Применение иммобилизации тканей дрозофилы с сгустками Фибрина для живой визуализации

Summary

Этот протокол описывает применение иммобилизации образца с использованием сгустков Фибрина, ограничивая дрейф, и позволяя добавление и вымывание реагентов во время живой визуализации. Образцы переносятся на каплю фибриногена, содержащего культурную среду на поверхности крышки, после чего полимеризация индуцируется добавлением тромбина.

Abstract

Дрозофила является важной модельной системой для изучения широкого спектра биологических вопросов. Различные органы и ткани из различных стадий развития мухи, такие как воображаемые диски, личиночных мозговых или яичных камер взрослых женщин или взрослого кишечника могут быть извлечены и хранятся в культуре для визуализации с замедленной микроскопии, обеспечивая ценную информацию в клеточной и биологии развития. Здесь мы подробно описываем наш текущий протокол вскрытия личинок Drosophila, а затем представляем наш текущий подход к иммобилизации и ориентации личинок мозга и других тканей на стеклянной крышке с использованием сгустков Фибрина. Этот метод иммобилизации требует только добавления фибриногена и тромбина в культурную среду. Он подходит для изображений с высоким разрешением времени на перевернутых микроскопах нескольких образцов в одном и том же культуре блюда, сводит к минимуму боковой дрейф, часто вызванный движениями стадии микроскопа в многоточечных посещения микроскопии и позволяет добавление и удаление реагентов в ходе визуализации. Мы также представляем на заказ макросы, которые мы обычно используем для коррекции дрейфа и извлечения и обработки конкретной количественной информации из анализа замедленного действия.

Introduction

Drosophila продолжает оставаться важной модельной системой для изучения широкого спектра биологических вопросов и преуспел в продвижении знаний во многих дисциплинах на протяжении десятилетий. Одной из особенностей, которая делает его особенно выделяются является то, что он особенно хорошо подходит для живой визуализации. Способность контролировать субклеточные процессы или поведение клеток и тканей в режиме реального времени продолжает способствовать созданию ключевых концепций, имеющих отношение к клеточной и биологии развития. Многие успешные протоколы были разработаны различными группами для поддержания таких образцов дрозофилы живыми и здоровыми для изучения поведения образца и флуоресцентных молекул в живых. Органы и ткани от мухи,^{такие как воображаемые диски 1,2},^{личинки мозга 3},^4,5^,6,или^{яйцеклеткивзрослых женщин 7}, 8^,9,^иливзрослого^{кишечника 10, например, могут быть} извлечены и хранятся в культуре для визуализации с замедленной микроскопии. Ключевой задачей для живой визуализации является обеспечение того, чтобы образец держался близко к поверхности изображения для оптимального разрешения и неподвижной без ущерба для целостности образца, который может быть чувствителен к механическим воздействиям. Для изучения нервных стволовых клеток, называемых нейробластов или нейронов в мозге личинки Drosophila, например, сохранение образцов близко к поверхности изображения может быть достигнуто путем покрытия их с культурой средств массовой информации в запечатанных камер изображения^11,12,13. Однако такой подход не позволяет легко обмениваться средствами массовой информации, тем самым ограничивая экспериментальные возможности для маневра. Кроме того, образцы могут быть подготовлены и помещены на coverslips лечение для увеличения адгезии клеток и позволяют многоточенной посещения микроскопии и расширенной живой клетки изображения в открытых блюдах культуры, которые потенциально позволяют обмена средствами массовой информации, но не обеспечивают простые средства для предотвращения дрейфа образца или потери^{во время обмена средствами массовой информации 14,15}.

Метод сгустка Фибрина, первоначально разработанный для изучения мейоза в живых сперматозоидах^{крана-мухи 16,} специально подходит для преодоления этих проблем. Фибриноген растворяется в соответствующей культурной среде, образцы помещаются и ориентируются в капле этого раствора на адекватной стеклянной поверхности камеры визуализации до добавления Тромбина, что приводит к быстрому образованию нерастворимого сгустка фибрина, липкой волокнистой сетки, которая прилипает к стеклянной поверхности и образцам, обеспечивая при этом доступ образца к культурной среде. Среда может быть обменялась, не возмущая сгусток или положение образца. Культурный средний обмен во время визуализации, например, желательно, когда ингибиторы должны быть добавлены, как в первоначальном методе или для мытья или импульса погони экспериментов или когда флуоресцентные красители должны быть добавлены во время живой визуализации клеток, сохраняя при этом клетки и ткани на месте. Фибрин сгустки подходят для визуализации тканей дрозофилы, а также отдельных^{клеток 13,17}. Fibrin сгустки могут быть использованы для оказания помощи восточных образцов, что из-за их формы или других свойств, как правило, не ориентированы в нужном направлении путем модуляции образца позиции в fibrin сгусток и форма самого сгустка.

Здесь мы предоставляем обновленную информацию о наших текущих fibrin сгустка на основе методов визуализации и предоставить инструменты для сегментации на основе анализа изображений и сосредоточиться на использовании этого метода для изучения нейробластов деления в развивающихся летать мозга. Мы регулярно используем метод сгустка Фибрина, чтобы следовать нескольким образцам в разных сгустках в одном и том же блюде культуры. Это позволяет i) изображение субклеточных событий, таких как центросомное поведение или локализация^{мРНК в прямом эфире 18,19}, ii) мониторинг поведения образцов на фармакологическом лечении различных генотипов в тех же настройках изображения с использованием нескольких точка посещения микроскопии²⁰, iii) изучение последствий острого ингибирования^{ферментов 21} и iv) минимизации дрейфующих для изучения изменений в ориентации клеточного деления клеток в их физиологической среде на целевую лазерную абляцию²². В то время как нежелательные эффекты Тромбина и Фибриногена и сгустка Фибрина должны быть эмпирически протестированы для каждого образца, этот метод в принципе подходит для обездвиживания любого типа^{образца,}который должен быть проанализирован живой визуализации клеток и в Drosophila был успешно использован для изучения нескольких аспектов нейробластов^{биологии 5},^19,20, но и динамика цитозенсорных прогнозов женских зародышевой линии^{стволовых клеток 23} и изменения полярности при остром aPKC ингибирование фолликулных клеток drosophila женских^{яйцеклеток 21}.

