Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценки воздействия наркотиков на основе антител на мышиных костного мозга и перитонеальных макрофагов активации

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 декабря 2017 г.

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Препараты на основе антител революционизировал лечения воспалительных заболеваний. Помимо непосредственного воздействия на конкретные цели, антитела могут активировать макрофаги стать противовоспалительное. Этот протокол описывает как противовоспалительное макрофагов активации может быть начисленных в пробирке, с помощью мыши костного макрофагов и в естественных условиях, используя перитонеальных макрофагов.

Аннотация

Макрофаги являются фагоцитирующих врожденные иммунные клетки, которые инициируют иммунных реакций к патогенам и содействовать реституции исцеления и ткани. Макрофаги одинаково важны в отключение воспалительных реакций. Мы показали, что макрофаги стимулируется с внутривенного иммуноглобулина (IVIg) может производить большое количество противовоспалительных цитокинов, интерлейкин-10 (IL-10) и низкий уровень провоспалительных цитокинов в ответ (бактериальных липополисахаридов LPS). IVIg является поливалентная антитела, главным образом иммуноглобулина Gs (IgGs), пул из плазмы крови доноров, более чем 1000. Он используется для дополнения антител у больных с нарушениями иммунной или для подавления иммунной реакции у больных аутоиммунным или воспалительные условий. Также было показано, что инфликсимаб, терапевтические противоопухолевый некроза фактор альфа (TNFα) антител, активация макрофагов для производства Ил-10 в ответ на раздражители, воспалительные. IVIg и другие биопрепаратов на основе антител может испытываться для определения их воздействия на активацию макрофага. Этот документ описывает методы деривации, стимуляции и оценки мышиных костного Макрофаги активируются антител в пробирке и мышиных перитонеальных макрофагов, активированный с антител в естественных условиях. Наконец мы продемонстрировать использование Западный blotting для определения вклада конкретных ячеек, сигнальные пути противовоспалительные макрофагов деятельности. Эти протоколы могут использоваться с мышами, генетически модифицированных, для определения влияния конкретных белки на противовоспалительные макрофагов активации. Эти методы могут также использоваться для оценки ли конкретные биопрепаратов может действовать, изменив макрофагами IL-10-производство противовоспалительных активации государству, которое снижает воспалительные реакции в естественных условиях. Это может предоставить информацию о роли активации макрофагов в эффективность биопрепаратов во время болезни модели мышей и обеспечить понимание потенциальный новый механизм действий в людей. Наоборот это может предостеречь против использования конкретных биопрепаратов на основе антител для лечения инфекционных заболеваний, особенно если макрофаги играют важную роль в принимающей обороны против этой инфекции.

Введение

Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, которые играют многогранную роль в иммунной реакции на инфекции или травмы. Макрофаги являются ответственность за инициирование иммунного ответа на инфекцию или ткани ущерб, остановить воспалительный процесс и содействие исцеления ответ1. Примерами трех лучших изученных макрофагов активации государств являются: 1) макрофагов, относились с гамма-интерферона (IFNγ) и бактериальных липополисахарида (LPS), Места для М (IFNγ + ПЛАСТИНКИ), которые способствуют воспалительный процесс; 2) стимулируется с интерлейкинов 4 (Ил-4), M(IL-4), макрофаги, связанные с исцеления ответ; 3) макрофаги стимулируется с иммунных комплексов (ИК) и ЛПС, M (IC + ПЛАСТИНКИ), которые имеют возможность отключения воспалительной реакции2,3. M (IC + LPS) отличаются от M(IL-4) заживления макрофагов и не выразить фермента arginase (Arg-1) или FIZZ14. Лучшие маркер для этих противовоспалительные макрофагов является их производство цитокинов5. Макрофаги иметь несколько ролей в поддержании здоровья, но также способствовать воспалительных заболеваний и рака3. Из-за этого макрофаги являются ключевых терапевтических мишенью для лечения широкого спектра заболеваний. Важно исследовать эффекты антител на их состояние активации развивать Макрофаг основе лечения болезни.

