Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метаболомика - это методология, используемая для идентификации и количественной оценки многих низкомолекулярных промежуточных продуктов и продуктов метаболизма в клетке, ткани, органе, биологической жидкости или организме. Метаболомика традиционно фокусируется на водорастворимых метаболитах. Водорастворимый метаболом является конечным продуктом сложной клеточной сети, которая объединяет различные геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные и экологические факторы. Следовательно, метаболомический анализ непосредственно оценивает результат действия для всех этих факторов во множестве биологических процессов в различных организмах. Одним из таких организмов является почкование дрожжей Saccharomyces cerevisiae,одноклеточный эукариот с полностью секвенированным геномом. Поскольку S. cerevisiae поддастся всестороннему молекулярному анализу, он используется в качестве модели для препарирования механизмов, лежащих в основе многих биологических процессов в эукариотической клетке. Универсальный аналитический метод для надежной, чувствительной и точной количественной оценки водорастворимого метаболома обеспечит необходимую методологию для анализа этих механизмов. Здесь представлен протокол оптимизации условий гашения метаболической активности и извлечения водорастворимых метаболитов из клеток S. cerevisiae. Протокол также описывает использование жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа экстрагированных водорастворимых метаболитов. Описанный здесь метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно оценить более 370 водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами, включая различные структурные изомеры и стереоизомерные формы этих метаболитов. Эти метаболиты включают различные молекулы-носители энергии, нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды, промежуточные продукты гликолиза и промежуточные продукты трикарбоксового цикла. Метод нецелевой метаболомики LC-MS/MS чувствителен и позволяет идентифицировать и количественно оценить некоторые водорастворимые метаболиты в концентрациях до 0,05 пмоль/мкл. Метод успешно используется для оценки водорастворимых метаболомов диких и мутантных дрожжевых клеток, культивированных в различных условиях.
Введение
Водорастворимые метаболиты представляют собой низкомолекулярные промежуточные продукты и продукты метаболизма, которые способствуют необходимым клеточным процессам. Эти эволюционно сохраненные процессы включают преобразование питательных веществ в пригодную для использования энергию, синтез макромолекул, клеточный рост и передачу сигналов, контроль клеточного цикла, регуляцию экспрессии генов, реакцию на стресс, посттрансляционную регуляцию метаболизма, поддержание функциональности митохондрий, везикулярный клеточный транспорт, аутофагию, клеточное старение и регулируемую гибель клеток1,2,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изготовление и стерилизация среды для выращивания дрожжей
- Сделайте 180 мл полного дрожжевого экстракта со средой бактопептона (YP). Полная среда YP содержит 1% (мас./об.) дрожжевого экстракта и 2% (мас./об.) бактопептона.
- Распределите 180 мл среды YP поровну на четыре колбы Эрленмейера по 250 мл. Каждая из этих колбы содержит 45 мл среды YP.
- Стерилизуйте колбы средой YP путем автоклавирования при 15 psi/121 °C в течение 45 мин.
2. Штамм дрожжей дикого типа
- Используйте штамм BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Выращивание дрожжей в среде YP, с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы улучшить количественную оценку водорастворимых метаболитов в дрожжевой клетке, мы оптимизировали условия закалки клеток для обнаружения метаболитов. Закалка клеток для этой цели включает в себя быструю остановку всех ферментативных реакций внутри клетки31,33,37,38. Такое остановку клеточной метаболической активности является существенным этапом любого мето.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Чтобы успешно использовать описанный здесь протокол, следуйте профилактическим мерам, описанным ниже. Хлороформ и метанол извлекают различные вещества из лабораторной пластичной посуды. Поэтому относитесь к ним с осторожностью. Избегайте использования пластмасс на этапах, которые включают контакт с любым из этих двух органических растворителей. Используйте боросиликатные стеклянные пипетки для этих шагов. Поднимите эти пипетки с хлороформом и метанолом перед использованием. Используйте только микропипетные наконечники и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы выражаем признательность Центру биологических применений масс-спектрометрии, Центру структурной и функциональной геномики и Центру микроскопии и клеточной визуализации (все в Университете Конкордия) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482 и CRDPJ 515900 - 17). K.M. был поддержан стипендией Арманда К. Аршамбо Университета Конкордия и премией декана университета Конкордия за выдающиеся достижения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химикаты | |||
| Ацетонитрил | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ацетат аммония | Fisher Scientific | A11450 | |
| Бикарбонат аммония | Sigma | 9830 | |
| Бактопептон | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Хлороформ | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Глюкоза | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-гистидин | Sigma | H8125 | |
| L-лейцин | Sigma | L8912 | |
| L-лизин | Sigma | L5501 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A4564 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A4564 | |
| Йодид пропидия | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Экстракт дрожжей | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware оборудование | |||
| 500 мл центрифужные бутылки | Beckman | 355664 | |
| Agilent серии 1100 LC | Agilent Technologies | G1312A | |
| Центрифуга Beckman Coulter Ротор | Beckman | ||
| Beckman Coulter Ротор Beckman | JA-10 | ||
| Centra CL2 Клиническая центрифуга | Thermo Scientific | 004260F | |
| Цифровой термометр | Omega | HH509 | |
| Пенопластовый держатель трубки с фиксатором | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5&микро; m полимер 150 x 2,1 мм) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ультразвуковой ультразвуковой аппарат | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2,1 x 150 мм, 5 & микро; m | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-мл Стеклянные флаконы для образцов с крышками с тефлоновой футеровкой | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Стеклянные шарики (кислотно-промывные, 425-600 μ m) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Гемацитометр | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-мл Высокоскоростные стеклянные центрифужные пробирки с крышками с тефлоновой футеровкой | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Штамм дрожжей | |||
| дрожжи штамм BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
Ссылки
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Ce....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
