Здесь мы описываем протокол, который позволяет гистологические и молекулярный анализ образцов кожи после Candida albicans внутрикожные инъекции. Этот протокол поддерживает структурную целостность кожи и позволяет для локализации ткани резидентом или вновь набранных иммунных клеток, а также распространение возбудителя.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Глубокий дермальный инъекции как модель кожи инфекции Candida albicans для гистологического анализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кожа является чрезвычайно длительного органом тела, и, благодаря этой большой поверхности, постоянно подвергается воздействию микроорганизмов. Повреждения кожи может легко привести к инфекции в дерме, которая может в свою очередь, привести к распространению патогенов в кровоток. Понимание как иммунная система борется инфекции на самом раннем этапе и как хост может устранить патогены является важным шагом для задания базы для будущих терапевтических вмешательств. Здесь мы описываем модель инфекции Candida albicans , которая может визуализировать процессы, которые происходят в начале во время инфекции, включая когда возбудитель прошел эпителиальных барьер, а также вызвал C. albicans иммунного ответа вторжения. Мы использовали модель этой инфекции для выполнения гистологические анализы, которые показывают иммунные клетки, которые проникнуть в кожу, а также присутствие и локализации возбудителя. Отбор проб после инфекции могут быть обработаны для извлечение RNA.
Введение
Человеческое тело покрыто чрезвычайно большое количество микроорганизмов. Поверхность кожи обитает почти один миллион бактерий на1квадратный сантиметр. Это число, однако, не отражает полное разнообразие микроорганизмов, что колонизирует кожи. В дополнение к бактерии человеческое тело колонизирована многих грибковых видов, включая C. albicans, которая способна выжить на слизистых оболочек и кожи уровня2.
В последние годы доля людей с диагнозом грибковые инфекции значительно увеличилась. Это объясняется главным образом большее количество лиц с ослабленным иммунитетом, т.е., ВИЧ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) и действует под надзором департамента животноводства на детей в больнице (Арка) в Бостон Детская больница или были утверждены итальянский Министерство здравоохранения и исполнил под организационного комитета уход животных на Университет Милан-Бикокка.
1. Подготовка C. albicans
- Культура C. albicans, штамм CAF3-1-13, в пробирки, содержащие богатый средний (дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YEPD), экстракт дрожжей 1% (w/v), 2% (w/v) Bacto Пептон, 2% (w/v) глюкозы) дополнены уридина (50 мг/Л) при 2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Через инъекции возбудителя непосредственно в глубокой дермы структурной морфологией ткани остается неизменным (рис. 1A).
Поддержания структурной целостности кожи позволяет обнаружение иммунных клеток и их локализация в месте инфекции. Увеличение, показано на рисунке 1B показывает, что абсцесс главным образом состоит из полиморфноядерных лейкоцитов (ЧВК), которые содержа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описали метод C. albicans инфекции для изучения воспалительный процесс, который инициируется при грибковых вход в глубокой дермы.
Несмотря на то, что формирование абсцесса кожи является относительно редким явлением на C. albicans инфекции15, инъекции гриба непосредственно в глубокой дермы позволяет не только изучение формирования грибковых инициативе абсцесса, но и анализ конкретных иммунной клетки, которые участвуют содержат грибковых распрос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
FG поддерживается Associazione Italiana за Ла Ricerca Сул Cancro (IG 2016Id.18842), Фонд Cariplo (грант 2014-0655) и Fondazione Regionale за Ла Ricerca лактулоза (НСФО).
IZ поддерживается NIH Грант 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC Р30 DK034854 Грант, Гарвардской медицинской школы Милтон нашли, CCFA старший исследования награды (412708), Элеонора и миль берега 50-й годовщины программы стипендий и Фонд Cariplo ( 2014-0859).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>реагенты | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | теплым в 37°° C ванна перед применением |
| H-OCT соединение | гисто-линия лаборатории | R0030 | |
| Гематоксилин Гилла | гисто-линия | лаборатории 09-178-2 | |
| Эозин Y раствор, спирт | гисто-линия лаборатории | 09-209-05 | |
| Этанол абсолютный | шарлау | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | гисто-линия лабораторий | R0050 | |
| Eukitt, монтажная среда | био-оптика | ||
| Ацетон | сигма-олдрич | 179124 | |
| система окрашивания PAS | сигма-олдрич | 395B-1KT | |
| Bacto пептон | BD | 211677 | |
| экстракт бактодрожжей | BD | 212750 | |
| D(+)-глюкоза безводная для молекулярной биологии | Апплимен PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock пробирки 2 мл | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | токсичных, коррозионных и мутагенных. Используйте все необходимые меры предосторожности |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| жидкий азот | Носите защиту для глаз | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| strong>Materials | |||
| 0,3 мл Инсулиновый шприц с иглой 30G x 8 мм | BD | 324826 | |
| Хирургические щипцы | |||
| Хирургические | |||
| Базовая форма одноразовая | histo-line laboratories | 2781 | |
| Положительно заряженные биомикроскопические стекла | био-оптика | 09-2000 | |
| Защитные стекла 24 x 50 мм | термонаучные | 11911998 |
Ссылки
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
