Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутривенно и интраамниальной In Utero трансплантации мышиных модели

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58047

⸱

9 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of General, Thoracic, and Fetal Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia, 2Division of Plastic Reconstructive Surgery, Center for Fetal Research, Children's Hospital of Philadelphia

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол для проведения трансплантации в утробе матери (ИТУ) посредством внутривенного и интраамниальной маршруты инъекции в мышиных модели. Этот протокол может использоваться для внедрения клетки, вирусных векторов и других веществ в уникальной иммунной терпимо плода среду.

Аннотация

В утробе матери трансплантации (ИТУ) — это уникальный и универсальный режим терапии, которые могут использоваться для введения стволовых клеток, вирусных векторов или любых других веществ в начале беременности. Обоснование ИТУ для терапевтических целей основывается на небольшой размер плода, иммунологические незрелость плода, доступности и пролиферативной характер фетальных стволовых и прогениторных клеток и потенциал для лечения болезни или появления симптомов до рождения. Принимая преимущества этих обычных свойств развития плода, доставки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) через ИТУ имеет потенциал для лечения врожденной гематологических расстройств, таких как серповидно-клеточной анемией, без необходимости myeloablative или иммуносупрессивные принадлежности, необходимые для послеродового HSC трансплантации. Кроме того доступность прогениторных клеток в нескольких органах во время разработки потенциально позволяет для более эффективной ориентации стволовых/прогениторных клеток после ИТУ вирусных векторов для генной терапии или изменения генома. Кроме того ИТУ может использоваться для изучения нормальных процессов развития, в том числе, но не ограничиваясь, развития иммунологической толерантности. Мышиных модель обеспечивает ценные и доступные средства для понимания потенциал и ограничения ИТУ до доклинические исследования на крупных животных и последующего клинического применения. Здесь мы описываем протокол для выполнения ИТУ в мышиных плода посредством внутривенного и интраамниальной маршрутов. Этот протокол успешно использовался для выяснения необходимые условия и механизмы, лежащие в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, индукции толерантности и в утробе матери генной терапии.

Введение

Последние достижения в пренатальный скрининг и диагностика высветили возможность лечения плода для ряда врожденных расстройств, которые не имеют надлежащего послеродового лечения и приводят к значительным заболеваемости и смертности. В частности в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (IUHCT) и генной терапии/генома редактирования имеют потенциал воспользоваться нормального развития свойств плода для лечения врожденной, гематологические, иммунной и генетических расстройства более эффективно, чем послеродовой трансплантации ГСК и генной терапии/генома редактирования можно сделать1,2. В частности из-за небольшого размера плода, доноров клеток или вирусный вектор доза может быть максимально повышена весу получателя. Кроме того иммунологические незрелость плода позволяет доноров СКК для инъекций без myeloablative и иммуносупрессивные кондиционирования, что требуется в послеродовой трансплантации протоколы. Аналогичным образом вирусных векторов, перевозящих терапевтических трансген или редактирования технологии генома могут быть введены без ограничения иммунного ответа трансген продукта или вирусный вектор. Наконец доступность и пролиферативной характер плода стволовых/прогениторных клеток дают возможность более эффективно трансдукции прогениторных клеток-мишеней, а также определенных видов генома редактирования (ориентированные на гомологии ремонта), которые требуют Велоспорт клетки происходят эффективно. Мышиных модель служит глубокий и доступным средством для решения важных вопросов в клеточной биологии и иммунологии до экспериментировать в доклинических моделях крупных животных и, таким образом, служил в качестве основной модели в которых IUHCT и в матке терапия гена были изучены1,2,3.

Хотя многие переменные играют важную роль в успехе IUHCT и в утробе матери генной терапии/генома редактирования в мышиных и крупных животных моделях, ключевой переменной является метод доставки СКК или вирусный вектор. Доставка больших доз донорских СКК с эффектом первого прохода, происходящих в фетальной печени, гемопоэтических органа во время IUHCT, было показано, быть важную роль в достижении уровня macrochimeric приживления в мышь и большие животные модели4 ,5. Это было достигнуто посредством инъекции доноров клеток через vitelline вен в модель мыши и через укол внутри сердца в собачьей модели. Маршрут впрыска также играет основополагающую роль в ориентации прогениторных клеток различных органов во время разработки. Например внутривенные инъекции через vitelline вен доказано эффективно передают кардиомиоцитов и гепатоцитов после поздней беременности инъекции6,7. Кроме того инъекция интраамниальной вирусных векторов позволяет ориентации органов, которые физически подвергаются во время инъекции8на основе эмбриональных складные/развития. Наилучшим примером является ориентация эпителия дыхательных через инъекцию интраамниальной в конце беременности воспользоваться нормальной движений плода «дышать», который предоставляет дыхательных путей в вирусный вектор в амниотической жидкости9. Эти два режима ИТУ, внутривенно через vitelline вен и интраамниальной, были основой для нескольких прошлых и нынешних экспериментов в нашей лаборатории. В этом протоколе мы подробно описать методы для выполнения внутривенного и интраамниальной ИТУ в мышиных модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные протоколы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в детской больнице Филадельфии.