Промежуток времени флуоресцентной визуализации приводит к генерации сложных временных 3D наборов данных, которые требуют методов для извлечения этой количественной информации. Здесь мы описываем наше дальнейшее развитие ImageJ^{основе 24 макросов,} которые могут быть использованы для коррекции для дрейфующих в гиперстах и на заказ ImageJ макросов, которые позволяют полуавтоматической количественной многоканальной флуоресценции в клеточной коре разработаны для количественной коррекции корковых белков в нейробластов drosophila личинки мозга или отдельных нейробластов в первичной клеточной культуры.

Protocol

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом протоколе, если иное не объясняется осуществляется при комнатной температуре.

1. Чтобы подготовить раствор 1x PBS-BSA (0,1% ж/в), растворите 1 мг сывороточный альбумин (BSA) в 1 мл PBS. Для подготовки запасного раствора Тромбина 1000 единиц^-1,растворите 1000 единиц тромбина в 1 мл PBS-BSA (0,1% ж/в). Сделайте алициты по 10 мкл и храните при -20 градусах по Цельсию в течение 4 месяцев.
2. Чтобы подготовить культурную среду для мозга дрозофилы, растворите 1 г глюкозы в 1 л среды Шнайдера в стерильных условиях. Фильтр и хранить при 4 кк в течение 3 месяцев.
3. Для приготовления раствора фибриногена растворите 10 мг фибриногена в 1 мл среды культуры в течение 20 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется другая среда культуры, чем подготовленная на шаге 1.2, и сгустки Фибрина уже образуются на этом этапе, то среда культуры, вероятно, содержит активный тромбин, который необходимо инактивировать заранее. Вероятным источником тромбина является сыворотка плода крупного рогатого скота, которая может быть инактивирована путем нагрева сыворотки до 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
4. Для приготовления раствора покрытия PBS-BSA (5% ж/в) растворяют 50 мг крупного рогатого скота сывороточного альбумин (BSA) в 1 мл 1x PBS.
5. Для примера реагент, используемый в шаге 4, подготовить фондовый раствор 10 мМ NAPP1 путем растворения 1 мг NAPP1 в 315 йл Диметил сульфоксид.

2. Рассечение личинок дрозофилы мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг под рассечением бинокля.

1. Используйте кисть для передачи личинок L3 в 9-хорошо борозиликатное стеклянное блюдо, содержащее PBS. Перемешать, чтобы отделить большую часть мухи пищи от личинок и передачи в другой хорошо содержащие культуры среды.
2. Используйте типсы (например, Дюмон #55), чтобы схватить личинку по всему диаметру, посередине ее длины тела (см. рисунок 1A,B). Держа личинку, перенесите ее в другой колодец борозиликатной пластины, содержащей 200 МКЛ свежей культуры среды.
3. Не выпускай личинку. Чтобы сократить личинки пополам по всему диаметру(рисунок 1B), либо молоть схватил области с боковой движения миппы советы(рисунок 1A, верхняя панель) или слайд один кончик другой пары типсов между двумя force советы проведения личинки (Рисунок 1A, нижняя панель). Не разрезать личинку пополам, потянув на одной из его конечностей, так как это может повредить мозг, потянув на него через нервы пересечения длины тела (красные линии на рисунке 1B).
4. Используйте типсы, чтобы держать личинку своей кутикулой и еще пару типсов, чтобы очистить кутикулу, не потянув на мозг (Рисунок 1C). Повторяйте, пока нервы, происходящие из мозга видны и органов, соединяющих мозг с частями рта могут быть доступны, как показано на рисунке 1D.
5. Используйте типсы, чтобы держать нервы, происходящие из мозга. С другой парой типсов, использовать любой из методов, показанных на рисунке 1A, чтобы сократить связь между мозгом к частям рта, отделяя мозг от остальной части кутикулы (Рисунок 1D).
6. Используйте типсы, чтобы удерживать мозг аксонами, выходят из брюшного нервного шнура. Сотрите органы, изображенные серым цветом на рисунке 1E, аккуратно вытащив их из мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не тяните на глаз / антенны мыслимые диски (темно-желтый), чтобы отделить их от мозга. Связь между этими тканями слишком надежна, чтобы быть нарушена, потянув, не повреждая мозг.
7. Хотя по-прежнему схвит нервы, чтобы держать и ориентировать мозг, понять связь между глазом / антенны мыслимых дисков (темно-желтый) и мозг с другой парой типсов (Рисунок 1F). Используйте любой из методов, показанных на рисунке 1A, чтобы сократить эту связь, не потянув на мозг. Проверьте, правильно ли очищается мозг от других тканей(рисунок 1G)и не повреждается(рисунок 1H). Отбросьте мозг, если он показывает признаки повреждения.
8. Pipette покрытие раствор с P20 в и из, чтобы покрыть кончик пипетки. Pipette мозга с покрытием кончик вместе с 3 йл среды (Рисунок 2A ,слева ) и пипетки его в другой хорошо, содержащий 200 йл чистой среды культуры.
9. Повторите шаги 2.2-2.8 до тех пор, пока достаточно мозгов не будет вскрыто, иногда заменяя культурную среду хорошо, в которой выполняются вскрытия.

Рисунок 1: Вскрытие личинок D. melanogaster мозга. (A)Техника для резки без вытягивания с помощью типсов. Образец (бледно-зеленый) может быть сокращен, будучи землю между кончиками типсов (верхняя панель) или путем запуска кончика кончика пары типсов вдоль кончиков пары типсов проведения образца (нижняя панель). (B-F) Шаги для изоляции личинок мозга, не повреждая его (см. текст). Красный: мозг. Темно-желтый: диски глаз/антенны. Синий текст: действия для выполнения с соответствующими типсами. (G)Появление изолированного мозга без видимых повреждений. D является спинной стороны и V является брюшной стороны на боковой вид. (H)Общие повреждения, вызванные чрезмерно потянув мозг во время вскрытия. Верхняя панель: отслоение брюшного нервного шнура. Нижняя панель: деформация доли. Задняя слева и передняя находится прямо во всех панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

3. Иммобилизация на крышке с сгустками Фибрина

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг под рассечением бинокля.