Этот документ посвящен использованию мышиных костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) и перитонеальные макрофаги проверить влияние наркотиков антител на воспалительные реакции в пробирке и в естественных условиях. Недавно было несколько исследований, показывающих эффекты антител на макрофагов активации6,,78. Макрофаги, совместно активированный с иммунных комплексов, которые являются антитела complexed антигена, и LPS, обычно воспалительных стимул, производят очень высокий уровень противовоспалительных цитокинов, Ил-10 и очень низкий уровень провоспалительных цитокинов, интерлейкина 12 (IL-12)9. Кроме того, инфликсимаб, моноклональные антитела против TNFα было установлено на работу, в части, побуждая противовоспалительные макрофаги через кристаллизующихся региона (Fc) его фрагмент7. Мы уже сообщали, что IVIg + LPS побудить противовоспалительные макрофагов активации, которая похожа на М (IC + ПЛАСТИНОК), которой совместно стимулировать макрофаги производят большое количество Ил-10 и низкое количество провоспалительных цитокинов Субблок интерлейкина 12 или 23 p40 ( IL-12/23p40), интерлейкина-6 (IL-6) и ФНО8. IVIg – это препарат, состоящий из поликлональных антител, главным образом IgG, который были объединены из крови более чем 1000 доноров10. Он используется для лечения широкий спектр иммунологических заболеваний, таких как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хронический демиелинизирующий полинейропатия, однако механизм его действия является не полностью понял11. Влияние препаратов на основе антител на активацию макрофага можно оценить с помощью методов, описанных здесь.

Влияние конкретных биопрепаратов на активацию макрофага можно протестировать в BMDMs и перитонеальных макрофагов. Использование этих источников макрофагов позволяет оценки начальной клеток. Предварительного тестирования антител на культивируемых клеток первичного требует меньше времени и денежных инвестиций, чем другие модели трудоемким и дорогим болезни. Инъекционных наркотиков в здоровой мыши в естественных условияхи изоляция клетки и анализируя их ex vivo, можно определить, если исследования необходимы для оценки ли лечение с biologics влияет активация макрофагов в модели заболеванием.

С несколько исследований, непосредственно тестирование влияния биологических методов лечения на активации макрофагов в пробирке и в естественных условиях наши методы обеспечивают преимущество над альтернативные методы. Современные методы включают тестирования биологических наркотиков эффекты на смешанных клеток населения в пробирке, например эффект инфликсимаба в смешанных лимфоцитов реакции (MLR) или IVIg на человека макрофагов в мононуклеарных клеток периферической крови, где эффект нельзя отнести к определенной ячейке тип7,12. С помощью BMDMs и перитонеальные макрофаги выгодно над использованием клеточных линий, таких как RAW264.7 клетки, которые не производят провоспалительных цитокинов, Ил-12, в ответ на LPS8,13. Влияние препарата на основе антител на макрофагов ответов ex vivo тестирование имеет преимущества, потому что цитокина ответы можно отнести непосредственно макрофагов, вместо того, чтобы выведение ответы макрофагов, измеряя уровни цитокина сыворотки14 . BMDMs и перитонеальных макрофагов могут быть получены и изолированы от генетически модифицированных мышей, чтобы определить конкретную роль белка в активации противовоспалительные макрофагов. Например, мы использовали Il10 несовершенным(- / -) BMDMs продемонстрировать, что ВВИГ индуцированной снижение производства провоспалительных цитокинов частично зависит от Ил-108. Механизм действия препарата могут быть исследованы с помощью Западный blotting, где роль специфических белков и сигнализации событий может быть определена. Количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут выполняться на BMDMs или перитонеальных макрофагов, чтобы показать закономерности экспрессии генов в результате активации антитела. Заболевание модели мышей может предоставить информацию о потенциальной эффективности на основе антител биологической терапии в модели для таких болезней как воспалительных кишечника болезнь, ревматоидный артрит и рака15,16, 17. Однако, описанные здесь методы представит информацию о механизме действия этих биопрепаратов путем определения ли они побудить противовоспалительные макрофагов деятельность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Британской Колумбии.

