Методическая статья

Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 мая 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Усовершенствованный метод очистки тканей был разработан и применен к сердцу взрослой мыши. Этот метод был разработан для очистки плотной, аутофлуоресцентной сердечной ткани, сохраняя при этом меченую флуоресценцию фибробластов, приписываемую стратегии генетического репортера.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее распространенной причиной смертности во всем мире и часто отмечаются повышенным сердечным фиброзом, который может привести к увеличению жесткости желудочков с измененной сердечной функцией. Это увеличение фиброза сердечных желудочков связано с активацией резидентных фибробластов, хотя то, как эти клетки работают в 3-мерном (3-D) сердце, на исходном уровне или после активации, не совсем понятно. Чтобы изучить, как фибробласты способствуют сердечным заболеваниям и их динамике в 3-D сердце, был разработан усовершенствованный метод очистки и визуализации тканей на основе CLARITY, который показывает флуоресцентно меченые сердечные фибробласты во всем сердце мыши. Тканевые резидентные фибробласты были генетически мечеными с использованием флуоресцентных мышей Rosa26-loxP-eGFP, скрещенным с сердечным фибробластом, экспрессирующим Tcf21-MerCreMer. Этот метод был использован для наблюдения динамики локализации фибробластов по всему левому желудочку взрослого человека у здоровых мышей и у фиброзных мышиных моделей сердечных заболеваний. Интересно, что в одной модели травмы уникальные паттерны сердечных фибробластов наблюдались в поврежденном сердце мыши, которые следовали за полосами обернутых волокон в сократительном направлении. В моделях ишемического повреждения произошла гибель фибробластов с последующей репопуляцией из пограничной зоны инфаркта. В совокупности этот усовершенствованный метод осветления сердечной ткани и оцифрованная система визуализации позволяют проводить 3-D визуализацию сердечных фибробластов в сердце без ограничений недостаточности проникновения антител или предыдущих проблем, связанных с потерей флуоресценции из-за обработки тканей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя кардиомиоциты составляют наибольшую объемную фракцию в сердце, сердечные фибробласты более многочисленны и критически участвуют в регулировании исходных структурных и репаративных особенностей этого органа. Сердечные фибробласты очень подвижны, механически чувствительны и фенотипически ранжируются в зависимости от степени их активации. Сердечные фибробласты необходимы для поддержания нормального уровня внеклеточного матрикса (ECM), и слишком мало или слишком много производства ECM этими клетками может привести к заболеванию1,2,3. Учитывая их важность в заболевании, сердечные фибробласты становятся все более важной темой исследований для выявления новых стратегий лечения, особенно в попытке ограничить чрезмерный фиброз4,5,6,7. При повреждении фибробласты активируются и дифференцируются в более синтетический тип клеток, известный как миофибробласт, который может быть пролиферативным и секретировать обильный ECM, а также иметь сократительную активность, которая помогает ремоделировать желудочки.

В то время как сердечные фибробласты были широко оценены на их свойства в 2-D культурах6,8,9,10,гораздо меньше понимаются их свойства и динамика в 3-D живом сердце, либо на исходном уровне, либо при стимуляции заболевания. Здесь был описан усовершенствованный метод очистки тканей сердца взрослой мыши при сохранении флуоресценции фибробластов, помеченных генетической репортерной системой Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. В сердце Tcf21 является относительно специфическим маркером покоя фибробластов4. После того, как тамоксифен дается для активации индуцируемого белка MerCreMer, по существу все покояющиеся фибробласты будут постоянно экспрессировать усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) из локуса Rosa26, что позволяет отслеживать их in vivo.

Существует множество хорошо заясневших протоколов очистки тканей, некоторые из которых были применены к сердцу11,12,13,14,15,16,17. Однако было обнаружено, что многие из реагентов, используемых в различных протоколах очистки тканей, гасят эндогенные флуоресцентные сигналы18. Кроме того, сердце взрослого человека трудно очистить из-за обильных белков, содержащих гемовую группу, которые генерируют автофлуоресценцию19. Поэтому целью данного протокола было сохранение флуоресценции маркера фибробластов с одновременным ингибированием гемовой аутофлуоресценции в поврежденном сердце взрослого человека дляоптимальной 3-D визуализации in vivo12,13,14,16,17,20.