1. Используйте P20 пипетку с покрытием наконечником, как в шаге 2.8 для передачи расчлененных мозгов в другой колодец боросиликатной пластины, содержащей 200 МКЛ среды культуры и фибриногена(рисунок 2A).
2. Пипетт в одном мозгу вместе с 9 йл среды культуры и фибриногена. С концом кончика почти касаясь крышки стекла нижней части 35 мм клеточной культуры блюдо, пипетка из содержимого (культура среды и мозга), что делает культуру среды коснуться крышки сразу после выхода пипетки наконечник так, что мозг и среда не скользить в стороны кончика, потенциально повреждая мозг (Рисунок 2A).
3. Используйте один кончик пары типсов или закрытую пару типсов, чтобы мягко толкать и позиционировать мозг в среде культуры и фибриногена капли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прикосновение к капле с открытой парой типсов может привести к культуре среды получать вытащил капиллярности между типсами советы (Рисунок 2B).
4. Если вентраловая часть мозга должна быть изображена, индуцировать свертывание Фибриногена следующим образом, чтобы правильно сориентировать мозг всгустке (рисунок 2C).
   1. Нажмите мозг на одну сторону капли. С P1 пипетка оснащена наконечником P1, пипетка 1 йл раствора Тромбин, коснуться края капли на противоположной стороне мозга с кончиком пипетки, и пипетка из Thrombin (Рисунок 2C, первый рисунок).
   2. Подождите 1-2 мин для Фибриногена, чтобы начать полимеризацию, в результате чего образование облачного осадка с одной стороны капли(рисунок 2C, второй рисунок). Аккуратно толкайте и «заправляйте» мозг в сгусток Фибрина, убедившись, что часть изображения (например, вентраальная сторона) как можно ближе к крышке, не деформирует мозг(рисунок 2C, третий рисунок).
   3. Pipette из 1 йл раствора тромбина близко к стороне мозга не заправленные в сгусток Фибрина. (Рисунок 2C, четвертый рисунок).
   4. Подождите 2-3 мин для второго сгустка Фибрина установить(рисунок 2C, пятый рисунок). Нажмите на края сгустка, чтобы он более сильно прилипает к крышке, заботясь, чтобы не деформировать мозг(рисунок 2C, шестой и седьмой рисунки). Если мозг, как представляется, слишком далеко от крышки, приблизить его, нажав на сгусток Фибрина близко к мозгу.
5. Если спинная часть мозга должна быть изображена, индуцировать свертывание Фибрина следующим образом(рисунок 2D).
   1. Распоить мозг в центре капли, спинной части, обращенной к крышке. С P10 пипетка оснащена тонким кончиком, пипетка 1 йл раствора Тромбин, коснуться края капли на противоположной стороне мозга с кончиком пипетки, и пипетка из Thrombin (Рисунок 2D, первый рисунок).
   2. Подождите 2-3 мин для Фибриногена, чтобы начать полимеризацию, в результате чего образование облачно, волокнистые осадки(рисунок 2D, второй рисунок). Нажмите на края сгустка, чтобы заставить его прилипать сильнее к крышке, заботясь, чтобы не деформироватьмозг (рисунок 2D, третий и четвертый рисунки).
6. Повторите шаги 3.1-3.5, если несколько образцов сгустка должны быть обездвижены на крышке.
7. С концом кончика расположен около 0,5 см над сгустком (ы), мягко пипетка 390 йл среды культуры без Fibrinogen dropwise на верхней части сгустка (ы) (Рисунок 2B, право Петри блюдо). Не добавляйте культурную среду по бокам сгустка, так как она может отделить ее от крышки.
8. Чтобы вымыть оставшийся Тромбин, используйте пипетку, чтобы удалить 300 мкл среды культуры и добавить 300 мкл чистой среды культуры, убедившись, что сгустки остаются полностью погруженными. Повторите дважды, чтобы вымыть избыток тромбина.

Рисунок 2: Иммобилизация личинок мозга дрозофилы с использованием сгустков Фибрина. (A) Использование BSA покрытием Pipette отзыв, мозги передаются из среды культуры (желтый) в культуре среды и Fibrinogen решение (оранжевый), а затем pipetted на крышки (светло-голубой) культуры блюдо вместе с 3,5 йл культуры среднего и Фибриноген. Свертывание фибриногена вызвано добавлением тромбина для обездвиживания мозга в спинном или брюшном положении (см. D и E). Обеспеченные мозги в сгустках затем покрываются в среде культуры без фибриногена и избыток тромбина удаляется путем добавления и удаления культуры среды в три раза. (B) Положение мозга в капле среды культуры и Фибриноген (оранжевый) на крышке следует регулировать только путем мягкого нажатия его кончиком закрытой пары типсов, или только один кончик миппов. Прикосновение к капле с открытой парой типсов может привести к культуре среды получать вытащил капиллярности между кончиками типсов. (C)Шаги для позиционирования личинок мозга для визуализации брюшной стороны (см. текст). (D)Шаги для позиционирования личинок мозга для визуализации спинной стороны (см. текст). В(D) и (E), зеленый: Тромбин. Темно-оранжевый: сгусток Фибрина. Бледно-голубой: обложка. Синие стрелки: края сгустка, которые будут толкнул против крышки, чтобы стабилизировать сгусток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

4. Добавление реагентов во время живой визуализации

1. Чтобы избежать перепадов температуры, вызывающих изменения фокусировки, держите раствор с реагентами, которые будут добавлены в блюдо культуры при той же температуре, что и само блюдо культуры, чтобы довести его до той же температуры, прежде чем добавлять его. Если используется экологическая камера, оставьте раствор в камере.
2. Снимите крышку культурного блюда, не вытесняя само блюдо культуры. Для облегчения удаления поместите крышку 35-мм блюда вверх ногами поверх блюда перед визуализацией.
3. С помощью пипетки P1000 распоите наконечник пипетки близко к поверхности среды культуры внутри культурного блюда и аккуратно отпустите на него достаточный объем реагентного раствора, чтобы достичь желаемой концентрации реагентов (например, 400 МКЛ раствора 20 МКМ NAPP1 на 400 МКЛ среды культуры для окончательной концентрации 10 МК NAPP1) , без генерации сильных потоков, которые могли бы отделить сгустки.
4. Чтобы гомогенизировать раствор в культуре блюдо, используйте P200 пипетку медленно pipette небольшое количество раствора в и из пяти раз (например, 150 йл для объема 800 йл в блюдо).
5. Замените крышку поверх культурного блюда, не вытесняя само блюдо культуры и возобновите визуализацию.

