Method Article

Стабильность и структура Bat Major Histocompatibility Complex Class I с гетерологическим β2-Микроглобулин

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает экспериментальные методы получения стабильного крупного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I через потенциальные β 2-микроглобулин (β2 м)замены различных видов. Исследовано структурное сравнение MHC I, стабилизированное гомологичным и β2 м.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) играет ключевую роль в представлении пептида антигена и иммунных реакций Т-клеток против инфекционных заболеваний и развития опухоли. Гибрид MHC I, сложный с гетерологическим β 2-микроглобулин (β2 м)замена от различных видов может быть стабилизирована в пробирке. Это осуществимое средство для изучения MHC I млекопитающих, когда гомологичный β2 мнедоступен. Между тем, указывается, что β2 м заменане существенно влияет на пептидную презентацию. Тем не менее, существует ограниченное обобщение относительно методологии и технологии для гибридногоMHC I, сложного с гетерологическим β 2-микроглобулином (β2 м). В этом случае представлены методы оценки осуществимости β2 мзамены в исследовании MHC I. Эти методы включают подготовку конструкций выражения; очистка инклюзивных тел и повторное сложение комплекса МХК; определение термостабельности белка; кристаллический скрининг и определение структуры. Это исследование дает рекомендацию для понимания функции и структуры MHC I, а также имеет важное значение для оценки реакции Т-клеток во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) существует у всех позвоночных и является набором генов, который определяет клеточный иммунитет к инфекционным патогенам. MHC класса I представляет эндогенные пептиды, такие как вирусные компоненты, вырабатываемые при вирусной инфекции, Т-клеточных рецепторов (TCR) на поверхностиCD8 и Т-клеток для окаймляют клеточный иммунитет и участвовать в иммуннойрегуляции 1. Структурное исследование MHC I связывания с пептидами предоставляет информацию о пептидных связывающих мотивов и особенностей представления молекул MHC I, который играет жизненно важную роль в оценкеCD8 и Т-клеток иммунной реакции и разработки вакцины.

С момента первой кристаллизации и структурного определения MHC I молекулярной Bjorkman et al.2, анализ кристаллической структурымолекул MHC I значительно способствовал пониманию того, как пептиды связываются с молекулами MHC I, и помогает понять взаимодействие световых цепей с тяжелыми цепями и пептидами. Серия последующих исследований показала, что, хотя гены, кодирующие световую цепь, не связаны с MHC, световая цепь является ключевым белком для сборки молекул MHC I3,4. Он взаимодействует с тремя областями молекул класса I MHC на нескольких поверхностях. Когда световая цепь отсутствует, молекулы класса I MHC не могут быть правильно выражены на поверхности антигеносующих клеток и не могут взаимодействовать с TCR для оказания своих иммунологических функций.

MHC I состоит из тяжелой цепи (H цепи) и световой цепи (т.е. β2-микроглобулин (β2 м))и собирается через привязку к подходящемупептиду 5. Внеклеточный сегмент цепочки H состоит из доменов No1, No2 и No36. Домены No1 и No2 образуют пептидную связывающую канавку (PBG). Цепочка β2 мвыступает в качестве структурного подразделения сборочного комплекса в MHC I, стабилизирующей конформацию комплекса, и является молекулярным сопровождаем для цепи MHC I H,складываемой 7,8,9. Серия исследований показала, что MHC I H цепи из различных млекопитающих, таких как летучая мышь (Хироптера) (Ptal-N-01:01)10, резус макаки (Приматы) (Маму -Би-17)11 (Маму-АЗ01)12 (Маму-АЗ02)13, мышь (Родентия) (H-2Kd)14,15, собака (Carnivora) (DLA-88'50801)16, крупный рогатый скот (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 и лошади (Перисodactyla) (Eqca-N-00602 и Eqca-N'00601)18 может сочетаться с гетерологическими β2 м(Таблица 1). Эти гибридные молекулы часто используются в структурных и функциональных исследованиях. Однако методология функционального и структурного исследования гибридного MHC I с гетерологическим β2 мпока не обобщена. Между тем, структурная основа для взаимозаменяемых βмеждуразличными таксами остается неясной.

