Геном организован в ядерном пространстве в различные структуры, которые могут быть выявлены с помощью технологий захвата конформации хромосом. Метод Hi-C в ядре обеспечивает общегеномную коллекцию взаимодействий хроматинов в клеточных линиях дрозофилы, которая генерирует контактные карты, которые могут быть исследованы с разрешением мегабазы на уровне рестстриктного фрагмента.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In-Nucleus Hi-C в клетках дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Геном организован в топологически ассоциирующие домены (TAD), разграниченные границами, которые изолируют взаимодействия между доменами. У дрозофилы механизмы, лежащие в основе формирования и границ TAD, все еще исследуются. Применение описанного здесь метода Hi-C в ядре помогло препарировать функцию архитектурных белковых (AP)-связывающих сайтов на границах TAD, изолируя ген Notch. Генетическая модификация границ доменов, которая вызывает потерю ТОП, приводит к слиянию TAD, транскрипционным дефектам и дальнодейственным топологическим изменениям. Эти результаты предоставили доказательства, демонстрирующие вклад генетических элементов в формирование границ домена и контроль экспрессии генов у дрозофилы. Здесь подробно описан метод Hi-C в ядре, который обеспечивает важные контрольные точки для оценки качества эксперимента вместе с протоколом. Также показано необходимое количество показанных показаний секвенирования и действительных пар Hi-C для анализа геномных взаимодействий в различных геномных масштабах. CRISPR/Cas9-опосредованное генетическое редактирование регуляторных элементов и профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием этого протокола Hi-C в ядре может стать мощной комбинацией для исследования структурной функции генетических элементов.
Введение
У эукариот геном разделен на хромосомы, которые занимают определенные территории в ядерном пространстве во время интерфазы1. Хроматин, образующий хромосомы, можно разделить на два основных состояния: одно из доступных хроматинов, которые являются транскрипционно разрешительными, и другое из компактного хроматина, который является транскрипционно репрессивным. Эти хроматиновые состояния отделяются и редко смешиваются в ядерном пространстве, образуя два отдельных отсека в ядре2. В масштабе субмегабазы границы разделяют области высокочастотных хроматиновых взаимодействий, называемые TADs, которые отмечают хромосомную органи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Фиксация
- Начните с 10 миллионов клеток Schneider line 2 plus (S2R+) для приготовления 17,5 мл клеточной суспензии в среде Schneider, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) при комнатной температуре (RT).
- Добавьте формальдегид без метанола для получения конечной концентрации 2%. Перемешайте и инкубируете в течение 10 минут при RT, заботясь о том, чтобы смешивать каждую минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид является опасным химическим веществом. Соблюдайте соответствующие правила охраны труда и техники безопасности и работайте в вытяжном капюшоне. - Усыхните реакцию добавлением глицина для достижения конечной концентрации 0,125 М и п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ниже описаны результаты успешного протокола Hi-C (см. сводку рабочего процесса протокола Hi-C на рисунке 1A). Существует несколько контрольных точек контроля качества во время эксперимента Hi-C в ядре. Образцы аликвот собирали до (UD) и после (D) этапа ограничения хроматина, а также после лигирования (L). Сшивки были обращены вспять, а ДНК была очищена и запущена на агарозном геле. Мазок 200-1000 bp наблюдался при успешном ограничении Mbo I(рисунок 1B). Ожидаемы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный здесь метод Hi-C в ядре позволил детально исследовать топологию генома дрозофилы с высоким разрешением, обеспечивая представление о геномных взаимодействиях в различных геномных масштабах, от хроматиновых петель между регуляторными элементами, такими как промоторы и энхансеры, до TAD и идентификации большого компартмента25. Эта же технология была также эффективно применена к тканям млекопитающих с некоторыми модификациями33. Например, при обработке ткани вмес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Программы технологических инноваций и поддержки исследований UNAM (PAPIIT) IN207319 и грантом Национального совета по науке и технике (CONACyT-FORDECyT) номер 303068. А.Е.-Л. является студентом магистратуры при поддержке Национального совета по науке и технике (CONACyT) CVU No 968128.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% (об/об.) раствор параформальдегида | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| фермент ClaI | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne стрептабидин C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) стерильная фильтрованная | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI большой фрагмент | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Буфер для лигирования | NEB | B020S | |
| Фермент MboI | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Неионогенное поверхностно-активное вещество для добавления в буфер лизиса |
| PE адаптер 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE | |
| адаптер 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGCT CTTCCGATCT-3'PE | |
| ПЦР праймер 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACG CTCTTCCGATCT-3'PE | |
| PCR праймер 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Фенол | |
| : Хлороформ:Изоамиловый спирт 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Праймер 1 (известное взаимодействие, Рисунок 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer | |
| 2 (известные взаимодействия, Рисунок 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAAACGTTTT-3'Коктейль | |
| ингибитора протеазы | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Рош | 10109142001 | |
| Бусины SPRI | Beckman | B23318 | |
| T4 ДНК-лигаза | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 ДНК-полимераза | NEB | M0203S | |
| T4 полинуклеотидкиназа (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | ДНК-полимераза |
| Triton X-100 | Неионогенное поверхностно-активное вещество для гашения SDS |
Ссылки
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interact....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
