1 они преимущественно производятся в ответ на инфекцию (особенно для бактерий) и имеют важную роль в принимающей обороны1,2. Они также были описаны в ответ на неинфекционных заболеваний, в том числе васкулит и системная красная волчанка (СКВ); и с Митоген phorbol 12-myrisate 13-ацетат (PMA)2,3. Недавно было признано, что другие типы клеток может также производить внеклеточные ловушки, включая макрофагов. Внеклеточные ловушки макрофагов (Мец) еще не четко определенной сущности в литературе4,5. Недавно мы создали методы для обнаружения присутствия Мец как in vitro и in vivo6,7. В этой статье будут описаны измерения с помощью конфокальной микроскопии Мец.

Основные черты NETosis, которые отличают его от других сотовых пути (например, апоптоз8) экструзии хроматина в сочетании с: (1) citrullination гистонами (H3Cit)9, (2) совместно выражение гранул протеаз10 и (3) участии peptidyl аргинин deiminase (PAD) 411,12. Макрофаги также выразить H3Cit, гранул протеаз и PAD, и эти функции могут использоваться для определения присутствия Мец.

Мец может иметь особенно важную роль в легких, как макрофагов является доминирующей в альвеолы и авиалинии легкя и первоначальный роль в управлении клеточный иммунный ответ на инфекции/воспаление. Кроме того в то время как большая часть легких является пустое пространство (например, в альвеолы), Мец потенциально способны расширить пространство, в отличие от солидных органов.

Наиболее широко используемый метод для определения наличия сетей является confocal микроскопии. Четко определенный способ измерить Мец еще не существует. Техника для измерения сеток была адаптирована для измерения присутствия Мец в настоящем Протоколе. Основные требования для данного метода являются доступ к confocal микроскопии и соответствующих изображений программное обеспечение для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

этот протокол следует эксперименты, утвержденных в: (1) люди Комитет этики Монаш медицинский центр, и (2) животных Комитетом по этике университета Мельбурна.

1. макрофаги Бронхоальвеолярный лаваж (BAL)

  1. использования бал для получения легких макрофагов в: (1) человека предметов, бронхоскопия 6 и (2) мышах с использованием внутри трахеи стремление 13 .
    Примечание: Приобретение макрофаги обычно вызывает некоторые активации этих клеток. Макрофаги получаются от пациентов, которые требуют бронхоскопии расследовать потенциальные медицинские проблемы, и не все предметы могут быть пригодны для анализа Мец (это нужно будет определяться для каждого конкретного проекта).
    1. Взять на бал решения и спин вниз (500 x g 10 мин) в форме гранул, мыть дважды с питательной среды (Розвелл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с сывороткой плода теленка 5% и 1% L-глютамин) при комнатной температуре и затем разбавить клетки в 4 мл medi культуры ум.
    2. В случае необходимости, запросить официальное дифференциальных игр; большинство клеток (обычно > 80%) будет макрофаги 6.
      Примечание: Это будет обычно осуществляться клинические гистология службы с использованием морфологических появление клеток разных типов 6.
    3. Выполнять жизнеспособной макрофагов ячейки рассчитывать на бал решения, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
      Примечание: Бал получено решение от людей и мышей как упомянуто на этапе 1.1.
    4. Добавить 1-4 x 10 5 макрофагов в 24-ну пластины на coverslips в 500 мкл питательной среды на колодец и оставить на ночь при 37 ° C; клетки будут придерживаться coverslips. Для человека образцов, добавить антибиотики (например, пенициллина и стрептомицина, 10 4 ед/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.

2. Маркировка/иммунофлуоресценции макрофагов бал

Примечание: клетки соблюдаются на coverslips, как упомянуто выше.