В этом случае суммируются процедуры выражения MHC I, повторного сплещания, кристаллизации, сбора кристаллических данных и определения структуры. Кроме того, анализируются потенциальные замены β2 му различных видов путем сравнения структурной конформации MHC I, стабилизированной гомологичным и гетерологическим β2 м. Эти методы будут полезны для дальнейшего структурного исследования MHC I и CD8 иоценки иммунного ответа Т-клеток при раке и инфекционных заболеваниях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка выражений конструкций

  1. Извлекаем последовательности генов класса I MHC (включая прогнозируемые гены) из базы данных NCBI.
  2. Извлечение более высоких последовательностей тяжелых цепей млекопитающих MHC I из базы данных иммуно полиморфизма (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) и базы данных UniProt (www.uniprot.org).
  3. Чтобы получить растворимые комплексы MHC, мутагенизировать последовательности для удаления цитозолических и трансмембранных областей.
  4. Клонировать гены, кодирующие эстодомаины летучей мыши Птал-НЗ01:01 (GenBank no. KT98792919) (остатки 1-277) и летучая мышь β2 м(GenBank No. XP_006920478,1) (остатки 1-98) в векторы pET-28a (Новый, Пекин, Китай), соответственно.
  5. Вставьте оптимизированные (для Escherichia coli)последовательности были вставлены между NcoI и EcoR1 сайтов модифицированного вектора pET-28a.
  6. Построить человеческий β2 мвыражения плазмидов, как описано ранее20.

2. Синтез пептида

  1. Предсказание пептидов
    1. Как описаноранее 10, для проверки пептидов, которые могут связываться с Ptal-N-01:01, предсказать кандидата пептиды с использованием белковых тел летучих мышей, связанных с вирусами хендра (HeV). Чтобы получить пептиды высокого сродства на основе структурной модели от онлайн-сервера, NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 и Rosetta FlexPepDock22 предсказали потенциальную привязку в выбранной пептидной фракции. Кроме того, могут быть использованы другие программы и базы данных, включая BIMAS, иммунную эпитопную базу данных (IEDB), NetCTL 1.2 и SYFPEITHI, все они интегрируют прогноз пептида-MHC класса I, связывающего сродство, транспортер, связанный с антигенной обработкой (TAP) транспортной эффективностью, протеасомным C-терминалом расщепления и половиной времени диссоциации молекул класса
    2. Для прогнозирования высокосвязных пептидов используйте сервер NetMHCpan и Rosetta FlexPepDock.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К сожалению, ни один из произведенных прогнозов не соответствовал экспериментальным данным. Это может свидетельствовать о том, что текущие прогнозы пептида MHC не подходят для не-человеческих и немошейных млекопитающих, таких как летучие мыши, которые могут иметь различную манеру связывания пептидов. Таким образом, мы должны объединить различные программы прогнозирования и экспериментальные результаты для всестороннего анализа, чтобы получить пептиды высокой сродства.
  2. Подготовка и консервация пептидов
    1. Вместо того, чтобы создавать пользовательские пептиды, используйте специализированных поставщиков услуг. Приобрети все пептиды на коммерческой основе после пептидных инструментов прогнозирования, которые имеют более высокий обязательный балл. Пептидная чистота была определена HPLC и масс-спектрометрией на 95%.
    2. Храните все приобретенные пептиды в виде лиофилизированных порошков при 80 градусах Цельсия и растворяйте в диметиловом сульфоксиде (DMSO) перед использованием.