Предыдущие исследования, в которых предпринимались попытки изучить сердечный фибробласт in vivo, использовали перфузированные антитела для маркировки этих клеток, хотя такие исследования были ограничены проникновением антител и структурой сердечного сосуда14,16,17,20. Хотя Salamon et al. показали очистку тканей с поддержанием местной флуоресценции нейронов в сердце новорожденного, а Nehrhoff et al. показали поддержание флуоресценции, отмечающей миелоидные клетки, поддержание эндогенной флуоресценции через всю стенку желудочка еще не было продемонстрировано, включая визуализацию взрослых сердечных фибробластов на исходном уровне или после травмы13,20. Этот протокол очистки тканей уточняет смесь предыдущих протоколов, основанных на методе CLARITY (прозрачный липидообменный акриламид-гибридизированный жесткий imaging/immunostaining/in situ-гибридизация-совместимый тканевой гидрогель) и PEGASOS (полиэтиленгликоль(ПЭГ)-ассоциированная система растворителей). Этот усовершенствованный протокол позволил провести более надежное исследование сердечных фибробластов в сердце мыши на исходном уровне и того, как они реагируют на различные типы травм. Протокол прост и воспроизводим и поможет охарактеризовать поведение сердечных фибробластов in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с участием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре детской больницы Цинциннати. Учреждение также сертифицировано AAALAC (Американская ассоциация по аккредитации по уходу за лабораторными животными). Мышей усыпляли через вывих шейки матки, а мышам, перенесшим хирургические процедуры выживания, давали облегчение боли (см. Ниже). Все методы, используемые для лечения боли и эвтаназии, основаны на рекомендациях Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации. Все мыши были размещены в кукурузных початках с водой и пищей, доступными в любое время. Мышей размещали по 4 в клетке с тем же полом. Для операции или очистки неповреденных тканей использовалось равное количество 6-8-недельных самцов и самок мышей.

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные хирургические состояния поддерживались во всех операциях. Хирург переоделся в чистые скрабы и стерильный халат, а затем надел бахилы и сеть для волос. Затем хирург почистил руки хлоргексидином и надел стерильные хирургические перчатки. Хирургу помогал техник, который усыплял, брил и очищал место разреза 3 раза каждый, чередуя 2% хлоргексидина глюконата и 70% изопропанола. Затем мышей привезли к хирургу, и была проведена операция. Между животными инструменты стерилизовали в стерилизаторе из бисера.

1. Рекомбинация кре

  1. Скрещивает мыши Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) с мышами Tcf21-MerCreMer(рисунок 1A)6,21.
  2. Когда потомство этого креста достигнет 6-недельного возраста, вводят внутрибрюшинную инъекцию 75 мг/кг тамоксифена, растворенного в кукурузном масле. 22 Вводят этот тамоксифен дважды, с расставленном 48 ч(рисунок 1B).
  3. После инъекций тамоксифена поместите мышей на диету из тамоксифена (~ 0,4 г / кг тамоксифена цитрата) в течение одной недели. После одной недели тамоксифен чау верните мышей к нормальной автоклавной диете чау в течение одной недели перед выполнением операции(рисунок 1B). Назначьте соответствующее количество мышей (3 на каждое хирургическое состояние), чтобы они не пострадали. Принесите в жертву этих мышей и приступайте к процессу очистки, описанному ниже, после одной недели нормальной диеты чау.
  4. Следуя режиму тамоксифена и рекомбинации, проводят хирургическое вмешательство.