  1. Удалить питательной среды и вымыть клетки один раз с-фосфатный буфер (PBS). Исправить клетки в 2% параформальдегида/Периодат/Лизин (ПЛП) фиксатором для 10 мин
  2. Мыть клетки кратко в PBS и затем разрушения в 0,2% 20 анимации в PBS на 20 мин
  3. Блок клеток с 10% курица Сера в 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) разводят в PBS на 30 мин
    4. Антитела
  4. инкубировать с начальной и изотипа управления за 1 ч при комнатной температуре в концентрации 1: 100 (более подробные сведения приведены в Таблице материалов) при 37 ° с.
    Примечание: Для образцов бал, конкретные маркер макрофагов обычно не требуется.
  5. После добавления первичных антител, вымыть клетки в PBS, далее и инкубировать и с соответствующими вторичные антитела для 40 мин при комнатной температуре.
  6. Мыть в подразделах PBS и горе с среднего на основе DAPI монтажа для визуализации с помощью конфокального микроскопа (как упоминалось выше) в лазерной возбуждений 405, 488, 561 и 647 Нм и 40 X, 1.0 NA масло цель.

3. Образцы тканей легких

Примечание: в vivo исследований легочной ткани, изучение образцов после соответствующего воздействия (например, как описано в O ' Салливан и др. 7). экспозиции, которая является наиболее актуальной для этого эксперимента являются инфекционные микроорганизмы, особенно бактерии. Мышь штаммов, которые могут быть использованы для данного метода являются мышей C57BL/6 или BALB/c, 10-12 недель, вес 25-30 г и мужчины.

  1. Euthanize мышей, через внутрибрюшинного введения кетамин (400 мг/кг) и ксилазина (40 мг/кг). Откройте грудной полости и разоблачить легких и сердца с помощью Щипцы хирургические и ножницы.
    1. Влить теплую PBS с помощью 21-иглы в правый желудочек промыть крови из сосудов для 30 сек, затем влить 10 мл 2% ПЛП фиксатором для 30 s (в правый желудочек).
    2. Использовать теплый PBS (42 ° C) для промывания открытой грудной полости. Интубации трахеи с 21-иглы и кусок трубы 0,8 мм, нарезанные по размеру и придать 800 мкл подогретым (до 42 ° C), легкоплавких пункт 3% раствор агарозы.
    3. Галстук покинуть трахеи с плетеные шелковые (4.0 USP). Поместите нить вокруг трахеи, чуть ниже точки вставки канюля и закрепите его через простой зашитый узел. Чтобы укрепить агарозы, администрировать ледяной PBS вокруг легких. Удаление легких и сердца как блок из грудной полости, используя ножницы и тупым рассечение. Удаление каждого легкого индивидуально и исправить их для 16 h в 2% ПЛП или формалина в 4 ° C.
    4. Хранить образцы в PBS на 4 ° C до разрезания ткани. Эти методы для получения легочной ткани были ранее описанных 13.
  2. Подготовить легочной ткани образцы выполните следующие действия.
    1. Исправить ткани легких тканей (резецируется шаге 3.1) в природных амортизированное формалина 10% за 24 ч при комнатной температуре. Трансфер в 75% этанола и положить в процессоре ткани на 12 h цикла, (2,5 ч в 75% EtOH, 3 h в абсолютной EtOH, 3.5 h в жидкостной 3B и 3 h в парафин).
    2. Вставить Стандартный парафин для создания формалин исправлена, парафин врезанных блоков (FFPE), которые хранятся при комнатной температуре.
      Примечание: На данном этапе, это обычно удобно вырезать легких разделы для стандартных слайды.
    3. Сократить разделы легких FFPE толщиной 4-5 мкм, используя микротом и смонтировать на обвинение, покрытые слайды, как описано ранее, O ' Салливан и др. 7
    4. монтировать слайды, положить 3 капли среднего монтажа на coverslips 60 x 24 мм (размер 1.5), инвертировать слайд на coverslip и вытолкнуть превышение среднего. Герметично печать с лаком и хранить при комнатной температуре.