3. Очистка инклюзивных тел

  1. Трансформация кишечной палочки
    1. Преобразование 10 нг плазмиды, содержащей летучую мышь MHC I Ptal-N'01:01 H цепи, или человека β2 мили летучая мышь β2м в 100 л BL21 (DE3) E. coli. Купаться во льду в течение 30 мин.
    2. Тепловой удар при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 90 с, а затем купание во льду в течение 2 минут.
    3. Добавьте 800 л лизогенного бульона (LB: дрожжевой экстракт, триптон и NaCl; см. Таблицу материалов),чтобы шаг 3.1.2 и встряхнуть при 200 вращениях в минуту (об/мин) на качалки платформы при 37 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
    4. Нанесите 100 МЛ бактериальной суспензии на пластину, содержащую соответствующую устойчивость к антибиотикам (ампициллин: 100 нг/мл), которые такие же, как и предыдущие конструкции.
  2. Прививаемые культуры
    1. Выберите один недавно преобразованный бактериальный клон в 3 мл LB с антибиотиком среды (ампициллин: 100 нг / мл) и культуры при 37 градусов по Цельсию, в то время как тряска при 200 об / мин на качалки платформы для активации бактерий. Культуры могут быть привиты поздно ночью, чтобы быть готовым к индукции на следующее утро.
    2. За одну ночь заранее перенесите 500 л активированного бактериального запаса в 50 мл ЛБ с антибиотиком среднего (ампициллин: 100 нг/мл) и инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 200 об/мин. Для удобства при подготовке следующего прививки заморозьте оставшийся активированный бактериальный запас в 1 мл алицитов (500 МКЛ культуры с 500 йЛ 40% глицерола) при 80 градусах по Цельсию до следующего приготовления.
    3. Для генерации большого количества рекомбинантного белка, перенесите бактериальный препарат в 2 л ЛБ с антибиотиком среды (ампициллин: 100 нг/мл) в соотношении 1:100, инкубировать при 37 градусов по Цельсию при встряхивании при 200 об/мин. Культура до поглощения 0,6 при 600 нм достигается. Добавьте 1 мМ изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (IPTG) (варьировать концентрацию IPTG для различных МХК, в основном между 0,1 мМ-1 мМ) в колбу для индукции экспрессии белка.
  3. Бактерии урожая
    1. Перенесите бактерии в центрифугу и центрифугу при 5000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Все шаги отныне должны выполняться при 4 градусах Цельсия.
    2. Resuspend бактерий в 60 мл фосфатного буфера солевого раствора (PBS) и освободить выраженный рекомбинантный белок ультразвуковой разрушитель клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, программа, которую мы установили на этой машине ультразвуковой 6S, интервал 12S, 300 Вт, 99 раз).
  4. Очистка инклюзивных тел
    1. Центрифуга звуковой бактериальной суспензии на 12000 х г в течение 30 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно поместьте гранулы в соответствующий объем стирального буфера (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Повторите этот процесс еще раз.
    2. Центрифуга по 12 000 х г в течение 10-20 мин. Откажитесь от супернатанта и повторно посовестите тела включения в буфер повторного незаменимости (50 мМ Трис рН 8,0, 100 мм НаКл, 10 мМ EDTA, 10 мМ ДТТ). Удалите образец из 20 мкл (органы включения в буфер повторного получения) для SDS-PAGE, чтобы проверить чистоту органов включения.
    3. Центрифуга оставшейся подготовки на 12000 х г в течение 10-20 мин. Откажитесь от супернатанта. Взвесь гранулы, содержащие органы включения, и добавьте буфер растворения (6 M Gua-HCl, 10% глицерин, 50 мм Трис рН 8,0, 100 мМм NaCl, 10 мМ EDTA) до конечной концентрации 30 мг/мл. Медленно перемешайте с помощью магнитного мешалки при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока тела включения не растворяются в буфере растворения.
    4. Центрифуга 12000 х г в течение 10-20 мин. Отбросьте осадки. Храните тела включения при 20 градусах по Цельсию или 80 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к очистке инклюзивных органов, подтвердите, что индукция и экспрессия рекомбинантного белка были успешными. Вы пробежка образцов из каждой культуры (взятых до и после индукции IPTG) на белковом геле; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE концентрированная резинка: H2O, 30% акриламид, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS и TEMED; Гель разделения SDS-PAGE: H2O, 30% акриламид, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 10% SDS, 10% APS и TEMED; см. таблицу материалов ) для β2м, 10% SDS-PAGE для цепи H.

4. Сфолание комплекса МХК

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность повторного вовлечения органов повлияет на урожайность полученного белка. Складной конкурирует с полимеризацией, поэтому общепризнано, что повторное сворачивание при низких концентрациях белка является наиболее успешным методом. В этом документе концентрация инклюзивных тел составляет 30 мг/мл.

