Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков

6.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59994

⸱

28 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Korea University

В этой статье

Краткое содержание

Взаимодействия GPCR-и-arrestin являются новой областью в открытии наркотиков GPCR. Для мониторинга таких взаимодействий в живых системах необходимы точные, точные и простые в настройке методы. Мы показываем структурный контроль комплемента для мониторинга взаимодействия GPCR-я-arrestin в реальном времени живых клеток, и он может быть распространен на любой GPCR.

Аннотация

Взаимодействие между G-белковыми рецепторами (GPCRs) и з-арестинами являются жизненно важными процессами с физиологическими последствиями большой важности. В настоящее время характеристика новых препаратов к их взаимодействию с з-арестинов и других цитосолильных белков является чрезвычайно ценным в области GPCR открытие наркотиков особенно во время изучения GPCR предвзятого агонизма. Здесь мы показываем применение нового структурного анализа комплемента для точного мониторинга взаимодействия рецепторов и-арестина в живых системах реального времени. Этот метод прост, точен и может быть легко распространен на любой GPCR интересов, а также он имеет то преимущество, что он преодолевает неспецифические взаимодействия из-за присутствия низкой промоутер выражения присутствует в каждой векторной системе. Это структурное дополнение обзор обеспечивает ключевые особенности, которые позволяют точного и точного мониторинга рецепторов-я-арестина взаимодействий, что делает его пригодным в изучении предвзятого агонизма любой системы GPCR, а также GPCR c-терминус 'фосфорилирования коды, написанные различными GPCR-киназы (GRKs) и пост-трансляционные изменения арестинов, которые стабилизируют или дестабилизируют рецептор-я-арестин комплекса.

Введение

GPCRs представляют собой цель почти 35% текущих препаратов на рынке1,2 и четкое понимание их фармакологии имеет решающее значение в разработке новых терапевтических препаратов3. Одним из ключевых аспектов в GPCR открытие наркотиков, особенно во время развития предвзятых агонистов является характеристика новых лиганд оврецепторов к рецептору-и-арестин взаимодействий4 и -арестин взаимодействия с другими цитосолильных белков, таких как как клатрин5.

Было документально подтверждено, что зависимые сигнализации з-арестин играет ключевую роль в неврологических расстройств, таких как биполярное расстройство, тяжелая депрессия, и шизофрения6, а также тяжелые побочные эффекты в некоторых лекарствах, таких как морфин7.

Текущие методы, используемые для мониторинга этих взаимодействий, как правило, не представляют фактические эндогенные уровни белков в исследовании, в некоторых случаях они показывают слабый сигнал, фотоотбеление и в зависимости от GPCR это может быть технически сложно й создать8. Этот новый структурный анализ дополнения использует низкий экспрессионист векторов для того, чтобы имитировать эндогенных физиологических уровней и обеспечивает высокую чувствительность по сравнению с нынешними методами9. Используя этот подход, можно было легко охарактеризовать Галанин рецептор-я-arrestin1'2, а также -arrestin2-клатрин взаимодействий10. Эта методология может быть широко использована для любого GPCR, представляющих особый интерес, где q-arrestins играют ключевую физиологическую функцию или их сигнализация имеет отношение к некоторым заболеваниям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Стратегия дизайна Primer

  1. Дизайн праймеров для внедрения генов, представляющих интерес в pBiT1.1-C (TK/LgBiT), pBiT2.1-C (TK/SmBiT), pBiT1.1-N (TK/LgBiT) и pBiT2.1-N (TK/SmBiT) Векторы.
  2. Выберите по крайней мере один из этих трех сайтов в качестве одного из двух уникальных ферментов ограничения, необходимых для клонирования направления из-за наличия в кадре стоп-кодон, который делит многоклонный сайт, как показано на рисунке 111.
  3. Включите нуклеотидную последовательность в грунтовки, как показано в таблице 1, чтобы кодировать остатки связующих, показанные красным цветом в таблице 211.
  4. Для векторов pBiT1.1-C (TK/LgBiT) и pBiT2.1-C (TK/SmBiT) убедитесь, что 5-й грунт содержит кодон ATG и мощную последовательность консенсуса Козака (GCCGCCACC).
  5. Для векторов pBiT1.1-N «TK/LgBiT» и pBiT2.1-N «TK/SmBiT» убедитесь, что 3-й праймер содержит стоп-кодон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый вектор содержит hSV-TK промоутер, чтобы свести к минимуму неспецифические ассоциации и уменьшить экспериментальные артефакты, также каждый вектор имеет экспресс-кассету для устойчивости ампициллина в бактериях.