1. костного макрофагов дифференцирование и активация с антителами

  1. Выполните эвтаназии, используя CO2 удушья.
    1. Место мыши в камере индукции. Усыпить мышь с 5% изофлюрановая анестезии, для 60-90 сек, до тех пор, пока немобильные и дышать глубоко и медленно.
    2. Выключить изофлюрановая анестезии и управлять 6-8 Л/мин CO2 , пока мышь перестала дышать. Оставьте мышь с CO2 на по крайней мере еще 5 минут проверить что это больше не сердцебиение или дыхания. Выполните шейки матки дислокации для обеспечения смерти.
      Примечание: 8-12 недель старых мышей обеспечивают наибольшую доходность макрофагов.
  2. Спрей мыши ноги с 70% этиловом спирте и закрепите их с руки и ноги протянул в лежачем положении на доску пены. С ножницами и щипцы для кожи сделать мелкий разрез (0,2 см) для удаления кожи и меха от поверхности каждого из задних ног.
    Примечание: Выполните эту процедуру и все культуры тканей манипуляции в стерильных Худ.
  3. Трим мышцы, чтобы сделать видимыми tibias и бедра. Удаление tibias и бедра, путем разрезания костей и мышц, чуть ниже тазобедренного сустава и выше лодыжки. Обрежьте как можно столько мышц.
  4. Спрей кости с 70% этанола и подождите 1 мин для того, чтобы испарился, а затем поместить их в 6 хорошо пластину заподлицо среды кость (Iscove модифицированный Дульбекко средний (IMDM), 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)).
  5. Обрежьте концы костей, резки 0,1 см кости лодыжки и верхней части бедра, так что подвергается полость кости. Убедитесь, что костный мозг является видимым и 26 иглы могут быть помещены в полость кости.
  6. Вырежьте кости и мышцы, чтобы отделить tibias и бедра от коленных суставов. Вставьте 26 иглы, придает шприц 10 мл в полость. Промойте костного мозга в 50 мл Конические трубки с 5 мл кости заподлицо среднего. Потопить два tibias и два бедра, от одной мыши, в каждую пробирку 50 мл.
  7. Пипетка вверх и вниз несколько раз или вихревого костного мозга на медленной скорости разойтись нежно сгустки. Строки костного мозга должны быть разбиты на небольшие (менее 0,5 мм) пятнышки костного мозга. Заполните Конические трубки 50 мл с костью заподлицо средних. Пипеткой содержимое конические пробки в культуру ткани2 75 см лечение колбу и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на 1 ч.
    Примечание: Зрелые макрофаги и мезенхимальных клеток станет приверженцем колбу и отменены, в то время как желаемого гемопоэтических прародителями оставаться во взвешенном состоянии.
  8. Пипетка в среду с гемопоэтических прародителями в 50 мл Конические трубки. Центрифуга трубки на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл макрофагальный колонии стимулирующий фактор (MCSF) культуры среднего (IMDM, 10% FBS, 5 нг/мл MCSF, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина и 150 мкм monothioglycerol (MTG)).
  9. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева18. Добавьте средне Ресуспензируйте клетки к концентрации 0,5 х 106 клеток/мл, 1,5 х 107 клеток/флакон 30 мл среды и аккуратно Пипетка вверх и вниз. Пипетка 30 мл суспензии в новой колбу культуры ткани лечение2 75 см.
  10. День 4 и 7 день после первоначальной культуры в шаге 1.9 убедитесь, что клетки являются приверженцем и слегка разветвленной с помощью микроскопа светлые области контраст Перевернутый фазы. Выбросите носитель, содержащий ячейки non сторонник. Вымыть клетки с IMDM один раз и добавить 30 мл MCSF питательной среды.
  11. Когда клетки зрелых на 10 день (> 95% положительных F4/80 и Mac-1), снова убедитесь, что клетки являются приверженцем и слегка.
  12. Пластина клетки для стимуляции, вынуть колбу питательной среды и добавить 8 мл фермента бесплатно, на основе ЭДТА клеток диссоциации буфера (Таблица материалов). Инкубируйте клетки для 5 минут при 37 ° C, 5% CO2.
  13. Скрип клетки мягко, с небольшим количеством давления, с помощью стерильных ячейки скребок. Проверьте в Микроскоп, что клетки отсоединяется от поверхности колбы. Пипетка диссоциированных клетки в 50 мл Конические трубки. Промойте колба 3 раза с 5 мл IMDM и бассейн полоскания раствор с клетки, которые были собраны. Центрифуга клетки на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
  14. Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл MCSF питательной среды на 50 мл Конические трубки. Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева18. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 х 106 клеток/мл и пластины 100 мкл суспензии клеток (1 х 105 клеток/хорошо) за хорошо культуры ткани 96-луночных лечить, Пологое дно плиты.
    Примечание: Кости из одной мыши будет генерировать достаточно клетки для 100 скважин. При желании, 1 мл клеток может покрытием в 6-ну пластине (Культура ткани обработанных, плоские внизу). Большее количество клеток (1 х 106 клеток) может быть полезным для анализа западную помарку.
  15. После сторонником, стимулировать двойные или тройные скважин каждый с 10 нг/мл LPS в IMDM, 30 мг/мл IVIg, или IVIg + ПЛАСТИНОК. Для оптимизации реакции можно титруют дозы ПЛАСТИНОК или IVIg. Оставьте двойные или тройные скважин как кератоз элементы управления. Инкубируйте 24 h (37 ° C, 5% CO2).
    Примечание: Повторно покрытием клетки должны придерживаться культуры ткани скважин в течение 1 ч.
  16. Собирать supernatants клетки от каждой скважины в отдельных 1,7 мл microcentrifuge трубы и удалите любые твердые частицы, спиннинг на 10000 x g за 5 мин.
  17. Удалить ячейку супернатанта и не мешать гранулы. Место осветленный ячейки супернатант в стерильных microcentrifuge трубку.
    Примечание: Supernatants клетки может быть assayed для цитокинов ИЛ-10 и цитокина Субблок, Ил-12 / 23p 40, на энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) немедленно или храниться в долгосрочной перспективе-80 ° C. Следуйте ELISA протокол из коммерчески доступных kit (Таблица материалов). Другие провоспалительных цитокинов может быть assayed, как ИЛ-6 и ФНО, как они также сокращен на совместное обращение с ВВИГ + LPS стимуляции по сравнению с стимуляции с LPS только. После стимуляции адэрентных клеток могут быть подготовлены для методов, таких как Западный blotting или количественных полимеразной цепной реакции (Q-ПЦР) 19,20.