  1. Подготовка буфера повторного сфолка.
    1. Варьировать состав буфера рефолсирования в зависимости от белка. Например, рН, ионическая прочность, условия редокса и наличие лигандов повлияют на результаты повторного сверяния. Наиболее распространенным является использование tris или HEPES основе буферов на нейтральном рН с концентрацией NaCl 50-500 мМ, но это также зависит от целевого белка. Ниже приводится формула буфера повторного сфасинга, используемая в этой статье.
    2. Подготовь складной буфер со 100 мМ Трис-ХКл рН 8,0, 400 мМ л-аргинин, 2 мМ ЭДТА-2На.
    3. Охладить буфер до 4 градусов по Цельсию в колбе 250-300 мл, а затем добавить 5 мм уменьшенного глутатиона (GSH) и 0,5 м Окисленного глутатиона (GSSG). Медленно перемешайте с помощью магнитного мешалки при 4 градусов по Цельсию в течение еще 10-20 минут, прежде чем добавлять тела включения и пептиды.
  2. Инъекция и разбавление цепи MHC H и β2 м
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура, при которой выполняется повторноефольление, может варьироваться, хотя, как правило, для того, чтобы свести к минимуму агрегацию, лучше всего 4 градусов по Цельсию. Мы используем разбавление, чтобы разработать белки.
    1. Используя иглу из шприца 1 мл, ввимите 1 мл тел включенияh'2 mили телавключения b'2 mв два буфера сложения (по 1 литр каждый), соответственно. Ввись рядом с энергично вращающимся перемешиванием стержня, чтобы получить быстрое и эффективное разбавление. β2 мреократит относительно легко и остается стабильным даже при отсутствии цепи H.
    2. После β2 мрастворился в растворе для разведения, растворил пептиды (5 мг/мл) в ДМСО и быстро ввел 200 л в раствор для рестилляций. Медленно перемешайте в течение 10-20 минут, прежде чем добавить цепочку H.
    3. Ввимите цепочку H с той же процедурой, описанной выше, β2 м. Цепочка H очень нестабильна; поэтому порядок инъекций очень важен. Ввись 3 мл тел включения цепи H в два различных буфера сверпления (по 1 литру каждый)с 2 мили 2 м,соответственно. Последовательные инъекции небольших алицитов вместо одного применения всего количества белка увеличивают урожайность повторного MHC. Разрешить повторное сфолка, чтобы продолжить при 4 градусов по Цельсию для 8-10 ч.
  3. Концентрация скратфолтого белка
    1. Используйте ультрафильтрацию в герметизированной камере с мембраной 10 kDa MMCO для концентрации спрятающих белков. Этот метод удобен и может быть объединен с буферным обменом. Добавьте в камеру буфер обмена (20 мМ Трис-HCl, 50 мМ. NaCl pH 8.0) и сконцентрируйся до конечного объема 30-50 мл.
    2. Перенесите раствор сфоливания в центрифугу, вращайся при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах цельсия, чтобы удалить осадки.
    3. Тщательно перенесите супернатант и сосредоточьтесь дальше до конечного объема в 1 мл.
    4. Центрифуга по 12 000 хг в течение 10-20 мин. Перенесите супернатант в стерильную трубку и очистите белки с помощью столбца 10/300 GL размер-исключение.
    5. Соберите образцы на пике и проанализируйте их с помощью SDS-PAGE (15% полиакриламинидного геля).
    6. Соберите пик комплекса MHC и сосредоточьтесь на окончательной концентрации 15 мг/мл.
    7. Разбавить комплекс до 7,5 мг/мл и 15 мг/мл для кристаллизации.

5. Кристаллизация, сбор и обработка данных

  1. Выполните кристаллизацию сложного MHC и пептида с помощью метода диффузии паров сидя.
  2. Экран Ptal-N-01:01/peptide комплексов с коммерческими кристаллическими комплектами (например, комплект Crystal Screen I/II, комплект Index Screen, комплект PEGIon I/II и комплект PEGRx).
  3. Запечатать полученный раствор и уравночные против 100 йл раствора резервуара при 4 или 18 градусов по Цельсию.
  4. Наблюдайте за ростом кристаллов в культуре в течение 3 дней, 1 недели, 2 недели, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Используйте микроскоп, чтобы увидеть, если каждая капля в кристаллической пластине кристаллов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы Птал-НБ1:01/Гев1(б 2 м)наблюдались в 0,2 М НаКл, 0,1 М Бис-Три (рН 5,5) и 25% (ж/в) полиэтиленгликоль 3350 при концентрации 7,5 мг/мл. Кристаллы Ptal-N'01:01/HeV1(h'2 m)наблюдались в 0,1 М HEPES, pH 7.0, 2% w/v полиэтиленгликоль 3350 при концентрации 7,5 мг/мл.
  5. Для криогенной защиты перенесите кристаллы в раствор для хранения, содержащий 20% глицерола, а затем быстро охладите в газотическом потоке 100 K.
  6. Сбор рентгеновских данных дифракции с лучевой линии BL19U Шанхайского синхротронного радиационного объекта (Шанхай, Китай).