5. Вымывание реагентов во время живой визуализации

1. Перед вымыванием держите раствор для мытья при той же температуре, что и культурное блюдо.
2. Снимите крышку культурного блюда, не вытесняя само блюдо культуры.
3. С P200 или P1000 пипеткой, медленно удалить некоторые культуры среды из культуры блюдо, не подвергая верхней части сгустка (например, удалить 600 йл из 800 йл культуры среды в блюдо).
4. Чтобы разбавить реагент, с P1000 пипетки, положение пипетки кончик близко к поверхности среды культуры внутри культуры блюдо и медленно отпустите стиральный раствор (например, добавить 1 мл стирального раствора в 200 йл культуры среды осталось в блюдо для разбавления фактор 6).
5. Повторите шаги 5.3 и 5.4 до разбавления реагента по мере необходимости (например, еще три аналогичных раунда приведут к коэффициенту разбавления 1296 года, снижая начальную концентрацию 10 МКМ NAPP1 до 7,7 нм).
6. Замените крышку поверх культурного блюда, не вытесняя само блюдо культуры и возобновите визуализацию.

6. Исправление киз, дрейфующих на трехмерных и/или многоканальные промежутки времени

1. подготовка
   1. Скачать и установить ImageJ²⁴. Загрузите плагины TurboReg²⁵ и MultiStackReg²⁶ и поместите их в папку плагинов ImageJ.
   2. Скачать MultiHyperStackReg(Дополнительный файл кодирования 1) и AutoHyperStackReg ImageJ макросов (Дополнительный файл кодирования 2). Чтобы установить макрос, поместите файл .ijm в папку плагинов ImageJ или добавьте содержимое файла .ijm в файл ImageJ/macros/StartupMacros.txt файл.
   3. На ImageJ откройте покадровой фильм, включающий несколько срезов и/или несколько каналов (отныне именуемых «гиперстахой», рисунок 3A,4A). Если промежуток времени включает только один срез и один канал, выравнивание может быть выполнено непосредственно с помощью MultiStackReg.
2. Коррекция бокового дрейфа с помощью MultiHyperStackReg
   1. Решите, какой канал и/или кусок гиперстака следует использовать в качестве ссылки для выравнивания. Чтобы создать одноканайный, односрезаный справочный стек (отныне именуемый «справочным стеком»), нажмите на Image | Duplicate..., пометьте флабликат hyperstack checkbox, ввените соответствующий номер канала в каналах (c): (например, замените 1-2 с 1)и/или соответствующий номер канала в Slices (z): (например, замените 1-15 на 8),и убедитесь, что кадры: (t) включают все кадры (например, 1-50) перед нажатием на OK (рисунок 3B).
   2. Кроме того, чтобы шаг 6.2.1, если проекция нескольких срезов предпочтительнее для одного канала, один срез справочный стек, нажмите на изображение | Стеки | Проект...,выберите первый и последний срезы и тип проекции, убедитесь, что все временные рамки тикают и нажмите на OK. Если промежуток времени имеет несколько каналов, либо удалить нерелевантныеканалы (Изображение | Стеки | Удалить фрагмент) из полученной проекции или дублировать выбранный канал отсчета(Image | Дубликат)( Рисунок 3B).
   3. По желанию обрезать справочный стек, чтобы использовать только одну часть в качестве ссылки, выбрав прямоугольный инструмент в панели инструментов, отслеживая прямоугольник над областью интереса и нажав на изображение | Урожай.
   4. Чтобы начать MultiStackReg, нажмите на плагины | Регистрация | MultiStackReg. В всплывающем меню Stack 1:, выберите название одноканайного, однотягового стека, генерируемого в предыдущих шагах. В всплывающем меню Преобразование:, выберите Перевод; пометьте флажок файла Save Transformation и проигнорируете все остальные поля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие виды трансформации (см.²⁵).
   5. Нажмите на OK. Выберите местоположение и имя, чтобы сохранить файл выравнивания и нажмите на Сохранить. В окне стека ссылок подождите, пока кадры перестанут двигаться автоматически, указывая, что регистрация закончена(рисунок 3B).
   6. Проверьте на справочный стек, чтобы увидеть, является ли выравнивание удовлетворяющих. Если нет, повторите шаги 6.2.1-6.2.5 с другим эталоном, каналом и/или обрезкой. Закройте справочный стек.
   7. Выберите окно гиперстака и запустите макрос MultiHyperStackReg. Выберите файл преобразования, созданный в шаге 6.2.5 и нажмите на Open. Подождите, пока выравнивание будет применено к каждому каналу и/или ломтику гиперстака, после чего откроется новое окно с суффиксом "_aligned"(рисунок 3C).
3. Коррекция фокусного дрейфа с помощью MultiHyperStackReg
   1. Нажмите на изображение | Свойства..., копироватьзначение отображается в ширину пикселей. Чтобы ортогонально повторно использовать однокананнический гиперстак с интервалом в один пиксель, нажмите на изображение | Стеки | Reslice , вставьтезначение ширины пикселя в выходное расстояние: числовое поле; выберите Top in the Start At: всплывающее меню, отметьте «Избегайте Интерпола» и нажмите на OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если память должна быть освобождена на ImageJ, гиперстах может быть закрыт после повторного нарезки.
   2. Выберите новое окно, генерируемое reslice (отныне именуемое "resliced hyperstack", Рисунок 4B). Если перенарезанная гиперстаха имеет несколько каналов, выберите справочный канал для выполнения выравнивания и удалите другие каналы, выбрав их в баре прокрутки канала; нажмите на изображение | Стеки | Удалить фрагмент, выберите канал в меню всплывающего окна Delete Current и нажмите на OK.
   3. Создайте однослойный повторно нарезанный гиперстах (отсюда именуемый «resliced reference stack»), либо путем дублирования одного ломтика повторного гиперстаха (см. шаг 6.2.1) или путем проецирования нескольких ломтиков повторного гиперстака (см. шаг 6.2.2) (Рисунок 4C).
   4. По желанию обрезать повторно нарезаемый справочный стек, чтобы использовать только одну часть в качестве ссылки (см. шаг 6.2.3).
   5. Выполните регистрацию изображения на повторном стеке ссылки с MutiStackReg (см. шаги 6.2.4-6.2.6)(рисунок 4C).
   6. Выберите повторное окно гиперстака и запустите макрос MultiHyperStackReg. Выберите файл преобразования, созданный в шаге 6.3.5, нажмите на Open и подождите, пока выравнивание будет применено к каждому каналу и/или ломтику гиперстака, после чего откроется новое окно с суффиксом "_aligned" (отныне именуемое "resliced reference stack", Рисунок 4D). Закройте оригинальный resliced гиперстах.
   7. Чтобы преобразовать резликированную гиперстаху в xy-вид оригинального гиперстака, нажмите на стеки | Reslice , выберите Top in the Start At: всплывающее меню, тик Избегайте Интерполации и нажмите на OK. После того, как открывается новое окно с окончательным фокус-выровненнымгиперстаком (рисунок 4E),закройте повторно выровненный гиперстах.
4. Чтобы автоматически исправить боковой дрейф и фокусировать дрейф, запустите макрос AutoHyperStackReg. Выберите справочный канал, если это применимо, и следует ли исправить боковой и / или фокус дрейфа. Нажмите на OK.