2. сложные мышей в Vivo с ВИГ и уборки перитонеальные макрофаги

  1. Вес каждой мыши.
Рассчитайте объем IVIg (100 мг/мл концентрация запасов) необходимо предоставить окончательный дозу 2,5 мкг/кг веса тела для каждой мыши.
Примечание: например, мышь, 20 g, 500 мкл ВВИГ не требуется.
  • Привлечь необходимое количество IVIg в шприц 1 мл стерильного раствора оснащены стерильных 26 манометра. Для управления мышей, которые не получат IVIg администрировать эквивалентной дозы объем стерильных фосфатный буфер (PBS), рН 7,4 вместо IVIg.
  • Загривок мыши с одной стороны, схватив ее кожи задней части шеи с большим и указательным пальцем и удерживая его хвост и задние ноги с помощью остальных пальцев. Наклоните его тело к земле.
  • Поместите иглу под углом 30-40° по отношению к мыши живота, в нижнем правом квадранте, наклона вверх и вставить 1,5 см иглы. Придать IVIg или PBS внутрибрюшинно. Подождите 1 час.
  • Усыпить мышей с 5% изофлюрановая анестезии следуют 6-8 Л/мин CO2 удушья (см. шаги 1.1.1 - 1.1.2), или в соответствии с руководящими принципами этики Института.
  • Значок мыши на доску пены с конечностей, разложить. Спрей частей с 70% этиловом спирте.
    Примечание: Выполните процедуру в стерильных Худ.
  • Сделайте мелкий разрез в коже (0,2 см) с ножницами вдоль средней мышь, чтобы избежать резки брюшной полости. Вытяните брюшной кожу живота мыши, с помощью щипцов, так, что видна накладки брюшной стенки нетронутыми.
  • Залейте 5 мл шприц 5 мл стерильной PBS (рН 7,4). Вставка 25 или 27 манометра в верхней части полости от левой или правой стороне к центру мыши с скос иглы вверх.
    Примечание: Тщательно место иглы в мыши так, что вы не вводите PBS в органы, но, скорее, в перитонеального пространства.
  • Задвиньте жидкость в брюшной полости. Вытащить иглу из полости и массаж брюшины 10 s выбить все ячейки. Вставить иглу в верхней части полости и избежать органов. Собирать и место жидкости промывания, восстановленные в 15 мл Конические трубки на льду.
    Примечание: Для каждые 5 мл жидкости вводят примерно 3,75 мл будут восстановлены.
  • Повторять инъекции и восстановления (шаги 2.8-2.9) 3 раза больше (всего инъекции объем 20 мл), чтобы восстановить 15 мл жидкости промывания в общей сложности. Соберите промывание от каждой мыши в отдельном 15 мл Конические трубки.
    Примечание: После окончательного инъекции, она может быть проще для извлечения жидкости из далеко левой и правой стороны мыши, где накоплен жидкости. Органов вызовет меньше помех с иглой в этой позиции.
  • Спиновые клетки вниз на 300 g x 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл обшивка среднего (IMDM, 10% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина) на мышь покраснел. Количество жизнеспособных макрофагов с помощью Горяева18.
    Примечание: Макрофаги будет немного больше, чем другие брюшной полости клетки. Типичные урожайность-5 x 105 - 1 х 106 макрофагов/мыши с помощью мыши C57BL/6 дикого типа.
    Необязательно: Если большое количество красных кровяных клеток в клетки Пелле, выполните шаг лизиса их удалить, используя буфер lysis красных клеток крови 1 x согласно инструкциям производителя.
  • Ресуспензируйте клетки в покрытие среднего в 1 x 10-6 макрофагов/мл и тарелка 100 мкл в колодец в пластине культуры ткани лечение 96-луночных плоское дно.
    Примечание: Это может быть необходимо бассейн тройные клетки от более чем одной мыши для эксперимента, если с помощью скважин или титрования стимуляторов. Например если один мышь 5 x 105 макрофагов, потребуется 500 мкл обшивка среднего. Там будет достаточно клеток для 5 скважин, или 1 эксперимент в двух экземплярах, с одной дозы ПЛАСТИНОК.
  • Инкубировать клетки за 1 ч при 37 ° C, 5% CO2 разрешить макрофаги стать сторонником. Адэрентных клеток являются перитонеальных макрофагов. Удаление supernatants клетки и клетки не сторонник. Промыть лунки дважды с 200 мкл IMDM (предварительно разогретую до 37 ° C), подождите 10 s и медленно наклона пластины. Замените покрытие среднего. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 за 30 минут до стимуляции.
  • Стимулировать макрофаги с 10 нг/мл LPS в IMDM, или оставить кератоз, как элемент управления. Проинкубируйте 24 ч, собирать и уточнить supernatants клетки (см. шаги 1.16-1,17) для анализа цитокинов ИЛ-10 ELISA. Следуйте ELISA протокол из коммерчески доступных kit (Таблица материалов).
    Примечание: После стимуляции, адэрентных клеток могут быть подготовлены для методов, таких как Западная помарка или ПЦР.