6. Определение и анализ структуры

  1. С высоким разрешением структурных данных, процесс и масштаб прочность коллекции с помощью программы Denzo и HKL2000 пакет программного обеспечения (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Выбрав лучшую начальную модель в Банке данных по белкам (PDB), определите структуры с использованием молекулярной замены с программой Phaser MR в CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Использованной моделью были координаты структуры с кодом Protein Data Bank (PDB) 5F1I.
  3. Используйте усовершенствованную рентгеновую модель для первоначальной совместной доработки. Используйте феникс уточнить самостоятельно и совместных режимов для рентгена в одиночку и совместных нейтронов и рентгеновских уточнений, соответственно.
  4. После каждого раунда уточнения, вручную проверьте модель в отношении Fo и Fc и 2Fo - Fc положительные карты ядерной плотности в Кут25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Это облегчает правильное размещение вод и некоторых атомов D. Все фигуры конструкций были созданы PyMOL (http://www.pymol.org/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предыдущая работа сообщила, что геВ-производные HeV1 (DFANTFLP) пептид был представлен Ptal-N'01:0110,19. В этом случае была оценена связывающая способность этого пептида к Птал-НО01:01 с гомологичной летучей мышью β2м(бз2 м)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Строительство гибридного белкового комплекса через гетерологичную замену из различных такс является общей стратегией для функциональных и структурных исследований, когда гомологичный комплекс недоступен, например, в MHC I и его лигандах. Вместе с тем существует ограниченное обобщение методологии и технологии. В этом случае была проанализирована структура летучих мышей MHC I, Ptal-N-01:01, стабилизированнаяна 2 мили ч 2 м. Было установлено, что ключевые аминокислоты β2 м,связывающиеся с Пт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего декларировать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано открытым фондом государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Университет Нань-Цзин, Китай (Грант нет. KF-GN-201905), Национальный фонд естественных наук Китая (гранты 81971501). Уильям Лю поддерживается Отличной программой молодых ученых NSFC (81822040) и Пекинским новым звездным планом науки и техники (No181100006218080).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 кДа MMCO мембранаMerck milliporePLGC07610
30% АкриламидLABLEADA3291-500мл*5
5&раз; Белок SDS ЗагрузкаНовопротеинPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa отсечкаMerck миллипорUFC901096
ампициллинаInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21(DE3) штаммTIANGENCB105-02
DMSOMP219605580Наденьте подходящие перчатки и защитите глаза/лицо. При попадании в глаза немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь к врачу.
DTTSolarbioD1070следует носить и эксплуатировать на проветриваемой кухне. При попадании в глаза немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь к врачу.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
глицеринHUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Гуанидина гидрохлоридAmrescoE424-5KG
hβ 2mнаша лабораторияZhang, S. et al. Структурная основа представления перекрестных аллелей HLA-A*0301 и HLA-A*1101, выявленных двумя пептидными комплексами, происходящими из ВИЧ. Мол Иммунол. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTGInalco1758-1400
L-аргинина гидрохлоридAmresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
Белковые маркерныеферменты26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Increase 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
TEMEDThermo17919Перчатки и защитные очки следует носить и эксплуатировать на проветриваемой кухне.
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiorulerRH30056-100mL
ТриптонОксоидLP0042
Дрожжевой экстрактОксоидLP0021
Перчатки и очки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934(2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250(2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC Class IBeta 2 MicroglobulinProtein RefoldingInclusion Body PurificationCrystallization TechniqueX ray DiffractionPeptide BindingThermostability AssessmentExpression ConstructsSize Exclusion Chromatography

Related Articles