4. Подготовка/микроскопия образцов ткани легких

  1. де воск, увлажняет и предварительной обработки образца ткани легких FFPE антигена поиска решения.
    1. Печь сухой FFPE горки для 60 мин при 60 ° C. Затем положите слайды в ксилоле решение для 30 мин и передачи 70% этанола раствор для 5 мин при комнатной температуре. Промыть в воде из крана.
    2. Место в жаропрочной пластиковой пленкой и при условии получения HIER-антигена в скороварке 10 мин в 10 м/моль/Л трис, 1 ммоль/ЭДТА рН 9,0. Cool для 20 мин мыть дважды в проточной воде в течение 5 мин на рокер, затем один раз с PBS на качалку.
    3. Блок с курицей 10% сыворотки в 5% BSA/PBS на 30 минут при комнатной температуре.
  2. Пятно ткани.
    1. Определить Мец в макрофагах, добавить первичного антитела (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 1% BSA/PBS для 16 ч при температуре 4 ° C при разбавлении 1/100 (конкретные сведения о суммах антитела, перечислены в Таблице материалов). Мыть два раза с PBS для 5 мин на рокер.
    2. Достичь Флюоресцентная детекция инкубации с соответствующей средней антител в 1% BSA/PBS для 40 мин при комнатной температуре. Антитела являются: (1) курица анти мышь 488 (зеленый), Коза (2) курица анти 594 (красный), (3) осла анти мышь и 647 (далеко красный).
    3. Мыть в подразделах PBS и горе с DAPI-содержащих монтажа средних для окрашивания хроматина.
  3. Получения флуоресцентных изображений с помощью Конфокальная лазерная сканирующая головка, придает инвертированным микроскопом.
    1. Excite подготовку с 405, 488, 561 и 647 нм лазеры. Захватить один самолет 512 x 512 пикселей изображения, нажав на линии последовательный, выравнивание кнопки (2 линии в среднем) с помощью 20 X 0.1 NA воздуха и 40 X 1.0 NA масло целей.
    2. Получить по крайней мере десять полей зрения на секцию для анализа и данных для каждого результата (т.е., 10 мощных поля зрения (ВОВЛ) для элемента управления, 10 для стимулировали образца, и т.д., для каждой мыши).
      Примечание: Для получения репрезентативной выборки поля целиком, матричная система может использоваться в котором поле делится на различные разделы и для каждой другой образец, же матрица используется для выбора поля зрения (например, поле можно разделить на 9 разделов, и от центра и 4 углах, принимаются два ВОВЛ).

5. Трехмерной (3-D) Imaging Мец

Примечание: как 3-D структуры, Мец, принимая несколько z стек изображений, которые являются восстановленный, может дать ценную информацию.

  1. Раздел образцов легких от парафиновых блоков, на 200 мкм, с помощью vibratome в амплитуде в 1,8 мм, скорость 0,1-0,5 мм/s.
  2. Блок легочной ткани с 20% соответствующих сыворотки (10% плода телячьей сыворотки и куриные 10% сыворотки) и затем разрушения в PBS дополнены и 3,75% Тритон-X 100 для 7 ч при комнатной температуре под нежным агитации.
  3. Пятна в разделах 16 ч при температуре 4 ° C с соответствующих первичных антител (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 200 мкл томах в microcentrifuge трубы (концентрации антитела, перечислены в Таблице материалах).
  4. Вымойте разделы в PBS, 3 раза за 10 мин до инкубации с соответствующими вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Пятно легких разделы для DAPI (1:5, 000) в растворе для 20 минут, прежде чем Добавление обложки скользит в Микроскоп слайды в PBS.
  6. Получить флуоресценции изображения с помощью Перевернутый конфокального микроскопа (40 x 1.3 NA) оснащены 405 нм, 440 Нм, 473 Нм, 543 Нм и 635 нм лазеры.
  7. Запись 3-D z стеки 0,54 микрон толщины с оптимальной z секционирование для цели нефти NA 40 x 1.3.
    Примечание: Программное обеспечение, используемое будет варьироваться в зависимости от индивидуальных микроскопа. Пример как программное обеспечение может использоваться для одного Микроскоп приводится в дополнительных файлов 1.

