Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простой подход к выполнению измерений TEER с использованием самодельного Вольт-Ампереметра с программируемой частотой вывода

22.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60087

⸱

5 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Interfaculty Institute of Biochemistry, University of Tübingen, 2Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы демонстрируем, как настроить недорогой вольт-ампереметр с программируемой частотой вывода, который может быть использован с коммерчески доступными электродами палочки для трансэпителиальных/эндотелиальных измерений электрического сопротивления.

Аннотация

Трансэпителиальное/эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) используется с 1980-х годов для определения выпуклости и проницаемости систем модели in vitro. В большинстве случаев электроды палочки используются для определения электрического беспредела между верхним и нижним отсеком системы вставок фильтра клеточной культуры, содержащей клеточные монослои. Мембрана фильтра позволяет клеткам придерживаться, поляризовываться и взаимодействовать, строя плотные соединения. Этот метод был описан с различными линиями клеток (например, клетки гематоэнцефалического барьера, гематробризолочной жидкости барьер, или желудочно-кишечного тракта и легочного тракта). Измерительные приборы TEER могут быть легко получены от различных поставщиков лабораторного оборудования. Однако существуют более экономичные и настраиваемые решения, которые только можно себе представить, если соответствующий вольттамметр будет самостоятельно собран. Общая цель этой публикации заключается в создании надежного устройства с программируемой частотой вывода, которые могут быть использованы с коммерчески доступными электродами палочки для измерения TEER.

Введение

Эпителиальные и эндотелиальные клетки функционируют как клеточные границы, разделяя апикальные и базолатеральные стороны тела. Если они соединены через плотные соединения, пассивное распространение вещества через параклеточные пространства ограничено1,что приводит к образованию выборочно проницаемого барьера. Несколько искусственных барьерных систем были разработаны2 с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток (HBMEC, гематоэнцефалический барьер3,4,5,6,7), сосудистое сплетение эпителиальные клетки (HIBCPP/PCPEC, кроветворно-спинномозговой жидкости барьер8,9,10,11,12,13,14), колоректальные аденокарциномы клеток (Caco-2, модели желудочно-кишечного тракта15), или дыхательных путей / альвеолярных клеточных линий (легочные модели16,17). Эти системы обычно состоят из клеток, выращенных в монослой на проницаемых мембранах (т.е. системы вставки фильтра), чтобы обеспечить доступ к апиальным и базолатеральным сторонам. Важно, чтобы целостность модельной системы соответствовала условиям in vivo. Таким образом, несколько методов были разработаны для анализа барьерной функции путем измерения параклеточного распространения трассирующие соединения по всему клеточному слою. Эти вещества включают радиомаркированную сахарозу, краситель-маркированный альбумин, FITC-маркированный инулин, или краситель-маркированный dextrans2. Тем не менее, химические красители могут сделать клетки непригодными для дальнейших экспериментов. Для мониторинга барьерных систем неинвазивно, измерение трансэпителилиального/трансендотелелиального электрического сопротивления (TEER) по всей клеточной монослойной может быть использовано2,18,19. Поскольку биполярные электродные системы находятся под влиянием электронной поляризации импедеданности на электроде-электролитный интерфейс, тетраполярные измерения, как правило, используются для преодоления этого ограничения20. Техника подкладки четырехтерминального зондирования (4T), который был впервые описан в 1861 году Уильям Томсон (Лорд Кельвин)21. Короче говоря, ток вводится парой ток-несущих электродов, в то время как вторая пара электродов напряжения зондирования используется для измерения падения напряжения20. В настоящее время так называемые электроды палочки состоят из пары двойных электродов, каждый из которых содержит серебряные/серебряные хлоридные гранулы для измерения напряжения и серебряный электрод для прохождения тока2. Электрический импеданс измеряется между акическим и базолатеральным отсеком с клеточного слоя между ними (Рисунок 1). Сигнал квадратной волны с частотой обычно 12,5 Гц применяется на внешних электродах и в результате переменный ток (AC) измеряется. Кроме того, потенциальное падение по всему клеточному слою измеряется второй (внутренней) электродной парой. Электрический импедан затем рассчитывается в соответствии с законом Ома. Значения TEER нормализуются путем умножения импеданса и площади поверхности клеточного слоя и, как правило, выражаются в виде 2 см.