1. Создание инъекции пипетки

  1. С помощью вертикальной микропипеткой съемник, вытащите 100 мкл микрокапиллярной пипетки (рис. 1а - 1 C). Калибровка съемник микропипеткой, так что остроконечный конец > 1 см длиной.
    Примечание: Первоначально, параметры провокатор должна быть скорректирована для оптимальной длины. Более высокое значение жары сделает больше кончик, и выше параметр тянуть сделает диаметр кончика короче.
  2. Вырежьте остроконечный конец, так что это ≥ 1 см длиной. Убедитесь, что внутренний диаметр на кончике иглы между 70 мкм и 100 мкм и что это обратно пропорциональна длине остроконечный конец.
    Примечание: Внутренний диаметр также зависит от калибровки микропипеткой съемник. Смотрите инструкции от производителя вертикальной микропипеткой съемник или любого типа предпочтительного микропипеткой съемник.
  3. Убедившись, что игла имеет правильный внутренний диаметр, создайте фаски 15-20 градусов, заточка кончик с помощью микропипеткой beveller с алмазной заточки колесо (рис. 2A - 2 C). Убедитесь, что остальные кончик аккуратно на колесо без слишком большое давление, чтобы уменьшить шансы взлома или растрескивания кончик.
    Примечание: Кисть может использоваться, чтобы вытереть любой мусор, который строит на кончик иглы.
  4. Оценивать кончик под микроскопом и убедитесь, что подсказка раунд без чипов или трещин. Пересчитывает внутренний диаметр чтобы убедиться, что он находится между 70 мкм и 100 мкм (Рисунок 2D - 2 Ч).
  5. Рисовать линии на остальной части иглы для обозначения 5 мкл тома между ними (например, иглы с внутренним диаметром 1,3 мм должны иметь линии, нарисованные на 3,77 мм с шагом).
  6. Автоклав предварительного иглы для использования в хирургии и обрабатывать их с стерильных перчаток.