    • 3. сложные мышей в Vivo с ВВИГ + ПЛАСТИНОК и уборки перитонеальные макрофаги

    1. Вес каждой мыши. Рассчитайте объем IVIg (100 мг/мл концентрация запасов) необходимо предоставить окончательный дозу 2,5 мкг/кг массы тела. Рассчитайте количество ПЛАСТИНОК (100 мкг/мл концентрация запасов в IMDM), необходимо предоставить окончательный дозе 0,2 мкг/г веса тела.
      Примечание: например, для мыши 20 g 500 мкл IVIg Стоковый раствор и 40 мкл 100 мкг/мл раствора LPS требуется.
    2. Привлечь необходимое количество IVIg и ЛПС в стерильный 1 мл шприц с стерильных 26 манометра. Для управления мышей, которые не получат IVIg замените стерильные PBS рН 7,4 эквивалентный объем IVIg.
    3. Загривок мыши с одной стороны, схватив ее кожи задней части шеи с большим и указательным пальцем и удерживая его хвост и задние ноги с помощью остальных пальцев. Наклоните его тело к земле.
    4. Место иглу под углом 30-40° по отношению к мыши живота, в нижнем правом квадранте, скос и вставить 1,5 см. Inject IVIg LPS, или PBS + LPS, внутрибрюшинно как в шаге 2.4.
    5. После 1h урожай перитонеальных макрофагов, выполнив шаги 2,5-2.10.
    6. Спиновые клетки вниз на 300 g x 5 мин при 4 ° C. Удаление 1 мл жидкости восстановленные промывание и использовать для Ил-10 и Ил-12 / 23p 40 анализа ELISA согласно инструкции производителя или заморозить при температуре-80 ° C для будущего анализа.
      Примечание: Чтобы гарантировать точное сравнение между процедурами для анализа жидкости цитокина промывание, выполняют 5 мл flushs брюшной полости 4 раза окончательный объем 15 мл. Не все жидкости будут восстановлены с каждым заподлицо.
    7. Как и шаг 2.11 Ресуспензируйте и считать жизнеспособным макрофагов.
      Примечание: Макрофаги будет немного больше, чем другие брюшной полости клетки.
    Типичные урожайность-5 x 105 - 1 х 106 макрофагов/мыши с помощью мыши C57BL/6 дикого типа.
    Необязательно: Если большое количество красных кровяных клеток в клетки Пелле, выполните шаг лизис согласно инструкциям производителя, чтобы удалить их, как в шаге 2.11.
  • Как шаг 2.12, вновь приостановите клетки в покрытие среднего.
    Примечание: Это может быть необходимо для пула клеток от более чем одной мыши для эксперимента. Например если один мышь 5 x 105 макрофагов, потребуется 500 мкл обшивка среднего.
  • Как в 2.13, инкубации клеток для 1 ч при 37 ° C 5% CO2 разрешить макрофаги стать сторонником.
  • Собирать и уточнить кондиционером средний, согласно шаги 1.14-1,15, от всех брюшной полости клетки.
    Примечание: Образцы могут использоваться немедленно или замороженных и температуре-80 ° C для анализа цитокинов, ELISA.
  • Выполните шаг 2.11, но инкубации клеток для 24 h кератоз. Собирать и уточнить supernatants клетки, согласно шаги 1.16-1.17, для анализа ELISA цитокина.
    Примечание: Клетки могут быть подготовлены для таких методов, как Западная помарка или ПЦР, как и шаги 1.16-1,17 и 2.14.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Мышиных костного мозга, полученных макрофаги могут культивированный из гемопоэтических клеток предшественников в пунктаты костного мозга. Пунктаты костного пула от бедра и tibias одной C57BL/6 мыши обычно дают 107 костного мозга, полученных макрофаги, что делает их удобным источником макрофагов для экспериментов. BMDMs может использоваться для тестирования антител на основе наркотиков ответы, когда оспаривается с воспалительным стимул в пробирке. Р...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Макрофагов активации государства играют важную роль в обеих ткани гомеостаза и болезни22. Макрофаги могут иметь собственный, а также перекрытие активации государства, в зависимости от сигналов в их микроокружения3. Они имеют различные роли на всех стадиях воспалительного ответа: оборона против патогенов, РАН реституция исцеления и ткани, а также имеют собственный противовоспалительные активации государство, которое имеет важное значение для выключения воспалительной реакции...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