2. ПЦР

  1. Настройка и запуск ПЦР реакции для усиления вставки ДНК гена интерес с помощью грунтовки разработан с шагом 1. Важно использовать высокоточные ПОЛимеразы ДНК для минимизации мутаций.
  2. Используйте именно следующий порядок, чтобы подготовить 50 ЗЛ реакции ПЦР. Добавьте 35,5 л дистиллированной воды, 5 л 10-ти буфера полимеразы, 5 л смеси dNTP (2,5 мМ каждый), 1 л плазмидного шаблона (200 нг/л), 1,25 л вперед и обратного грунтовки (10 мкм) и 1 л высокой фидерной полимеразы (5 Л).
  3. С помощью термоциклоза настроили следующую программу усиления ДНК.
    1. Денатурная при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
    2. Повторите 25 раз следующий тепловой цикл: 95 градусов по Цельсию на 30 с, 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 72 градусов по Цельсию в течение 2 мин на 1 кбитт, чтобы быть усиленным.
    3. Выполнить окончательное расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
    4. Держите образцы при 4 градусах по Цельсию в термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать полимеразы высокой точности, чтобы свести к минимуму точечные мутации, особенно те, которые происходят во время усиления длинных последовательностей. По мере того как усилитель становится длиннее, степень точности в репликации ДНК уменьшается. Для реакции ПЦР выберите температуру, основанную на температуре плавления региона, где олиго непосредственно гибридизируются с шаблоном ДНК, а не со всей последовательностью грунтовки.
  4. Очистка пЦР
    1. Изолировать продукт ПЦР от остальной части реакции ПЦР с помощью комплекта от производителя предпочтений12. Продукт PCR теперь готов для пищеварения ограничения.

3. Пищеварение ДНК

  1. Для пищеварения пЦР готовят 50 кл реакции пищеварения следующим образом.
    1. Используя трубку 1,5 мл, добавьте 12 л дистиллированной воды.
    2. Добавьте 5 кл 10-х буфера с наилучшей совместимостью с обоими ферментами ограничения.
    3. Со ступени 2.4 добавить 30 л пЦР продукта
    4. Наконец, добавьте 1,5 л каждого фермента ограничения.
    5. Кратко перемешать вихрем и инкубировать при 37,5 градуса х на ночь.
  2. Для реципиента плазмидного пищеварения приготовьте 50 кл реакции пищеварения следующим образом:
    1. Используя трубку 1,5 мл, добавьте 23 л дистиллированной воды.
    2. Добавьте 5 кл 10-х буфера с наилучшей совместимостью с обоими ферментами ограничения.
    3. Добавьте 15 зЛ плазмид-получателя (200 нг/Л).
    4. Добавьте 1,5 зл и л каждого фермента ограничения.
    5. Кратко перемешать вихрем и инкубировать при 37,5 градуса х на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать 3 мкг мкг мецита плазмида для того, чтобы получить достаточный материал после очистки геля агарозы ДНК. Также уместно оставить дигевания ДНК на ночь с помощью обоих ферментов для получения высокой эффективности клонирования.

4. ОЧИЩЕНие и клонирование днк агарозного геля

  1. Подготовка 1% агарозный гель для запуска переваренной плазмиды ДНК и вставки и приступить к сократить соответствующие полосы. После того, как соответствующий вектор и вставить полосы были очищены12, определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
  2. Выполните перевязку ДНК, чтобы сплавить вставку к получателю плазмида.
  3. Подготовка реакции перевязки около 100 нг общей ДНК, включая 50 нг плазмидного вектора.
  4. Настройка коэффициента плазмид-вставки получателя примерно 1:3; он может быть рассчитан с помощью векторно-вставки калькулятор13.
  5. Настройка отрицательного элемента управления параллельно. Например, перевязка получателя плазмид НОЙ ДНК без какой-либо вставки предоставит информацию о том, сколько фон непереваренных или самостоятельной получателя плазмида присутствует.

5. Преобразование клонов

  1. Поместите трубку компетентных клеток DH5 из морозильной камеры при -80 градусов по Цельсию и немедленно перенесите ее на лед в течение 20 минут.
  2. После этого времени, принять 55 л компетентных клеток DH5 и добавить 4 л реакции перевязки и перемешать, щелкнув трубку и хранить на льду в течение 45 минут.
  3. Поместите трубку в водяную ванну, предварительно разогретую при 42 градусах по Цельсию ровно 48 с, и немедленно верните трубки на лед еще на 3 мин.
  4. Добавьте 600 кЛ средней суммы Luria Broth (LB), предварительно разогретой при 37,5 градуса цельсия, и насижи с встряхиванием в течение 1 часа при 200 об/мин.
  5. Передача 200 л в агарпластинку, содержащую ампициллин 100 мкг/мл и аккуратно распределить по поверхности с жидкостью в основном поглощается.
  6. Инкубировать пластины на ночь, чтобы увидеть колонии на следующее утро. Получатель плазмида на пластине вставки должны иметь значительно больше колоний, чем получатель плазмид только пластины.