6. Анализ изображений

Примечание: анализ образцов требует использования конкретных изображений программного обеспечения анализа и примеры перечислены в Таблице материалов. Хотя анализ результатов будет зависеть от конкретной программы используется, перечисленные ниже моменты важны.

  1. Анализ бал образцы
    1. определить количество макрофагов, выбрав синий канал для DAPI и назначение минимальный размер для ячеек (например, > 18 мкм в диаметре). С помощью соответствующего программного обеспечения, измерять общее количество макрофагов в поля.
    2. Подсчитать количество ячеек, которые имеют функции ВСТРЕТИЛ наличием внеклеточного хроматина, обнаруженных DAPI с одним выражением других маркеров (например, MMP12, PAD2 и H3Cit).
      Примечание: Количество маркеров, которые могут быть проанализированы зависит количество лазеров доступно, но в идеале помимо DAPI, по крайней мере два других маркеры должны быть включены. Другие менее конкретные параметры для ВСТРЕТИЛ выражение (например, количество ячеек с внеклеточного хроматина и расширенного ядро) может быть использован.
    3. Сравнить ВСТРЕТИЛ выражение в BAL образцы (между управления, дыма и дыма/DNase рассматриваться группами), анализировать как минимум 100 бал макрофагов на сэмпл.
    4. Для измерения вторичного антитела и изотипа контролировать уровни флюоресценции; измерить минимум 100 клеток в каждом образце для их флуоресценции. Измерить средний уровень фона флуоресценции для каждого маркера (например, H3Cit) с помощью стандартного программного обеспечения.
    5. Для определения выражения MET, подсчитать количество ячеек с типичной фенотипу (например, внеклеточная хроматина с одним выражением, H3Cit и MMP9) и для каждого MET, измерить уровень флюоресценции маркеров (например, H3Cit и MMP9). Исключить клетки, вырабатывающие Мец, если их окрашивания не был выше управления фон и изотипа.
    6. Для человека бал образцов, анализировать как минимум 100 клеток для каждого образца для процент макрофаги, которые делают Мец. Для мышиных образцов, как клетки меньше и Мец труднее определить, анализировать большее количество клеток для каждой выборки (например, 200 макрофаги).
  2. Анализ образцов ткани легких
    1. для определения наличия Мец в легочной ткани, используйте маркер конкретных макрофагов например F4/80.
    2. Определить наличие Мец в легочной ткани с помощью совместного локализации F4/80 в клетках, которые выражают внеклеточного хроматина с другими параметрами, перечисленных в разделе 6.1.
    3. Определяют уровни фона флуоресценции в образцах с вторичные антитела и изотипа элементов управления. Исключить из анализа, что не выше фона Мец.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мец могут быть визуализированы бал образцов, в легочной ткани и в толще секций легких с 3-D изображения. Пример Мец, визуализируется в BAL образец показан на рисунке 1. Морфология Мец будет зависеть от стадии их созревания. Первая особенность обнаружению по микроскопии это движение ядра к краю ячейки. Это сопровождается внеклеточного хроматина с другими совместно выразили посредников, таких как H3Cit и гранул протеаз. На более ранних этапах ячейка по-прежнему...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный в данном обзоре основан на который используется для определения присутствия сети14. Макрофаги являются на сегодняшний день доминирующей ячейки типа в образцах бал, и этот метод коллекции особенно подходит для изучения Мец. Если красные кровяные клетки присутствуют в BAL, эти клетки должны анализироваться с использованием хлорида аммония. BAL процедура обычно активирует макрофаги, и поэтому ожидается, что будет Мец в ООН стимулировали образцов. BAL макрофаги обычно очень верна. BAL...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы имеют не раскрытия сделать в связи с этой работой.