2. Хирургические модели

  1. Ишемия/реперфузия (I/R)23,24
    1. Обезболивать мышей 1,5% газом изофлурана в воздухе помещения в вентилируемом боксе; побрить грудь и шею электрическими кусачками, а затем очистить бритые участки 2% мазком, пропитанным глюконатом хлоргексидина.
    2. Используйте искусственную слезную мазь для предотвращения сухости во время операции, помещая мазь на глаза у седалых мышей.
    3. Выполните разрез средней части шеи с помощью хирургических ножниц, чтобы обеспечить визуализацию трахеи. Интубировать катетером 20 г, поместив интубационную трубку в трахею и визуализируйте катетер трахеи через разрез средней шейки. Поместите мышей на вентилятор во время усыпления газом изофлураном (1,5%) в воздухе помещения.
    4. Сделайте разрез под левой передней конечностью хирургическими ножницами, а межреберные мышцы разрезают между ребрами 3 и 4. Разложите ребра открытыми с помощью втягиваятеля.
    5. Поместите небольшую губку, пропитанную физиологическим раствором, между легким и сердцем, чтобы предотвратить повреждение легкого.
    6. Используя иглу рыболовного крюка (6,5 мм, 3/8 c), обвяжите левую коронарную артерию с помощью съемного скользящего узла с помощью 8-0 пролен.
    7. Снимите губку с помощью щипцов.
    8. Зашивайте межребра, закрытые с помощью плетеного шелка 4-0 и непрерывного шва, а также экстериоризации конца 8-0 проленовый скользящий узел.
    9. Закройте разрезы кожи с помощью местного тканевого клея с торцевым торцевым выступом торцевого узла скольжения.
    10. После одного часа окклюзии потяните внешний конец скользящего узла, чтобы внутренне освободить окклюзию коронарной артерии, облегчив ишемию и вызвав реперфузию.
    11. Вводят 0,02 мл бупренорфина с пролоченным высвобождением 1 мг/мл через субдермальную инъекцию (высвобождение 72 ч) в качестве болеутоляющего средства и помещают мышей в насыщенную кислородом инкубационную камеру при 37 °C отдельно от других животных. Наблюдать за мышами, по крайней мере, каждые 15 минут, пока они не оправятся от анестезии и не смогут поддерживать стернальное или сидячее положение. Верните мышей в их обычное жилище.
    12. Оцените животных на боль и дистресс в течение 48 ч после операции и ежедневно контролируйте место разреза до полного заживления.
    13. Наблюдайте за мышами для гидратации, питания и общего самочувствия после операции до жертвоприношения.
  2. Инфаркт миокарда (ИМ)25,26,27
    1. Выполните шаги 2.1.1–2.1.7.
    2. Используйте непрерывный шов для закрытия межребра с помощью 4-0 плетеного шелка.
    3. Закройте разрез кожи с помощью местного тканевого клея.
    4. Выполните шаги 2.1.11–2.1.13.
  3. Ангиотензин II/фенилэфрин микроосмотическая инфузия насоса
    1. Приготовить приготовить 10 мкг/мкл рабочего раствора ангиотензина II и 500 мкг/мкл рабочего раствора фенилэфрина в стерильных условиях (т.е. в ламинарной проточной вытяжке) путем добавления 1 мг ангиотензина II к 100 мкл стерильного фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и 250 мг гидрохлорида фенилэфрина в 500 мкл PBS.