Рисунок 3: Трубопровод для коррекции бокового дрейфа с MultiHyperstackReg. (A)Боковой и фокус дрейфов можно наблюдать на гиперстах, содержащий несколько ломтиков и точек времени. (B)Один срез, один канал эталонный стек генерируется из гиперстака, либо путем дублирования или проекции. Справочный стек выравнивается плагином MultiStackReg, генерируя файл выравнивания. (C) Макрос MultiHyperstackReg используется для применения файла выравнивания к гиперстаку, в результате чего выровнен гиперстах, для которого исправлен боковой дрейф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Трубопровод для коррекции фокусного дрейфа с MultiHyperstackReg. (A)Фокус сугробы можно наблюдать на гиперстах, содержащий несколько ломтиков и точек времени. (B)Гиперстах ортогонально перелицензирован сверху, вдоль каждой линии пикселей вдоль Y-оси, без интерполяции. Это приводит к повторной гиперстах, содержащей ту же информацию, что и гиперстаф, с его координатами y и z. Дрейф фокуса (в z) первоначально hyperstack происходит как дрейф в y на resliced hyperstack. (C) Один срез, один канал resliced эталонный стек генерируется из повторного гиперстаха, либо путем дублирования или проекции. Повторное стека ссылок выравнивается плагином MultiStackReg, генерируя файл выравнивания. (D)Макрос MultiHyperstackReg используется для применения файла выравнивания к повторному гиперстаку, в результате чего выровнены resliced гиперстах, для которых дрейф фокуса (в y) исправлен. (E)Второй ортогональный резликатор восстанавливает исходные координаты гиперстака, который теперь больше не представляет фокус дрейфа (в z). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

7. Измерение коркового сигнала с вращающимися линиями

1. Скачать вращающийся Linescans ImageJ макрос( Дополнительный файл кодирования 3).
2. Откройте промежуток времени в ImageJ. Распоить прокрутку кадров к первому кадру и, в случае, если промежуток времени содержит несколько срезов, распоставьте прокрутку ломтиков к срезу, на котором будет измеряться сигнал.
3. Режим отслеживания
   1. Выберите инструмент прямой линии в панели инструментов. Проследите линию через корковой зоны, чтобы быть измерены (Рисунок 5A), убедившись, что линия примерно перпендикулярно коры и что линия достаточно долго, чтобы пересечь кору в следующий раз(рисунок 5B, первая и вторая панель).
   2. Дважды щелкните значок инструмента строки в панели инструментов, чтобы открыть окно ширины линии. Увеличьте ширину линии столько, сколько необходимо при сохранении пересечения между линией и корой прямой линии(рисунок 5B, третья панель).
   3. Запустите макрос вращающихся линий. Установите диапазон вращения(рисунок 5E)до низкого значения (около 10 градусов), если ориентация корковой зоны, которая будет измеряться, не сильно изменится от одной точки времени к другой. Установите значение Measure Around до 0 пикселей только для измерения сигнала на линии, где обнаруживается максимальная интенсивность сигнала, или для более высоких значений, чтобы также измерить сигнал вокруг этой линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение вокруг значения повлияет только на измерение сигнала после обнаружения коры и не повлияет на само обнаружение.
   4. На Find Cortex на канале: всплывающее меню, выберите канал, на котором будет выполняться обнаружение. Чтобы визуализировать, где кора была обнаружена в каждый момент времени, держите положение дисплея ... Держите Последние и переориентировать ... Нажмите на OK.
   5. После того, как сделано, результаты, скопированные в статус Clipboard отображается в статусе окна ImageJ, прокрутите промежуток времени, чтобы проверить, удовлетворяют ли обнаруженные положения коры (желтая накладка) и измеренную область (циановую накладку). Если нет, повторите шаги 7.3.1-7.3.4 с другим положением линии, длиной или шириной и различными настройками в окне параметров Rotating Linescans.
   6. Вставьте измерения в программное обеспечение электронной таблицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонны соответствуют каналам в порядке их появления в промежуток времени, а линии соответствуют кадрам.
4. Режим не отслеживания
   1. Выберите инструмент прямой линии в панели инструментов. Проследите линию (указанную в cyan, Рисунок 5A) через корковой зоны, чтобы быть измерены, убедившись, что линия примерно перпендикулярно коре головного мозга и что линия достаточно долго, чтобы пересечь кору в каждыймомент времени (рисунок 5C, первая и вторая панель).
   2. Дважды нажмите на значок инструмента линии в панели инструментов, чтобы открыть окно Ширина линии. Увеличьте ширину линии столько, сколько необходимо, сохраняя при этом пересечение между линией и корой прямой линии(рисунок 5C, третья панель).
   3. Запустите макрос вращающихся линий. Установите диапазон вращения(рисунок 5E)соответственно изменениям ориентации корковой зоны, которые будут измеряться на протяжении всего промежутка времени. Установите значение Measure Around до 0 пикселей только для измерения сигнала на линии, где обнаруживается максимальная интенсивность сигнала, или для более высоких значений, чтобы также измерить сигнал вокруг этой линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение вокруг значения повлияет только на измерение сигнала после обнаружения коры и не повлияет на само обнаружение.
   4. На Find Cortex на канале: всплывающее меню, выберите канал, на котором будет выполняться обнаружение. Чтобы визуализировать, где кора была обнаружена в каждый момент времени, держите позиции дисплея ... Untick Последние и переориентации ... Нажмите на OK.
5. После этого результаты, скопированные на Clipboard, отображаются в статусе окна ImageJ, прокручивают промежуток времени, чтобы проверить, удовлетворяются ли обнаруженные положения коры (желтая накладка) и измеренная область (циановая накладка). Если нет, повторите предыдущие шаги с другим положением строки, длиной или шириной и различными настройками в окне параметров Rotating Linescans.
6. Вставьте измерения в программное обеспечение электронной таблицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колонны соответствуют каналам в порядке их появления в промежуток времени, а линии соответствуют кадрам.