2. инъекции в утробе матери

  1. Подготовка необходимых документов путем автоклавирования их раньше времени. Включают в себя основные инструменты, такие как microinjector иглодержатель, водитель Хирургические иглы, пару Adson щипцы, пара изогнутые регулярных ткани ножницы, шприц 1мл инсулин, пару хлопка наконечник аппликаторы, передачи пипетки, 50 мл Конические трубки и Пакет 4-0 полиглактин 910 швов.
  2. С помощью стерильных, придавать иглодержатель иглы и подключите его в microinjector.
    Примечание: Параметры сжатый азот используется, как следовать: придать 4-6 psi, баланс 0 psi. В зависимости от того, что время вводят, в частности, вязкость injectate, а также размер микропипеткой, раз инъекции варьируются между 0,3 - 1,5 s.
  3. Очистите кончик иглы любых возможных мусора путем разработки 5-10 мкл стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и последующей очисткой. Повторите 2-3 x.
  4. Подготовка беременных самок мышей 2 - 6-месячного хирургии после бритья их животы с клипер. Будьте осторожны, чтобы не повредить соски. Управление устный обезболивающее (например, 100 мкл 1,5 мг/мл Мелоксикам пероральной суспензии на мышь).
  5. Начните заполнение игла с нужный материал (клетки/вектор/наркотиков) на желаемой громкости. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик иглы при заполнении иглы.
    Примечание: Объем инъекции в плода варьируется в зависимости от конкретных экспериментальных дизайн. 20 мкл хорошо работает для инъекционных большое количество клеток (то есть, до 107 клеток в vitelline Вену. К примеру, мы поставляли 1 x 107 всего костного мозга клетки изолированы от C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 [«B6 Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) "] мышей через vitelline вен в гестационный день-14 плодов Balb/c. Для вирусный вектор инъекций единый для инъекций 10 мкл разбавленного вектора 1:1 с PBS работает хорошо.
  6. Для калибровки время впрыска, выполните следующие действия.
    1. Нажмите в режиме кнопка 3 x на microinjector чтобы получить на экране калибровки инъекции. Отрегулируйте время впрыска, добавления интервалов 10 или 100 мс и push в режиме кнопка 2 x.
    2. Нажмите кнопку баланс и один раз нажмите педаль. Теперь снова нажмите педаль и оценить, сколько объем очищается из иглы за толчок. Если не откалиброван на желаемый объем 5-20 мкл на педаль нажима, повторите шаги 2.6.1 и 2.6.2.
      Примечание: Как правило, это хорошо для калибровки каждый толчок, чтобы доставить половины общей целевой объем на один раз. Хотя это можно придать более чем 30 мкл или даже 40 мкл общего объема, мы обычно не идти над 20 мкл на плод, внутривенно или интраамниальной.
  7. Введите иглу до желаемого уровня.
  8. Начало оказания мыши анестезии, регулируя расходомера кислорода до 1 Л/мин и изофлюрановая испарителя до 3%.
  9. Подтверждают ли мышь под наркозом, проверив отсутствие педали рефлекс. Передать мыши грелку в лежачем положении.
  10. Примените гель смазка глаз во избежание высыхания роговицы. Закрепите мыши в место, лентой верхних и нижних конечностей на площадку.
  11. Подготовка живота с хлоргексидином скраб следуют алкоголя и подкожно вводить местный анестетик (например, 100 мкл 0,25% бупивакаин) (рис. 3А).
  12. С ножницами сделать разрез кожи 1-2 см, так, что нижняя граница не ближе 1 см introitus; фасции под очень тонкий и прозрачный.
  13. Определение средней фасции, который является более прозрачным, чем окружающие области. Будьте осторожны, чтобы не нанести вред эпигастрии судов, которые находятся по обе стороны от средней линии. Следует получить травму эпигастральной судов, Держите давление с аппликаторами хлопок наконечник, чтобы остановить кровотечение.
  14. С помощью Adson щипцами, щепотка фасции без захвата любой из основных органов, таких как кишечника, мочевого пузыря или плодов. Откройте фасции с ножницами, стараясь не повредить любого из органов. Однажды безопасно в животе, продлить фасциальных разрез. Сделать его больше не чем разрез кожи.
  15. Использование хлопка наконечник аппликаторы для перемещения кишечника в верхней части живота, таким образом подвергая беременных матки. Доставить матки из разреза, тщательно определить права и левый яичники для обеспечения всех плодов считаются (рис. 3B).
  16. Место левой матки обратно в живот так, что только право матки подвергается; Это предотвращает высыхание матки и держит тепло не вводили плодов.
  17. Держите наиболее боковых плода/Амниотический мешок между большим и указательным пальцами оператора недоминирующей руки (рис. 3C). Всегда будьте мягким, чтобы не причинять ущерб для плодов.
  18. Поместите рассечение микроскоп (10 крат идеально) и отрегулируйте фокус, так что плода в представлении. Отрегулируйте освещение для лучшей визуализации.
  19. Определить часть, которая будет выведена (vitelline вен, амнион). Для внутривенных инъекций Визуализируйте vitelline вен и их анастомоза сначала. Для интраамниальной инъекции Ориентируйте плода с правой стороны в представлении.
  20. Достичь целевого пространства с иглой, как описано ниже.
    1. Для внутривенного введениявыполните следующее.
      1. Вращать матки, так что vitelline вен, который вводится в настоящее время параллельно с кончика иглы; Имейте в виду, что инъекции должны быть сделаны к анастомоза двух вен.
      2. Положите иглу на матки под углом 5° и проткнуть стенку матки. Теперь, кончик между стенке матки и Амниотический мешок, поместите кончик непосредственно поверх vitelline Вену.
      3. На почти тангенциальный угол скользить иглы через Вену до тех пор, пока скоса пронзает и достижений в сосуд; Это видно по flash крови, видели в кончик иглы (рис. 3D).
        Примечание: Доступ к вен может занять несколько попыток, как иглы не могут проколоть Вены с первого скольжения через Вену.
    2. Для интраамниальной инъекциивыполните следующее.
      1. Вращать Амниотический мешок и найти место, лишенный судов для прокалывания.
      2. Пункт иглы перпендикулярно к стенке матки и пробить матки, желточного мешка и затем Амниотический мешок. Будьте осторожны, чтобы не проколоть через любой плода ткани. Убедитесь в том, что игла прошло между конечностей, поскольку это подтверждает, что игла находится в Амниотический мешок. Затем продолжите с впрыской.
  21. Внедрить соответствующий объем желаемого материала (обычно 10-20 мкл) нажатием педали.
    Примечание: Потому что инжектор должен поддерживать визуализации кончик иглы через микроскоп на все времена, второй человек должны прочитать маркировку на иглу для количественного определения вводят объем и сообщить инжектор, сколько объем оставлена для вставки. Обсуждение до инъекции между инжектор и помощник имеет важное значение во избежание любой путаницы и задержки. Это особенно важно для внутривенных инъекций, потому что задержка удаления иглы позволит противотока венозной крови в иглу и привести к неточной дозирования.
  22. Снять иглу от укола, после доставки нужного тома. Как там могут быть некоторые кровотечение из корабля проколы сайт с внутривенной инъекции, держать давление на стороне иглы для 10-15 s, чтобы остановить кровотечение.
  23. Перейти к следующему плода. Продолжайте, пока все плодов право матки рога были введены.
  24. Снимите левый рога матки из брюшной полости и заменить рога право матки назад внутри брюшной полости.
    Примечание: Иногда, иглы должен быть пополнен с нагнетаемой.
  25. После того, как были введены все плодов, замените матку в брюшную полость (рис. 3E). Убедитесь в том избежать матки или кишечника Заворот.
  26. С одноразовой передачи пипетки место примерно 2 мл ПБС в брюшную полость для замены любых бесчувственным потерь.
  27. Закройте фасции и живота в один непрерывный слой с помощью 4-0 полиглактин 910 швов во избежание ранив основных органов во время закрытия (Рисунок 3F - 3 G).
  28. Удалите ленту и передача мыши на клетке под тепла лампы. Будьте осторожны, чтобы не поставить светильник жары слишком близко к мыши. Убедитесь, что клетки постельные принадлежности, продовольствия и воды.
    Примечание: Термостатируемым теплой палата может также использоваться. Мышь не спит, когда это вертикально и пешком.
  29. Ежедневно наблюдать мыши и дать обезболивающее по мере необходимости.
    Примечание: Мы регулярно дают Мелоксикам послеоперационных суток 1 и 2 и иногда на третий день если мыши показывает признаки боли.
  30. Если делать операцию пакета с тем же материалом инъекций, чистота иглу с стерильных PBS. Если инъекций с другого материала, распоряжаться иглы в Шарпс контейнер и использовать новые иглы.
    Примечание: Мы рекомендуем, содействие щенков с суррогатной плотин сразу же после рождения, в случае, если плотина монтирует иммунный ответ на закачиваемой и передачи антител к щенкам через грудное молоко.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выживание и приживления являются важными мерами успеха для IUHCT экспериментов. В зависимости от конкретных конечных точек эксперимента плодов, которые получил IUHCT может быть проанализированы пренатально путем кесарева сечения или постнатально. В среднем показатели выживаемости после инъекции варьируются от 75-100%. Выживаемости после интраамниальной инъекции, как правило, ярмарка лучше чем внутривенные инъекции, около 85-100%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В утробе матери трансплантации является потенциальной терапии для многих врожденных расстройств, которые могут быть диагностированы в начале беременности. Мышиных модель ИТУ позволяет исследователям изучить плода окружающей среды или экспериментировать с различных видов терапии. В зависимости от того, что вводится и что оказывается внутривенно или интраамниальной в утробе матери трансплантации может обеспечить надежную доставку закачиваемой в нужное пространство.