Благодарности

Эта работа финансировалась грантов от университета Монаш, национального здравоохранения и медицинский исследовательский совет, Monash легких и сна института. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии в Монаш здравоохранения, Джуди Callaghan, Алекс Фульхерий, Кирстин Elgass и Камден Ло в Монаш микро Imaging (MMI) за помощь с confocal микроскопии изображений, и авторы признают услуги MMI университета Монаш. Авторы признают, зал и научной и технической помощи Монаш гистология платформы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>человеческие образцы: Первичные антитела
Кролик против человека H3Cit (Цитруллин R26)AbcamAB510310 мкг/мл
Кролик против человека MMP12Novus BiologicalNB110-572141:100 концентрация не поддается количественной оценке
Мышиный против человека MMP9Novus BiologicalAB1199061:200 асцит, без концентрации given
Кролик античеловеческий PADI2/PAD2AbcamAB164787 мкг/мл
Мышиный античеловеческий PADI4/PAD4AbcamAB12808610,1 мкг/мл
Овца античеловеческий NELifeSpan BioscienceLS-B424425 мкг/мл
Название>CompanyКаталожный номер>Комментарии<
>Образцы мышей: Первичные антитела
Goat anti-mouse MMP9AbcamAF90910 мкг/мл
Кролик против мыши H3Cit (Citrulline R26)AbcamAB510310 мкг/мл
Крысиный анти-мышь F4/80Собственный (гибридома)В доме20 мкг/мл
Овечий анти-HNE /NESapphire BioscienceLS-B424425 мкг/мл
Мышь античеловеческая и застенчивая; &sted; &sted; &sted; PADI4/PAD4AbcamAB12808610,1 мкг/мл
Super-frost plus слайдыMenzelS41104A
Dapi-prolong goldМолекулярные зондыP36931
Triton-X 100Sigma-Aldrich85111
Хлорид аммонияSigma-AldrichE9434
Name CompanyКаталожный номерКомментарии
Вторичные антитела
Chicken anti-rabbit AF 488/Life technologiesA-21441
Chicken anti-rabbit AF 594Life technologiesA-21442
Chicken anti-goat AF 594Life технологииа-21468
Курица антимышиная AF488Лайф технолоджисА-21200
Осел анти-овец AF 594Лайф технолоджисА-11018
Курица антимышиный AF 647Лайф технолоджиА-21463
Осел анти-овец AF 594Лайф технолоджиА-11016
Контроль
Кролик IgGВ доме
Кролик IgGВ доме
Мышь IgG1BD Bioscience550878
Кролик IgGВ доме
Мышь IgG2aBioLegend400201
ОвцыIgG В доме
<сильный>НазваниеCompanyНомер в каталогеComments
>Software Programs
ImarisBitplane
Image JNIH
Для усреднения интенсивности флуороров можно использовать стандартное офисное приложение, такое как Microsoft Excel
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Микроскопы
C1 Конфокальный сканирующий микроскопNikon
NameCompany<strong>Номер в каталоге<strong>Комментарии<
>Источники тканей
Человеческие образцы BAL из бронхоскопического кабинета в Медицинском центре
МонашаОбразцы БАЛ и легочной ткани мышей с факультета фармакологии Мельбурнского университета.
Name<strong>CompanyКаталожный номер>Комментарии
Media
RPMISigma-Aldrichr8758
Сыворотка для теленка плодаSigma-AldrichF0926
L-глутаминSigma-AldrichG7513
Название>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Другие реагенты
Судан черныйSigma-Aldrich199664
параформальдегид/периодат/лизин (PLP) фиксаторSigma-Aldrich27387
КсилолSigma-Aldrich214736
кетаминSigma-AldrichK2753
Натуральный формалинSigma-Aldrich42904
Парафин Sigma-Aldrich327204
AgaroseSigma-AldrichA2576
растворителя 3BHi-Chem2026
12 млSigma-AldrichS1815
Покровные стекла 60 x 24 млSigma-AldrichC6875
НазваниеCompanyНомер в каталоге>Комментарии
Мыши
c57 черные 6Монаша исследовательская платформа для животных (MARP)
BALB/cMARP
strong изотипа FV1200 Конфокальный сканирующий микроскоп Olympus strong Покровные стекла для

Ссылки

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1(2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371(2015).
  7. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360(2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DAPI

Похожие статьи