    2. Рассчитайте разбавление каждого рабочего раствора и конечный объем для дозирования в микроосмотический насос на основе веса мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для мыши размером 20 г требуется 20 г x 14 дней x 1,5 мкг/сут = 420 мкг ангиотензина или 42 мкл рабочего раствора, а также 20 г x 14 дней x 50 мкг/сут = 14000 мкг фенилэфрина гидрохлорида или 28 мкл рабочего раствора.
    3. Для веса каждой мыши разводят рабочий запас препарата в стерильном PBS и заполняют микроосмотические насосы (0,25 мкл/ч, 14 дней, примерно 100 мкл) с помощью иглы 27 г и шприца 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет генерировать скорость потока 1,5мкг∙г-1∙день-1 ангиотензина II и 50мкг∙г-1∙день-1 ∙день фенилэфрина гидрохлорида после размещения в мышах.
    4. Обезболивают мышей 1,5% вдыханием изофлурана (для эффекта) в вентилируемой камере, содержащей комнатный воздух.
    5. Поместите обезболенные мыши на стерильный хирургический стол в опиновом положении и поддерживайте анестезию с ингаляцией газообразного изофлурана (1,5%) через носовой конус.
    6. Используйте искусственную слезную мазь на глазах животного, чтобы предотвратить сухость во время операции.
    7. Сбрите мех над областью имплантации электрическими кусачками для волос и стерилизуйте область, которая будет подстрижена, используя этанол и стерильный тампон. Сделайте небольшой разрез (примерно 1 см) хирургическими ножницами в эпидермальном слое кожи мыши на правой боковой стороне спины, ниже лопатки. Используйте тусклые стороны пары хирургических ножниц, чтобы аккуратно растянуть кожу в области имплантации и вокруг нее, чтобы вставить мининасос.
    8. Поместите микроосмотический насос в разрез и физически маневрируйте слева от дорсальной средней линии мыши, вручную массируя насос под кожей.
    9. Закройте разрез непрерывным швом, используя шелк 4-0 с конусной точечной иглой.
    10. После имплантации насоса вводят бупренорфин с медленным высвобождением в дозе 0,1 мг/кг массы тела через поддермальную инъекцию для обезболивания (72-ч медленное высвобождение). Поместите мышей в инкубационную камеру с кислородом при 37 °C, отдельно от других животных. Контролируйте мышей, по крайней мере, каждые 15 минут, пока они не восстановятся после анестезии и не смогут поддерживать стернальное или сидячее положение.
    11. После восстановления после анестезии в согревающей камере при 37 °C поместите мышей обратно в их стандартные жилые блоки.
    12. Контролируйте мышей на боль и дистресс в течение 48 ч после операции и ежедневно контролируйте место разреза до полного заживления.
    13. Наблюдайте за мышами для гидратации, питания и общего самочувствия после операции до жертвоприношения.