При ориентац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПерчаткиCardinal Health2D73DP65
Щипцы Адсона с зубамиИнструменты Fine Science11027-12
Щипцы Адсона без зубовИнструменты Fine Science11006-12
Изогнутые ножницыИнструменты Fine Science14075-11
Тяжелые ножницыИнструменты Fine ScienceTools 14002-13
Игольчатый отверткаFine Science Tools12005-15
Vicryl 2.0EthiconJB945
Трансферная пипеткаMedlineGSI135010
ватными наконечниками АппликаторыMedlineMDS202000
50 мл Коническая трубкаFischer Scientific14-432-22
Лента3M1527-1
Смазка для глазMajor LubriFresh0904-6488
ГрелкаK& H3060
СтереомикроскопLeicaMZ16
ИнжекторHI01PK01
стеклянных капиллярных трубокKimble71900-100
Вертикальный съемник микропипетокSutter InstrumentsP-30
МикроэлектродSutter InstrumentsBV-10
IM-300 Пневматический микроинъекторNarishigeIM-300
инсулиновый шприц BD 
ФильтрGenesee Scientific25-244
Compac5 Наркозный аппаратVetEquip Compac5901812 
Изофлуранпирамал для интенсивной терапииNDC 66794-017-25
N2 газAirgasNI 125
O2 газAirgasOX 125
Ad-GFP вирусный векторPenn Vector CoreH5'.040.CMV.eGFP
305935

Ссылки

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040(2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внутривенная инъекциявнутриамниотическая инъекциягемопоэтические стволовые клеткигенная терапияпроточная цитометрияфлуоресцентная микроскопияхирургическая процедураплод мыши
Внутривенно и интраамниальной In Utero трансплантации мышиных модели
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.