Методическая статья

Фиксация легких под постоянным давлением для оценки эмфиземы у мышей

DOI:

10.3791/58197

⸱

26 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен полезный протокол для фиксации легких, который создает стабильное состояние для гистологического оценивания образцов легких по мышиной модели эмфиземы. Основным преимуществом этой модели является то, что она может исправить многие легкие с тем же постоянным давлением без коллапса легких или дефляции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмфизема является важной особенностью хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Исследования с участием эмфисематической мыши модели требуют оптимальной фиксации легких для получения надежных гистологических образцов легких. Из-за характера структурного состава легких, который состоит в основном из воздуха и ткани, существует риск того, что он разрушается или сдувается во время процесса фиксации. Существуют различные методы фиксации легких, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод фиксации легких, представленный здесь, использует постоянное давление, чтобы обеспечить оптимальную оценку тканей для исследований с использованием эмфисематичной модели легких мыши. Основным преимуществом является то, что он может исправить многие легкие с тем же условием в одно время. Образцы легких получаются у хронических мышей, подвергающихся воздействию сигарет. Фиксация легких осуществляется с использованием специализированного оборудования, которое позволяет производить постоянное давление. Это постоянное давление поддерживает легких в достаточно завышенном состоянии. Таким образом, этот метод генерирует гистологический образец легких, который подходит для оценки сигаретного дыма индуцированной мягкой эмфиземы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ХОБЛ является одной из ведущих мировых причин смерти1. Сигаретный дым является наиболее важной причиной ХОБЛ, но механизмы патогенеза остаются неполно определенными. ХОБЛ демонстрирует две основные характеристики, включая постепенное ограничение воздушного потока и аномальную воспалительную реакцию легких. Эмфисематизивное расстройство часто возникает в легких пациентов ХОБЛ2. Патологические находки эмфиземы характеризуются разрушением альвеолярной стены3. Несколько видов животных были использованы для создания моделей ХОБЛ in vivo (т.е. собак, морских свинок, обезьян и грызунов)4. Тем не менее, мышь стала наиболее часто используемой в строительстве моделей ХОБЛ. Это имеет много преимуществ, в том числе его низкая стоимость, способность быть генетически модифицированным, обширная доступность геномной информации, наличие антител, и способность использовать различные штаммы мыши5. В настоящее время нет мыши модели, которая может имитировать все особенности человеческого ХОБЛ; Таким образом, отдельные исследователи должны выбрать, какая модель наиболее подходит для конкретных исследований ХОБЛ6. Эмфисемативная модель мыши является одной из многих моделей мыши ХОБЛ, которые в настоящее время доступны. Дополнительные модели включают модель мыши обострения, системную модель сопутствующих болезней и модель восприимчивости ХОБЛ7.

Эмфисемативная модель мыши может быть создана несколькими типами экзогенных агентов, включая химические агенты и воздействие сигаретного дыма4. Химическое воздействие (например, эластаза) производит тяжелый тип эмфиземы, в то время как сигаретный дым приводит к легкой эмфиземы8,9. Считается, что сигаретный дым является основной причиной патогенеза ХОБЛ; поэтому выбор сигаретного дыма в качестве средства для создания модели мыши ХОБЛ является разумным10. Многие исследования использовали сигаретный дым для создания эмфиземы в мыши. Например, Nikula et al. успешно создала эмфисематизирующую модель мыши от самок мышей B6C3F1, подвергая их воздействию сигаретного дыма в течение 7 или 13 месяцев11. Мы также создали эмфисематичную модель мыши через белок senescence маркер / SMP-30 KO мышей12. Очень важно выполнить метод фиксации легких, который может правильно визуализировать эту мягкую модель эмфиземы путем воздействия сигаретного дыма.

Различные методы фиксации легких были созданы13. Тем не менее, нет золотого стандарта метод фиксации легочной ткани для оценки эмфиземы14. Несколько исследований из этой лаборатории показали, что система фиксации, представленная здесь, полезна, создавая стабильное состояние для оценки эмфиземы12,15,16,17,18. Основным преимуществом нынешней системы является то, что она может исправить многие легкие с тем же условием в одно время без коллапса легких или дефляции. Нынешняя система фиксации легких использует специальное оборудование, которое позволяет образцам легких надуваться при соответствующем постоянном давлении на данный период. Это специальное оборудование состоит из трех частей, в том числе нижнего контейнера, верхнего контейнера и насоса. Образцы легких помещаются в нижний контейнер, который подключен к агентам фиксации под давлением, в результате чего разница в давлении 25 см2О в уровне агентов между верхними и нижними контейнерами19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие методы были одобрены комитетами по уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Джунтендо. Были соблюдены Руководящие принципы по надлежащему проведению экспериментов на животных, Научный совет Японии, 1 июня 2006 года. Есть три основных шага в этом методе: 1) рассечение мыши, 2) легких exsanguination, и 3) фиксация тканей легких при содействии специализированного оборудования. Как правило, образцы легких обрабатываются для встраивания после 48 ч фиксации12,15,16,17,18.