6. Изоляция готовой плазмиды

  1. Выберите 3-10 отдельных бактериальных колоний и перенесите в 1 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать в течение 6 ч.
  2. Возьмите 200 кЛ бактериальной суспензии и перенесите на 5 мл среды LB, содержащей ту же концентрацию ампициллина, что и в шаге 6.1, и инкубировать на ночь при 37,5 градуса х с тряской при 200 об/мин.
  3. Использование miniprep ДНК комплект очистки, выполнять miniprep ДНК очистки с помощью 5 мл LB выросли на ночь после инструкции производителя14.
  4. Для выявления успешных перевязок установите реакции ПЦР так же, как и в разделе 2 с использованием ДНК, полученной из шага 6.3 в качестве шаблона с теми же грунтовками, что и в разделе 2 во время первого ПЦР. Положительные клоны будут производить продукты ПЦР соответствующего размера.
  5. После большой подготовки ДНК очистки положительных клонов, провести диагностическое ограничение пищеварения 500 нг очищенной ДНК с ферментами, используемыми во время клонирования шаг и запустить переваренных продуктов на 1% агарозный гель. Должна быть две полосы: одна размер вектора и одна размер новой вставки.
  6. Проверить последовательность конструкции, секвенируя с помощью следующих грунтовок: Вперед 5'- aaggtgacgcgtcgtggcctcgaac-3' и обратный 5'-gcatttttttcactctttt-3'.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда ДНК реплицируется с помощью ПЦР, всегда есть возможность ошибок во время усиления даже при использовании полимеразы высокой точности, поэтому очень важно секвенировать окончательные конструкции.

7. Трансфекция и экспрессия белка

  1. В ранее поли-L-лизин покрытием белой пластины 96 хорошо, выполнять посев клеток за один день до трансфекции на 2,5 х 104 клетки на хорошо с помощью Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем дополнены 10% плода сыворотки крупного рогатого скота, 100 U/mL пенициллин G, и 100 мкг / мЛ стрептомицин.
  2. Используйте только 60 внутренних скважин, чтобы свести к минимуму потенциал тепловых градиентов по всей пластине и края эффекты от испарения. Добавьте 200 л стерильной дистиллированной воды в 36 внешних скважин и 150 л в пространствах между колодцами иинкубировать на ночь при 37,5 градуса х и 5% CO 2.
  3. На следующее утро выполнять трансфекции с использованием 100 нг общей ДНК (50 нг каждой конструкции).
  4. Назначь четыре различных плазмидных комбинаций (рецептор: я-арестин) в соответствии с рисунком 2b.
  5. Для каждой плазмидной комбинации используйте 20 зл модифицированных орловских минимальных основных средств массовой информации буферизированных с HEPES с использованием 0,3 злиалли с помощью липидных трансфекционных реагента на скважину.
  6. Добавьте 20 зл липовой смеси трансфекционного реагента-ДНК к каждому колодцу и смешайте тарелку по кругу по 10 с.
  7. Изменение свежей среде после 6 hr инкубации на 37,5 C и 5% CO2.
  8. Инкубировать тарелку на 24 ч при 37,5 градуса х и 5% CO2.