Существуют системы, в которых клетки и электроды расположены более изощренным способом, но также основаны на принципе измерения 4T и могут быть использованы с теми же измерительными устройствами. Системы EndOhm, например, в которые вставляется фильтр, содержат камеру и крышку с парой концентрических электродов с той же структурой, что и электрод палочки. Форма электродов позволяет более равномерное ток плотность потока через мембрану, тем самым уменьшая различия между показаниями. Еще более сложным (но и более точным) является ussing камера, где клеточный слой отделяет две камеры заполнены решением Ringer22. Сама камера может быть газом с кислородом, CO2, или N2, и перемешивают или дополнены экспериментальными веществами. По мере того как перенос иона через слой клетки происходит, потенциальная разница может быть измерена 2 электродами напряжения-зондируя около ткани. Это напряжение отменяется двумя ток-несущими электродами, расположенными рядом с клеточным слоем. Измеренный ток затем даст чистый ионный транспорт и трансэпителиальной устойчивости, которая отражает целостность барьера, может быть определена22. Измерение TEER также может быть применено на системах кузова-на-чипе, которые представляют модели барьерной ткани23,24. Эти системы имитируют условия виво клеток и часто состоят из нескольких типов клеток, уложенных друг на друга слоями.

В следующем протоколе объясняется, как настроить экономически эффективный и надежный вольттамметр с программируемой частотой вывода, который не производит статистически значимых различий в TEER по сравнению с коммерчески доступными измерительными системами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сборка базового вольт-ампереметра для измерения TEER

  1. Подготовьте стандартное зарядное устройство USB в виде 5 V D.C. питания, usb удлинитель, микроконтроллер, который будет использоваться в качестве программируемого генератора квадратной волны, два стандартных многометровых, которые способны измерять переменный ток и напряжение в качестве корня среднего квадрата ( True-RMS), четыре кабеля с банановыми пробками, телефонный удлинитель с женским разъемом RJ14, включая шесть булавок с внутренними четырьмя проводными (6P4C), два коротких кабеля, люстровый терминал, пре-резистор 120 кЗ, прысовые проводные феррулеи и паяльники. Необходимые инструменты являются изоляционная стриптизерша, обжимающий инструмент, и паяльник.
  2. Во-первых, подключите расширение USB к доске микроконтроллера.
  3. Произвластая конечная изоляция двух коротких кабелей. Приспойс одна сторона на кабель либо непосредственно к контактным 0 и 2 микроконтроллера или пайки люки, которые, в свою очередь, обрезаются на соответствующих контактов. Crimp других концов к концу провода ferrules и подключить их к люстру терминала, как показано на рисунке 1.
  4. Свяжите банановые вилки с многометровой. Стрип и обжимать другой конец каждого из четырех кабелей.
  5. Разрежьте телефонный удлинитель на две части и разобрали и обжигируе проводников стороны, содержащей женский разъем. Проверьте непрерывность проводников и булавок.
  6. Первый мультиметр будет использоваться для измерения тока в КЗ (обратите внимание, что режим переменного тока должен быть установлен явно). Соедините его в серии с 120 кЗ пре-резистор агитатора, чтобы закрепить пять и шесть разъема RJ14, соответствующий внешней электродной паре электрода палочки.
  7. Наконец, связать второй мультиметр, который будет использоваться для измерения трансэпителиального напряжения падение в МВ, через люстра терминала булавки три и четыре разъема RJ14, соответствующие внутренней пары электродной палочки электрода.
  8. При желании установите установку в шасси.

2. Программирование микроконтроллера

  1. Изменение предоставленного исходного кода (дополнительный файл кодирования 1) по мере необходимости. В данной форме, контакты 0 и 2 будут чередоваться между землей и No 5 V с 40 мс половину времени колебаний. Таким образом, будет генерироваться сигнал квадратной волны с амплитудой 5 В и частотой около 12,5 Гц. Реальные значения могут отличаться из-за неточности времени микроконтроллера.
  2. Подключите микроконтроллер к настольному компьютеру через порт USB и загрузите исходный код с соответствующим программным обеспечением25.

3. Запись осцилломагов напряжения (по желанию)

  1. Объездные булавки пять и шесть разъема RJ14 с 1 кЗ тест резистора и подключиться к осциллоскоп.
  2. Проверьте частоту, пиковое напряжение и форму волны. Оцифровка и экспорт данных.
  3. При желании записывай осцилломамы с эталонного устройства (EVOM) и самособранный вольттамметр для сравнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае данные были записаны с помощью цифровой области хранения HM 208. Будучи очень простой цифровой осциллоскоп, изображение может быть внутренне оцифрованы (замороженные), но должны быть построены с помощью аналога PM 8143 X-Y рекордер. Изображение было впоследствии отсканировано.