Рисунок 5: Измерение коркового сигнала с вращающимися линиямиcan. (A)Линия (cyan) прослеживается перпендикулярно коре головного мозга (черный), где сигнал будет измеряться. Различные оттенки серого показывают изменение положения ячейки в течение трех точек времени (t1, t2, t3). (B) Слева: правильное позиционирование линии в режиме отслеживания. Середина: неправильное позиционирование линии в режиме отслеживания, так как нет перекрытия с корой в следующий момент времени. Справа: слишком широкая линия, приводящая к пересечению (оранжевой линии) между корой и линией, не прямой. (C) Слева: правильное позиционирование линии в режиме, не отслеживаемом. Середина: неправильное позиционирование линии в режиме, не отслеживаемом, так как нет перекрытия с корой в каждый момент времени. Справа: слишком широкая линия, приводящая к пересечению (оранжевой линии) между корой и линией, не прямой. (D)Длина и ширина линии сканирования. (E)Линии выполняются в пределах диапазона ориентаций вокруг исходной ориентации,показанной в( D ), определяемой параметром "диапазона вращения", с интервалом, определяемым параметром "шаг вращения". (F)Неоптимальная ориентация сканирующей линии относительно коры головного мозга, что приводит к низкому сигналу, измеряемому вдоль линии. (G)Оптимальная ориентация линии определяется как ориентация, приводящая к самому высокому пику интенсивности сигнала, измеренного вдоль линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Results

Иммобилизация тканей дрозофилы с сгустками Фибрина и культуры среднего обмена во время живой визуализации.
После вскрытия после процедуры, представленной в шаге 2 (Рисунок 1) и обездвижены в Fibrin сгустки на том же coverslip после процедуры, представленной вшаге 3 ( Рисунок 2), личинки мозги, выражают GFP-тегами Базука (Baz::GFP), летать ортопедии полярности белка Par-3, были изображены в течение 30 мин в промежуток времени многопозентной Baz::GFP сочетается с apkc^as4, аллелем, который позволяет остро ингибировать атипичную белковую киназу C (aPKC) за счет добавления небольшого аналога АТФ 1-NAPP1²⁰. Таким образом, 1-NAPP1 был добавлен в культурную среду после процедуры, представленной в шаге 4, и живая визуализация была возобновлена на 2,5 ч. Контроль мозга, несущий дикую версию киназы aPKC, не реагировал на аналог АТФ, в то время как мозги, несущие дополнительно аналогово-чувствительную мутациюaPKC (apkc^as4), демонстрировали сокращение нейроэпителия и ярких скоплений Баз в нейробластах и их потомствах(рисунок 6, Видео 1). Нейробласты продолжают делиться на протяжении всего промежутка времени, указывая, что ткань остается здоровой, и мозги показывают небольшой дрейф, несмотря на изменение среды культуры, что указывает на то, что они хорошо обездвижены. Аналогичным образом, после вскрытия после^{процедуры, представленной в 27}, ovarioles выражая Baz::GFP были обездвижены в Fibrin сгустки на том же coverslip и изображены в течение 8 минут, после чего применение 1-NAPP1 индуцированных сокращение apkc как4 мутант фолликулярных клеток, но не контроля (Рисунок 7, Видео 2).

Коррекция бокового и фокусного дрейфа с помощью MultiHyperstackReg.
Гиперстаха отображения как боковой и фокус дрейф (Видео 3, левая панель) был сначала исправлен для бокового дрейфа (шаг 6.2, рисунок 3, Видео 3, средняя панель), а затем сосредоточиться дрейф (шаг 6.3, Рисунок 4, Видео 3, правая панель) с помощью Плагина MultiStackReg и MultiHyperstackReg макро, в результате чего существенное сокращение движений наблюдается в оригинальной гиперстахи.

Измерение корковых сигналов с помощью вращающихся линий
Нейробласт, выражаюющий Baz::GFP (зеленый) и трансмембрановый белок CD4, помеченный инфракрасным флуоресцентным белком (CD4::mIFP, красный), был изображен во время одного митоза. Сигнал CD4::mIFP использовался в качестве ссылки для обнаружения коры головного мозга в различных частях нейробласта с помощью линий (шаг 7, рисунок 5, рисунок 8A-C) и сигнал Baz::GFP был измерен на обнаруженных позициях Рисунок 8D). Во время их деления нейробласты временно поляризуются путем создания различных и противоположных корковых областей: апического полюса и базального полюса. Баз определяет апический полюс и, последовательно, baz::GFP сигнал увеличился на апическом полюсе нейробласта и уменьшился на базальных полюсах во времяделения (рисунок 8C,D). Положение коры было удовлетворительно отслеживается на протяжении всего промежутка времени(рисунок 8C, Видео 4). Линии и генотипы Дрозофилы упоминаются в дополнительной таблице 1-2.

Рисунок 6: Применение аналога АТФ на обездвиженные личинонные мозги во время живой визуализации. (A) Live изображения двух личинок мозга, выражают Baz::GFP обездвижены на той же обложке. Среда культуры изменена на концентрацию 10 МКМ аналога АТФ 1-NAPP1 в 0 мин. Мозги управления не реагируют заметно на аналог АТФ, в то время как мозги, несущие аналоговую чувствительную мутациюaPKC (aPKC^AS4), отображают сокращение нейроэпителия (наконечники стрел) и ярких скоплений База в нейробластах и их потомствах. Максимальная интенсивность проекции 33 ломтиков на глубину 23 МКМ. Шкала бар: 20 МКМ (B) Увеличение нейроэпителиума. Шкала бар: 10 МКМ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 7: Применение аналога АТФ на обездвиженные яйцеклетки во время живой визуализации. Live изображения двух ovarioles выражая Баз::GFP обездвижены на той же обложке. Среда культуры изменена на концентрацию 10 МКМ аналога АТФ 1-NAPP1 в 0 мин. Контрольные яйцеклетки не реагируют заметно на аналог АТФ, в то время как яичные камеры, несущие аналоговую чувствительную мутациюaPKC (aPKC^AS4), отображают сокращение эпителия (наконечники стрел), что в конечном итоге приводит к очевидному распаду соединений. Максимальная интенсивность проекции 33 ломтиков на глубину 27 МКМ. Шкала бар: 20 МКМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этого рисунка.