8. Мониторинг взаимодействия рецепторов-к-arrestin1/2 в клетках HEK293

  1. Аспирировать среды и добавить 100 злицитов Eagle Минимальный основной медиа буфером с HEPES к каждой скважине и пусть пластина стабилизироваться на RT в течение 10 минут.
  2. Подготовка furimazine субстрата путем объединения 1 том 100x субстрата с 19 томов LCS разбавления буфера (20-раз разбавления)11, создавая 5x запас для смешивания с средой клеточной культуры.
  3. Добавьте 25 зл 5 x furimazine к каждому колодцу и аккуратно перемешайте кругами по 10 с.
  4. Измерьте люминесценцию в течение 10 минут для стабилизации сигнала на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого исходного сигнала для нормализации реакции каждого колодца это поможет уменьшить изменчивость, вызванную различиями в количестве клеток, покрынных в скважине, также различия в эффективности трансфекции и т.д. После расчета, в среднем нормализованная реакция от репликации скважин для данного лечения наркотиков.
  5. Подготовка 13,5x лиганд решение в модифицированных Eagle Минимальный основной медиа буфером с HEPES.
  6. Для экспериментов при комнатной температуре с 10 л 13,5-x лиганда, добавить соединения с помощью инжекторов или многоканальной пипетки и смешать пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (20 с при 200 об/мин).
  7. Для экспериментов при 37,5 градусов по Цельсию с добавлением 10 qL 13,5x ligand, используйте инжекторы для распределения соединений и смешивания с помощью инструмента орбитального шейкера. В случае неиспользования инжекторов, удалить пластину из люминометра, добавить лиганды и смешать пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (20 с при 200 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инжекторы и шейкер в приборе обнаружения, чтобы свести к минимуму колебания температуры, связанные с удалением пластины из светилометра. Стандартные светильники скамейки могут быть использованы для этого асссе. Используйте время интеграции 0,25-2 с.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя представленную здесь процедуру, отслеживались взаимодействия между прототипом GPCR и двумя изоформами з-арестина. Глюкагон, как пептидный рецептор (GLP-1r) конструкции были сделаны с использованием грунтовки, содержащие NheI и EcoRI фермента ограничения сайтов и клонированы в векторы pBiT1.1-C (TK/LgBiT) и pBiT2.1-C "TK/SmBiT", в то время как в случае с "арестовино, два дополнительных векторавлей были использовали pBiT1.1-N (TK/LgBiT) и pBiT2.1-N «ТК/СмБит» с использованием ферментных ограничений bgIII и EcoRI ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Используя представленный здесь метод, взаимодействие между любым GPCR и q-arrestin1/2 можно контролировать в системах жизни в реальном времени, используя этот анализ структурного дополнения GPCR-я-arrestin. В этой связи, мы смогли наблюдать дифференциальный набор и арестин между двумя изообразами glP-1r (прототип класса B GPCR), мы также наблюдали диссоциацию рецептора--арестина комплекса через несколько минут после достижения максимального люминесцентный сигнал.

Для того, чтобы иметь лучшую ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Исследовательской программы (NRF- 2015M3A9E7029172) Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антибиотики пенициллин стрептомицинWelgeneLS202-02Бактериальный инкубатор пенициллин/стрептомицин
JEIO TechIB-05GИнкубатор (Air-Jacket), Основная
среда для клеточной культурыWelgeneLM 001-05DMEM
Среда для трансфекции клеточных культурGibco31985-070Optimem 1X Среда
CO2 инкубаторNUAIRENU5720Direct Heat CO2 Incubator
Digital Water BathLab TechLWB-122DDigital Water Bath Lab Tech
Проверка ДНК полимеразыELPIS BiotechEBT-1011PfU ДНК полимераза
Набор для очистки ДНКCosmogenetechCMP0112miniprepLaboPass Purificartion Kit Плазмида Мини
ДНК Taq PolymeraseЭнзимомикаP750nTaq ДНК-полимераза
Энзим Рестрикция BglIIНовая АнглияБиолаборатории R0144LBglII
Фермент рестрикционный буферНовая Англия БиолабсB72045CutSmart 10X
Буфер Энзим Рестрикция EcoRIНовая Англия БиолабсR3101LЭкоRI-HF
Энзим Рестрикция NheIНовая Англия БиолабораторииR01315NheI
Энзимрестрикция XhoINew England BiolabsR0146LXhoI
Фетальная бычья сывороткаGibcoCanada 12483020Фетальная бычья сыворотка
Гель/ПЦР DNA MiniKitReal Biotech CorporationKH23108HiYield Gel/PCR DNA MiniKit Ligase
ELPIS BiotechEBT-1025T4 DNA Ligase
Light микроскопOlympusCKX53SFCKX53 Микроскоп Olympus
липидная трансфекция реагентInvitrogen11668-019Липофектамин 2000
ЛюминометрBiotek/Fisher Scientific12504386Synergy 2 Многорежимные микропланшетные ридеры
NanoBiT СистемаPromegaN2014NanoBiT PPI MCS Стартовая система
Нанолюциферазный субстратPromegaN2012Nano-Glo Система анализа живых клеток
ПЦР ТермоамплификаторEppendorf6336000015Мастер-амплификатор Nexus SX1
Поли-L-лизинSigma AldrichP4707-50MLРаствор поли-L-лизина
Трипсин ЭДТАGibco25200-056Тризин ЭДТА 10X
Культура лейкоцитов 96 лунокCorning3917Контрольная пластина 96 лунок
для клеточной культуры

Ссылки

  1. Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
  4. Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
  5. Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
  6. Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
  7. Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
  8. Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
  9. Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  10. Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
  11. Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
  12. Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
  13. New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
  14. Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
  15. Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
  16. ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
  17. Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GPCRGPCR
Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.