4. Культивирование клеток и измерение TEER

  1. Семена человека хороидное сплетение папилломы (HIBCPP) клетки на клеточной культуры фильтра вставки с поры размером 3 мкм в DMEM / F12 (см. Таблица материалов), содержащий 10% плода теленка сыворотки9. Выращивайте клетки при 37 градусах По Цельсия в насыщенной водой атмосфере, содержащей 5% CO2, как описано В Dinner et al.9.
  2. Когда фильтры достигают импеданса от 70 и см2, измените на безсыворотку DMEM/F12 и определите тайм-пойнт как День 0.
  3. Подключите электрод к порту RJ14 самособранного вольтаметры и подключите блок питания USB. Установите многометровый режим напряжения (mV) и режим тока переменного тока (ЗА), соответственно.
    1. Кроме того, подключите электрод к коммерчески доступному справочному устройству и включите его в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Стерилизовать электрод в 80% этанола в течение 10 мин и уравновесить в соответствующей среде еще 10 мин.
  5. Поместите электрод в обоих отсеках системы вставок фильтра клеточной культуры (более длинная часть электрода в нижнем отсеке и более короткая часть в верхнем отсеке), содержащую слой клетки HIBCPP до тех пор, пока значения измерения не останутся неизменными.
  6. Для эталонного устройства обратите внимание на импедацию непосредственно или вычислите импедацию в соответствии с законом Ома (R q U/I) для самособранного вольтаметры. Имейте в виду, что угол электрода влияет на измерения.
  7. Повторите измерение TEER (шаги 3'6) от дня 0 до дня 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для сравнения работы самособранного вольтаметры с его коммерчески доступным аналогом была записана осциллома напряжения обоих устройств.

Как показано на рисунке 2А,эталонный инструмент генерировал сигнал квадратной волны с амплитудой 80 мВ и временем колебаний 80 мс, что соответствует частоте 12,5 Гц, при работе при нагрузке с резистором теста 1 кЗ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Прежде чем самодельный вольттамметр может быть использован в повседневной жизни, важно проверить устройство для правильной функции. В нашем случае было запрограммировано несколько колебаний 40 мс (12,5 Гц), но эффективное время колебаний оказалось 60 мс (16,7 Гц). Эта неточность времени излучателя микроконтроллера не оказала заметного влияния на измерения TEER. Возможно, лучше всего определить фактическую частоту с помощью частоты одного из мультиметров. При обнаружении какого-либо отклонения исходный код может быть соот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Германа Лиггесмайера и Марвина Бенде за их экспертные советы в области электротехники и информатики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
120 кОмОбщее (общее) оборудование
Банановые кабелиОбщее (общее) оборудование
КабелиОбщее (общее) оборудование
Электрод для едыMerck MillicellMERSSTX01
Электрод для еды (альтернативный)WPI World Precision InstrumentsSTX2
Обжимной инструментОбщий инструмент
Digispark / ATtiny85 AZ-DeliveryVertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
Фетальная телячья сыворотка (FCS)/Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies10270106
Фильтрующие вставки 3&микро; m полупрозрачныйGreiner Bioone662631
HIBCPP HiroshiIshikawa / Horst Schroten
Изоляционный стрипперОбщий инструмент
Люстрированный терминалОбщее (общее) оборудование
ОсциллографHAMEGЦифровой запоминающий осциллограф HM 208
ПлоттерPHILIPSPM 8143 X-Y регистратор
Программное обеспечение Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
ПаяльникОбщий инструмент
Паяльные наконечникиОбщее (общее) оборудование
Телефонный кабель с разъемомОбщее (общее) оборудование
Тестовый резисторMerck MillicellMERSSTX04
Мультиметры True-RMSVOLTCRAFTVC185
USB зарядное устройствоОбщее (общее) оборудование
USB удлинительОбщее (общее) оборудование
Вольтометр для измерения TEERWPI World Precision InstrumentsEVOM
Вольтометр для измерения TEER (альтернатива)Merck MillicellERS
Кабельные наконечникидля общего (генерального) оборудования
Резистор RJ14 (6P4C) USB

Ссылки

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069(2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).
  27. Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , University of Vienna. (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Transwell
Простой подход к выполнению измерений TEER с использованием самодельного Вольт-Ампереметра с программируемой частотой вывода
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.