Рисунок 8: Измерение коркового сигнала с помощью вращающихся линий. (A) Live D. melanogaster neuroblast выражая Баз::GFP (зеленый) и CD4::mIFP (красный). Cyan линии: начальные линии сканирования прослеживается перпендикулярно различным корковых зон для измерения. Шкала бар: 5 МКМ (B) Идентификация коры (темно-синяя линия) с использованием корковых линий и CD4::mIFP (красный) в качестве справочного канала. Линия Cyan: область, определяемая параметром "Мера вокруг" (здесь 2 пикселя), где сигнал измеряется после обнаружения коры. Шкала бар: 2 мкм . ( C )Cyan:корковые области, выявленные во время нейробластового деления методом вращающихся линий из начальных линий сканирования отображается в (A), используя CD4::mIFP (красный) в качестве справочного канала. Шкала бар: 5 МКМ Стрелка: апический полюс. Стрелка: базальный полюс. (D) Измерение интенсивности сигнала Baz::GFP с течением времени в двух соответствующих зонах, идентифицированных вращающимися линиями, отображаемыми в (C). Во время митоза, Baz::GFP получает преходяще обогащенный на апическом полюсе neuroblast и обеднен от противоположного базального полюса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Видео 1: Применение обмена средствами массовой информации на обездвиженные личинки мозга во время живой визуализации, чтобы добавить ингибитор, представленный на рисунке 6, шкала бар: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Применение обмена средствами массовой информации на обездвиженные яйцеклетки во время живой визуализации, чтобы добавить ингибитор, представленный на рисунке 7, шкала бар: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Исправление бокового и фокусного дрейфа с помощью MultiHyperStackReg. Живое изображение нейробласта, выражаюго мембранный зонд PH::GFP. Xy: один координационный самолет. Xz: ортогональный реlice. Слева: перед коррекцией дрейфа. Середина: после коррекции бокового дрейфа. Справа: после коррекции бокового и фокусного дрейфа, планка масштаба: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 4: Обнаружение коры с помощью вращающихся linescans, представленные на рисунке 8, шкала бар: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительная таблица 1: Генотипы изображенных тканей Дрозофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Происхождение используемых трансгенов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный кодирующий файл 1: Происхождение используемых трансгенов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодирующий файл 2: Происхождение используемых трансгенов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодирующий файл 3: Происхождение используемых трансгенов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Живое изображение всего крепления D. melanogaster личинки мозга дает возможность наблюдать асимметричные нейронные деления стволовых клеток в условиях, близких к физиологическому контексту. Первая часть нашего протокола вводит наш подход к вскрытию личинок мозга. Как уже^{говорилось 13}, важнейшим аспектом подготовки является, чтобы избежать повреждения мозга. Наиболее сложным аспектом этого является отделить мозг от соседних воображаемых дисков, не потянув чрезмерно на мозг. Наш подход к "резка без потянув" заключается в том, чтобы выполнить либо шлифовальные движения с кончиками одной пары типсов, или слайд типс советы по двум другим типса советы проведения связи между тканями (Рисунок 1A), в то время как Lerit и др. описать пилы, как движения с рассечением булавку. Мы советуем экспериментатору опробовать все подходы и принять наиболее подходящий для себя. Мы также предлагаем использовать BSA- или FCS покрытием пипетки советы, а не вскрытия инструментов для передачи изолированных мозгов. Покрытие предотвращает ткани от прилипания к пластику и позволяет безопасной передачи тканей, всегда сохраняя их полностью погружен, не подвергая их возможной преходящей деформации, как они прилипают к инструменту вскрытия во время передачи. Советы с покрытием имеют и другие преимущества, позволяющие передавать сразу несколько мозгов, что особенно полезно, когда крайне важно контролировать время проживания образцов в пределах конкретной среды; они подходят для переноса других тканей, даже хрупких, как, например, жировые тела; они могут вместить широкий спектр различных размеров выборки, используя большие советы или резки конечности кончика.

Далее, этот протокол описывает использование свертывания фибриногена для обездвиживания личинородного мозга на обложке культурного блюда. Мозг ориентирован в пределах капли среды культуры - фибриногена, после чего свертывание индуцируется добавлением Тромбина. Формирование Фибрина происходит постепенно, обеспечивая время, в течение которого ориентация образца может быть отлажена, при необходимости(рисунок 2C). Если требуется небольшое сжатие образца, против которого мы советуем в случае личинок мозга, его также можно точно отрегулировать, нажав на сгусток более или менее близко к образцу во время шагов 3.4.4 и 3.5.2. Основным преимуществом этой свертываемости фибриногена над протоколом, описанным в Lerit et al., в котором мозг устанавливается между проницаемой мембраной газа и крышкой, является способность заменить культурную среду во время живой визуализации. Возможным преимуществом использования газоназной мембраны над нашим протоколом может быть то, что она обеспечивает оптимальную оксигенацию образцов, которая может быть более ограничена с нашим подходом, поскольку мозг отделяется от воздуха сгустком и некоторыми средами. По этой причине, хотя мы не оценивали влияние количества среды культуры в культуре блюдо, мы предлагаем ограничить количество культуры среды на верхней части сгустков, сохраняя при этом сгустки полностью погружен.

Поскольку манипуляция тромбами может быть экспериментально трудной и трудоемкой, мы рекомендуем экспериментатору сначала поработать, манипулируя тромбами без образцов. Модуляция объема падения культуры среды и фибриногена на крышке, концентрация фибриногена или объем и концентрация тромбина может помочь сделать препарат проще и может быть важным при адаптации протокола к другим типам тканей. При достаточном опыте манипулирования сгустками, несколько мозгов могут быть обездвижены в один сгусток, если это необходимо, хотя это усложняет тонкой настройки ориентации. На крышке может образовываться несколько сгустков, что позволяет, например, образовывать образцы различных генотипов. Кроме того, можно подвергать различные сгустки на той же обложке для различных средств массовой информации культуры, хотя необходимо позаботиться никогда не смешивать капли культуры среды, охватывающих различные сгустки. После того, как личиножные мозги обездвижены и готовы к живой визуализации, мы советуем следовать рекомендациям Lerit et al.^13, чтобы избежать чрезмерного фотосемья. Мы только добавляем к этим рекомендациям не только поддерживать мозг на 25 градусов по Цельсию во время живой визуализации со сценическим инкубатором, но и разогреть этот этап, по крайней мере за 30 минут до начала визуализации. В наших руках, неспособность сделать это систематически приводит к сильному дрейфу фокусировки.