3. Очистка сердец взрослых мышей с помощью модифицированного активного протокола CLARITY

  1. Подготовьте чистую хирургическую область, стерилизовав поверхность операции и все хирургические инструменты 70% этанолом. Готовят раствор из холодного 1x PBS и 4% параформальдегида (PFA) в PBS (по 100 мл каждый). Носите перчатки, лабораторное пальто, маску для лица и защиту глаз.
  2. Готовят гепариновый буфер путем разбавления 10 единиц гепарина в 0,9% мас./об.растворе натрия хлорида. Вводите каждой мыши внутрибрюшинно 60 мкл гепарина-NaCl с использованием шприца 1 мл и иглы 27 г.
  3. Через пять минут после инъекции раствора гепарина-NaCl обезболивают мышей, используя 1,5% ингаляцию изофлурана (для эффекта) в проветриваемой камере, содержащей комнатный воздух.
  4. Усыпляете мышей шейным вывихом, при котором затылок удерживается плоским, закрытым концом щипцов, в то время как позвоночный столб вывихивается путем вытягивания хвоста.
  5. Очистите вентральную поверхность мыши 70% этанолом на ватном тампоне. Сделайте поперечный разрез 3 см примерно на 3 см ниже кифоидного процесса с помощью хирургических ножниц.
  6. Отделите кожу от подлежащей ткани брюшной стенки, деглуцируя брюшную полость до кляпного отростка (держите кожу ближе всего к хвосту и тяните кожу, ближайшую к голове, вверх к грудной клетке). Сделайте поперечный разрез 2 см в подкожной ткани брюшной стенки на 3 см ниже кистевидного отростка с помощью хирургических ножниц. Сделайте вертикальный разрез из этого поперечного разреза, вверх по средней линии и через грудную клетку. Закрепить грудную клетку назад, обнажив сердце.
  7. Используйте иглу 27 г и шприц 10 мл для введения холодного PBS в верхнюю полую вену и аорту (любые позиционные манипуляции с сердцем следует делать осторожно тупыми щипцами, чтобы избежать прокола), чтобы очистить кровь от сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная перфузия может быть отмечена по подергиванию хвоста и обесцвечиванию легких.
  8. Используйте иглу 27 г и шприц 10 мл для введения холодного 4% PFA в верхнюю полую вену и аорту, чтобы начать процесс фиксации.
  9. Высекаем сердца. Предсердия, правый желудочек и перегородка, а также левый желудочек должны быть разделены с помощью скальпеля с прямым лезвием. Поместите эту ткань в 15 мл центрифужную трубку, заполненную холодным 4% PFA, и поместите на нутритор при 4 °C на ночь.
  10. Промывайте сердце 3 раза в течение 1 ч каждый с холодным 1x PBS, чтобы удалить избыток PFA.
  11. Готовят гидрогель (названный A4P0 для относительной акриламидной/полиакриламидной композиции) путем смешивания следующих химических веществ в 15 мл центрифужной трубки: 10% 40% акриламида, 10% 1x PBS, 80% дистиллированной воды.
  12. Добавляют 0,25% раствор фотоинициатора (2,2-Азобис[2-(2-имидазолин-2ил)пропан)дигидрохлорид) в раствор гидрогеля непосредственно перед погружанием сердца в гидрогель.
  13. Поместите сердце в коническую трубку, содержащую гидрогель. Заверните коническую трубку в фольгу и высиживание в течение ночи при 4 °C без физического нарушения.
  14. Примерно через 14 ч при 4 °C переместите коническую трубку, содержащую сердце, в ванну с шариками 37 °C.
  15. Через 2,5 ч в бисероплетении аккуратно выньте сердце из гидрогеля щипцами.
  16. Промыть сердца 3 раза в течение 1 ч в конической трубке 15 мл, содержащей 1x PBS при 37 °C на нутаторе.
  17. Поместите сердечки в корзину активного аппарата электрофореза с помощью щипцов и поместите крышку на корзину. Убедитесь, что крышка надежно закреплена.
  18. Заполните резервуар активной камеры электрофореза раствором для электрофоретической очистки, налив раствор в камеру.
  19. Как только камера заполнена раствором для электрофоретической очистки, корзину, содержащую сердце, можно погрузить. Надежно поместите колпачок на аппарат для электрофореза.
  20. Запустите аппарат электрофореза при 1,5 А, 37 °C в течение 1,5 ч.
  21. После 1,5 ч электрофореза проверьте сердца визуально, чтобы убедиться, что не осталось непрозрачной ткани. Если области ткани все еще непрозрачны, повторно погружают сердце в раствор электрофореза в электрофоретическую камеру и продолжают электрофорез в течение 0,5 ч за раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофорез следует прекратить при первых признаках повреждения тканей (таких как изнашивание тканей).
  22. Промыть сердца в конической пробирке по 15 мл, содержащей 1x PBS в течение 1 ч, 3 раза каждая, при 37 °C на нутаторе.
  23. Погрузите сердца в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую N,N,N', N'-тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин — обесцвечивающий агент, который уменьшает гемовуофлуоресценцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор следует менять каждые 24 ч, пока сердца не станут полностью чистыми (примерно 2 дня).
  24. Промыть сердца в конической трубке 15 мл с 1x PBS 3 раза по 1 ч каждая, чтобы удалить избыток обесцвечивающего агента.
  25. Готовят раствор для согласования показателей преломления (RIMS), комбинируя 30 мл 0,02 Мфосфатного буфера, 40 г 5-(N-2, 3-дигидроксипропилацетамидо)-2, 4, 6-три-йод-N,N'бис(2, 3 дигидроксипропил)изофталамида с перемешиванием (необходимо полностью растворить — это может занять до часа), 5 мг азида натрия, 50 мкл Tween20 и 1 г 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и отрегулируйте рН до 7,5.
  26. Уравновешиваем сердца в RIMS в течение 48 ч перед визуализацией.