    Благодарности

    Л.к. является получателем премии выпускник студенчества стипендий (4YF) 4-летнего университета Британской Колумбии. L.M.S. является получателем Канадская ассоциация гастроэнтерологии / крона и колит Канада / КНИИЗ новый следователь оклад премии и биомедицинских ученый Майкл Смит фонда для исследований в области здравоохранения. Эта работа была поддержана грантом проекта от Канадской службы крови, в сотрудничестве с канадской институтов медицинских исследований (Грант # CIHR2016-LS).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Исков s модифицированный Дульбекко' s medium (IMDM)Life technologies12440053
    Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life technologies12483-020
    Рекомбинантный мышиный макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF)Технологии стволовых клеток78059
    Пенициллин-стрептомицинLife technologies15140148
    монотиоглицерин (MTG)Sigma88640
    1X буфер для лизиса эритроцитовeBioscience
    Буфер для диссоциации клетокLife technologies13150016Без ферментов, на основе Хэнкса, ЭДТА
    липополисахарид (ЛПС)Sigma aldrichL 4516Из E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)Грифолыполучены из детской больницы Британской Колумбии, трансфузионная медицина
    Внутривенный иммуноглобулин (жидкость Гаммагард)Baxter Healthcare CorporationПолучен из Детской больницы Британской Колумбии, Трансфузионная медицина
    IVIg (Октагам)OctapharmaПолучен из Детской больницы Британской Колумбии, Трансфузионная медицина
    Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (стерильный), pH 7,4Технологии Life10010023
    мыши IL-10 ELISABDBiosciences 555252
    мышь IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    антитело anti-Erk1/2 Технологияклеточной сигнализации9101
    антитело анти-pp38Технология клеточной сигнализации9211
    антитело против GAPDHFitzgerald industries10R-G109A
    26 г иглаBD biosciences305110
    1 мл шприцBD biosciences309659
    10 мл шприцBD biosciences309604
    15 мл коническая трубкаBD biosciences352096
    50 мл коническая трубкаBD biosciences352070
    микроцентрифужная пробирка (1,7 мл)DiamedSPE155-N
    75 см<суп>2 колба тканевая культура обработанаBD biosciences353136
    Скребок для клетокBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386тонкий наконечник, для препарирования 
    НожницыVWR82027-582Деликатные, 4 1/2"
    Светлопольный микроскопMoticAE31Шкала инвертированного фазового контраста
     Mettler ПЭ 3000

    Ссылки

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    10
    Оценки воздействия наркотиков на основе антител на мышиных костного мозга и перитонеальных макрофагов активации
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.