1. Рассечение мыши

  1. Измерьте массу тела мыши, а затем определить количество пентобарбитала для администрирования.
  2. Вводят пентобарбитал интраперитоневом виде в дозировке 70 мг/кг массы тела и подтверждают анестезию отсутствием реакции на щепотку ног.
  3. Введите иглу под углом 45 градусов, пока она не проникнет в кожу и мышцы. Нарисуйте поршень и подтвердите воздушный вакуум, затем введите пентобарбитал.
  4. Подтвердите анестезию отсутствием рефлекторного движения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование анестезируется мыши, в отличие от эвтаназии мыши рекомендуется для полностью легких exsanguination.
  5. Вырезать мышь кожи и мышц ыбрю живота на медиальной линии, направленных на цефалической области.
  6. Отрежьте боковое, чтобы обеспечить более широкое рабочее пространство.

2. Легкие exsanguination

  1. Выставить слой диафрагмы и проколать его щипками.
  2. Откройте грудное пространство и вырежьте стерную область, что позволит хорошо увидеть легкие и сердце.
  3. Разрежьте сердце в левом предсердии и правом желудочке.
  4. Вставьте канюлу (24 G) в правую область желудочка и направьте ее в цефалическую область, пока не достигнет легочной артерии, как показано на рисунке 1.
  5. Включите насос и позвольте 1x фосфат-буферизированных сольников (PBS) циркулировать (примерно 200 мл / ч) до тех пор, пока все ткани легких изменения в белый цвет.

3. Фиксация легочной ткани

  1. Удалить трахеи, легких и сердца.
  2. Освободите все три органа, разрезая окружающие соединительные ткани.
  3. Свяжите правый основной бронх с шовной нитью и вырежьте все доли правого легкого.
  4. (Необязательно): доли правого легкого состоят из четырех частей. Вырежьте эти части из правого основного бронха и разделите части для обработки в виде замороженных образцов тканей.
  5. Вставьте сердце и доли левого легкого в фиксирующие средства, расположенные внутри шприца 10 мл.
    ПРЕДЕКТО: Фиксация агентов являются опасными. Носите надлежащее защитное оборудование (например, длинные резиновые перчатки) и работайте в хорошо проветриваемом помещении.
  6. Создайте вакуумное состояние с помощью шприца 10 мл для раздувания легких, как показано на рисунке 2.
  7. Вставьте канюлу (20 G) в трахею и завяжите узел.
  8. Надуть легкое с фиксации агентов, чтобы проверить с утечки, используя 1 мл шприц.
  9. Переход на оборудование для фиксации легких, как показано на рисунке 3.
  10. После фиксации периодов, удалить образец легких связывая трахеи с узел.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как описано ранее, специализированное оборудование, которое генерирует длительное постоянное давление, можно разделить на три части(рисунок 3А). Нижняя часть является точкой, в которой вставить образец легких(Рисунок 4A). Легкое подключено через канюлю (20 G) к кончику потока формалина с помощью трехстороннего стоп-петуха(рисунок 4B). Давление генерируется из различных уровней повер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура фиксации легких грызунов, представленная здесь, не нова; однако, эта система имеет несколько преимуществ. Во-первых, он может исправить многие легкие (максимум 20) с тем же условием в одно время. Общество токсикологической патологии утверждает, что давление для гравитации зависания варьируется от 22-25 смH2O22. Примечательно, что в нескольких исследованиях была проведена фиксация легких при давлении 25 см2O13,19,<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих интересов, чтобы объявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI Грант номер 26461199 (Т. Сато) и Институт по вопросам окружающей среды и гендерной медицины, Juntendo университета Высшей школы медицины, Грант номер E2920 (Т. Сато). Фандер не принимал никакого значения в разработке современных методов и в написании рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% формалин (нейтральный буферный раствор формалина)Wako060-01667
Изогнутые щипцыHammacherHSC187-11
Канюля, размер 20GTerumoSR-FS2032
Канюля, размер 22GTerumoSR-OT2225CКанюля для обескровливания легких
ЩипцыHammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Нижняя емкость (акриловое стекло)Tokyo ScienceИзготовленный на заказКомпонент оборудования, работающего под давлением
Роликовый насосNissin Scientific CorpNRP-75Насосная машина для обескровливания легких
Роликовый насос RP-2000Eyela (Токио) Rikakikai Co. Ltd)160200Насос для оборудования высокого давления
Силиконовая трубка & Oslash; 9 ммSansyo94-0479Компонент оборудования для давления
Сомнопентил (64,8 мг/мл)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Пентобарбитал Натриевые
хирургические ножницыHammacherHSB014-11
Шовная нить, размер 0NescosutureGA01SW
Шприц, 1 млTerumoSS-01T
Шприц, 1 мл с иглойTerumoSS-01T2613S
Шприц, 10 млTerumoSS-10ESZ
Трехходовой запорный кранTerumoTS-TR1K01
Верхний контейнер (материал из акрилового стекла)Tokyo ScienceИндивидуальный компонентоборудования под давлением
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SMP30

Похожие статьи