4. Визуализация очищенных сердец с помощью вертикального однофотонного конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат для визуализации состоит из нижней половины стеклянной чашки Петри 10 см, 3D-печатного нижнего резервуара, круглого стеклянного покровного листа и 3D-печатного верхнего резервуара(рисунок 1C–E). 3D-печатные материалы были изготовлены на месте отделом клинической инженерии детской больницы Цинциннати.

  1. Используйте вакуумную смазку для герметизации 3D-печатного нижнего резервуара в стеклянную чашку Петри, положив тонкий слой вакуумной смазки на дно 3D-печатного куска(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резервуар должен иметь ту же высоту, что и образизуемый образец (т.е. образец не должен сжиматься стеклянным покровным слипом, помещенным поверх него, и образец также не должен иметь возможности плавать и перемещаться в резервуаре).
  2. Заполните резервуар RIMS и удалите все пузырьки наконечником пипетки. Поместите сердце в RIMS осторожно, повергнуть стенку левого желудочка вверх, следя за тем, чтобы в раствор не вводились пузырьки.
  3. Прикрепите стеклянную крышку к нижней поверхности 3D-печатного верхнего куска резервуара(дополнительный рисунок 1A)с использованием вакуумной смазки (опять же, путем размещения тонкого слоя вакуумной смазки на 3D-печатном куске и размещения его на крышке)(рисунок 1D).
  4. Поместите стеклянную крышку и верхний резервуар, закрывая стороной вниз, на нижний резервуар(Дополнительный рисунок 1B),без введения пузырьков. Адгезия между RIMS и скольжением крышки обеспечит уплотнение между верхней и нижней частями резервуара(рисунок 1E).
  5. Наполните верхний резервуар глицерином для использования с 10-кратным целью погружения глицерина.
  6. Используйте однофотонный микроскоп, оснащенный многофотонной конфокальной сканируемой головой, чтобы получить изображение очищенных сердец.
  7. Опустите ступень однофотонного микроскопа и поместите чашку Петри, содержащую образец, в центр сцены. Поднимите ступень и опустите 10-кратный цель погружения глицерина в глицерин в верхнем резервуаре аппарата для отбора проб. Убедитесь, что образец находится в фокусе, посмотрев на край образца с помощью окуляров.
  8. Переключитесь с вида окуляра на вид камеры на компьютере, нажав на кнопку live.
    1. Установите параметры X и Y, сначала расположив наиболее широкую часть образца ткани, которая должна находиться на дне чашки Петри.
    2. Нажмите на ND Acquisition и пользовательский многоточечный. Создайте многоточечные точки, сначала найдя середину образца ткани с помощью джойстика, чтобы провести слева направо и сверху вниз.
    3. Затем, основываясь на размере ткани, определите необходимый размер плитки (обычно 6 х 5 для сердца мыши 6-8-недельного ребенка). Сделайте это, запустив тестовую визуализацию, захватив только параметры X и Y (снимите флажок z на вкладке ND Acquisition),чтобы проверить, была ли захвачена вся длина и ширина ткани.
  9. Чтобы задать параметры z, откройте навигацию XYZи нажимайте на значки вверх и вниз, пока не найдите верхнюю и нижнюю части образца.
    1. Откройте панель коррекции интенсивности Z и отрегулируйте флуоресценцию в верхней, средней и нижней части ткани, чтобы скорректировать плотность ткани, увеличивая или уменьшая мощность лазера в каждой точке z. Установите их, щелкнув стрелку установки справа от панели коррекции интенсивности Z.
    2. Установите размер шага Z на панели ND Acquisition на 5 мкм.
  10. После того, как параметры X, Y и Z сердца очерчены и установлена коррекция z-интенсивности, используйте автоматизированный вертикальный микроскоп с 10-кратным глицериновым иммерсионным объективом с резонансным сканером и фотоумноживательными трубками из арсенида галлия (GaAsP PMT) для изображения очищенных сердец. Убедитесь, что вкладки XY и Z установлены в разделе Сбор ND,и нажмите кнопку Run Z correction.