Это может быть выгодно в некоторых контекстах, чтобы иметь возможность выполнять коррелированную микроскопию и исправить и определить иммунитет образца после живой визуализации. Тем не менее, ограничение использования сгустков Фибрина является то, что это почти невозможно механически изолировать мозг от сгустка, не повреждая его. Возможный способ преодолеть это ограничение может быть разработка методов для деградации сгустков Фибрина с плазмином или вызвать разборку сгустка путем добавления пептида, имитирующий ручки, позволяющие полимеризации Фибрина²⁸. Обычно мы используем сгустки Фибрина на образцах от одиночных клеток до 200 мкм длинных тканей, но мы также можем успешно обездвижить сгустки и мозг изображения взрослых шмелей шириной более 3 мм. Верхний предел размера выборки, который может быть обездвижен тромбами, еще предстоит определить. Аналогичным образом, хотя мы обычно изображение иммобилизованных образцов для 4 до 5 ч, мы успешно изображения нейробластов в первичной культуре на срок до 3 дней, что свидетельствует о том, что сгусток по крайней мере не мешает долгосрочной жизнеспособности. Напротив, сгустки могут способствовать регулярной замене среды, требование для долгосрочной визуализации, без необходимости устройств, таких как перистатические насосы для этой цели. Хотя мы не измерили параметры проницаемости сгустков фибрина, волокнистый гель-как характер сгустков, как представляется, проницаемые клеток проницаемых молекул. Мы обнаружили, что Latrunculin A, Colcemid или 1-NAPP1, HALO-тег лиганды и другие стандартные красители, используемые в клеточной биологии достичь клеток в фибриновом сгустке без каких-либо проблем и до сих пор не сталкиваются молекулы, которые будут сохранены сгустка, который, однако, является возможность, которая должна быть эмпирически протестирована.

В заключение, использование сгустков Фибрина обеспечивает надежный и относительно простой в реализации способ иммобилизации живых тканей для живой визуализации. Помимо своей полезности в ограничении бокового дрейфующих, способность изменять культуру среды во время живой визуализации оказался бесценным для нашей химической генетики подход к изучению асимметричного деления клеток D. melanogaster neuroblasts²¹. Мы ожидаем, что этот метод будет полезен для исследований в широком диапазоне различных тканей, особенно если они связаны с химической генетикой или, например, белка^{самонаклеивания 29}.

Наш макрос MultiHyperStackReg опирается на плагин TurboReg ImageJ, который выравнивает последовательные кадры или фрагменты стека, и плагин MultiStackReg ImageJ, который позволяет применять преобразования к другим стекам. MultiHyperStackReg просто позволяет применять эти преобразования к гиперстах (стеки, по крайней мере, с четырьмя измерениями). Поскольку использование MultiHyperStackReg, как мы его описываем, требует много действий и может получить довольно много времени, мы также написали autoHyperStackReg макрос, который автоматически выполняет все шаги, описанные в шагах 6.2 и 6.3. Однако, в отличие от MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg в настоящее время не имеет возможности рассчитать выравнивание стека на основе субрегиона этого стека, вариант, который мы обнаружили, иногда имеет решающее значение для удовлетворяющих выравнивания. Еще одним ограничением AutoHyperStackReg является то, что его использование ограничено переводами, а не другими преобразованиями, предложенными TurboReg и MultiStackReg, в то время как MultiHyperStackReg может применяться к гиперстаку любого типа преобразования, если он нужен пользователю. Будущие релизы будут реализовывать эти функции и будут доступны на GitHub³⁰. Наконец, наш вращающийся макрос linescan обеспечивает простой способ быстро измерить корковые сигналы во временных промежутках, даже если кора изменяет свое положение или ориентацию с течением времени. Подходит ли его режим отслеживания или режим не отслеживания для анализа, зависит от качества и согласованности коркового сигнала. Режим отслеживания проще в использовании, так как пользователю не нужно учитывать, где кора будет для каждой точки времени и может вместить большие изменения положения и ориентации с течением времени. Однако он подходит только в том случае, если корковый сигнал остается достаточно сильным для обнаружения в течение всего фильма: неспособность обнаружить что-либо еще, кроме коры (например, яркий цитоплазмический отсек близко к коре головного мозга) может поставить под угрозу обнаружение для каждого следующего промежутка времени (например, цитоплазмический отсек отходит от коры и корковых линий следует за ним до конца промежутка времени). Режим не отслеживания не имеет этой ловушки, так как обнаружение ограничено линией, первоначально нарисованной пользователем (например, яркий цитоплазмический отсек может привести к тому, что обнаружение потерпит неудачу в течение нескольких точек времени, но по мере того, как цитоплазмический отсек отходит от зоны обнаружения, правильное обнаружение коры возобновляется), но не ведет себя хорошо, если положение коры или ориентация значительно меняется с течением времени. Следующей функцией (которая будет доступна на GitHub³⁰), которая будет разработана для режима отслеживания будет возможность анализировать только указанные точки времени и определить точку отсчета (а не первую точку времени), перед которой и после чего будет выполнено обнаружение, что позволит пользователю по крайней мере избежать проблемных точек времени.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Альбумин бычья сыворотка, BSA	Merck	5470
D-(+)-глюкоза	Sigma	G7021
Диметилсульфоксид	Sigma	D2650
Dumont #55 Щипцы	Fine Science Tools	11255-20
Фетальная сыворотка Bovie, подходит для клеточной культуры	Sigma	F7524
Фибриноген из плазмы	человекаSigma	F3879
FluoroDish Чашка для клеточных культур - 35 мм, 23 мм лунка	World Precision Instruments	FD35-100
PP1 Аналог (1NA-PP1)	Merck Millipore	529579
Pyrex с девятью углублениями	Sigma	CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium	Sigma	S0146
Тромбин из бычьей плазмы	Мерк	Т4648