  11. Сшивайте, размешивайте и обгружайте полученные изображения, открыв многоточечное изображение в программном обеспечении для обработки и нажав на кнопку стежка. Под изображениемнажмите на слепое размешивание, 2 канала,а затем найдите. и Под изображениемнажмите на denoise.ai,затем нажмите на флуоресцентный канал выбора (т. Е. GFP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс приводит к 3D-изображению GFP-положительных фибробластов во всем левом желудочке.
  12. Используйте программное обеспечение для вторичного анализа для дальнейшего выявления закономерностей и тенденций дисперсии сердечных фибробластов. Используйте функцию Spots, запустив программу мастера spots.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечные фибробласты необходимы для исходной функции сердца, а также для ответа на сердечную травму. Предыдущие попытки понять расположение и морфологию этих клеток проводились в основном в 2-D условиях. Тем не менее, была опубликована усовершенствованная техника очистки сердечнойткани (рисунок 2)и 3-D визуализации, которая позволяет проводить расширенную, более детальную визуализацию сердечных фибробластов. С помощью этого метода визуализации было обнаружено, что фибробласты плотно упакова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен усовершенствованный метод очистки тканей, который позволяет визуализировать сердечные фибробласты in vivo, как на исходном уровне, так и после травмы, чтобы охарактеризовать и лучше понять фибробласты в сердце мыши. Этот расширенный протокол устраняет ограничения в существующих протоколах очистки тканей, которые пытались идентифицировать конкретные типы клеток во взрослом или неонатальном сердце12,13,14,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют раскрытий, связанных с содержанием данной рукописи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить CCHMC Confocal Imaging Core за их помощь и руководство в разработке этой модели, а также Мэтта Бати из Clinical Engineering за дизайн всех 3D-печатных деталей. Деметрия Фишер была поддержана грантом на обучение от Национального института здравоохранения (NHLBI, T32 HL125204), а Джеффри Д. Молкентин был поддержан Медицинским институтом Говарда Хьюза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-0 плетеный шелкEthiconK871H
8-0 проленEthicon8730H
40% раствор акриламидаBio-Rad1610140
ангиотензин IISigmaA9525-50G
Искусственная слезная мазьCovetrus048272
DABCO (1,4-диазабицикло[2.2. 2]октан)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture местный тканевый клейWorld Precision Instruments503763
гепаринSigmaH0777
Imaris Start Analysis Software OxfordInstrumentsN/A
Микроосмотические насосыAlzetModel 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareN / A
Nikon A1R HD вертикальный микроскопNikonN/A
Нормальный автоклавный чауLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-дигидроксипропилацетамидо)-2, 4, 6-три-иодо-N,
N'-bis (2, 3 дигидроксипропил) изофталамид		CosmoBioAXS-1002424
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Науки15710
Фенилэфрина гидрохлоридSigmaP6126-10G
фотоинициаторWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Stock No:012429
Азид натрияSigma AldrichS2002-5G
раствор хлорида натрияHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
ТамоксифенSigma AldrichT5648
Тамоксифен пищевойEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Квадрол, N,N,N′,N′-Тетракис(2-Гидроксипропил)этилендиамин, обесцвечивающий агентMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity Электрофоретическая очищающая камераLogos BiosystemsC30001
Электрофоретический очищающий раствор X-ClarityLogos BiosystemsC13001
X-Clarity корзина для электрофореза LogosBiosystemsC12001
X-Clarity держатель для электрофорезаLogos BiosystemsC12002

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

Похожие статьи