Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In-Nucleus Hi-C в клетках дрозофилы

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62106

⸱

15 сентября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

В этой статье

Краткое содержание

Геном организован в ядерном пространстве в различные структуры, которые могут быть выявлены с помощью технологий захвата конформации хромосом. Метод Hi-C в ядре обеспечивает общегеномную коллекцию взаимодействий хроматинов в клеточных линиях дрозофилы, которая генерирует контактные карты, которые могут быть исследованы с разрешением мегабазы на уровне рестстриктного фрагмента.

Аннотация

Геном организован в топологически ассоциирующие домены (TAD), разграниченные границами, которые изолируют взаимодействия между доменами. У дрозофилы механизмы, лежащие в основе формирования и границ TAD, все еще исследуются. Применение описанного здесь метода Hi-C в ядре помогло препарировать функцию архитектурных белковых (AP)-связывающих сайтов на границах TAD, изолируя ген Notch. Генетическая модификация границ доменов, которая вызывает потерю ТОП, приводит к слиянию TAD, транскрипционным дефектам и дальнодейственным топологическим изменениям. Эти результаты предоставили доказательства, демонстрирующие вклад генетических элементов в формирование границ домена и контроль экспрессии генов у дрозофилы. Здесь подробно описан метод Hi-C в ядре, который обеспечивает важные контрольные точки для оценки качества эксперимента вместе с протоколом. Также показано необходимое количество показанных показаний секвенирования и действительных пар Hi-C для анализа геномных взаимодействий в различных геномных масштабах. CRISPR/Cas9-опосредованное генетическое редактирование регуляторных элементов и профилирование геномных взаимодействий с высоким разрешением с использованием этого протокола Hi-C в ядре может стать мощной комбинацией для исследования структурной функции генетических элементов.

Введение

У эукариот геном разделен на хромосомы, которые занимают определенные территории в ядерном пространстве во время интерфазы1. Хроматин, образующий хромосомы, можно разделить на два основных состояния: одно из доступных хроматинов, которые являются транскрипционно разрешительными, и другое из компактного хроматина, который является транскрипционно репрессивным. Эти хроматиновые состояния отделяются и редко смешиваются в ядерном пространстве, образуя два отдельных отсека в ядре2. В масштабе субмегабазы границы разделяют области высокочастотных хроматиновых взаимодействий, называемые TADs, которые отмечают хромосомную организацию3,4,5. У млекопитающих границы TAD занимают когезионные и CCCTC-связывающий фактор (CTCF)6,7,8. Когезионный комплекс выдавливает хроматин и останавливается на CTCF-сайтах связывания, которые расположены в конвергентной ориентации в геномной последовательности с образованием стабильных хроматиновых петель9,10,13,14. Генетическое нарушение сайта связывания ДНК CTCF на границах или снижение CTCF и изобилия белка когезгена приводит к аномальным взаимодействиям между регуляторными элементами, потере образования TAD и дерегуляции экспрессии генов9,10,11,13,14.

У дрозофилы границы между TAD заняты несколькими ПП, включая граничный элемент-ассоциированный фактор 32 кДа (BEAF-32), связывающий белок Motif 1 (M1BP), центросомальный белок 190 (CP190), супрессор волосатого крыла (SuHW) и CTCF, и обогащены активными модификациями гистонов и полимеразой II16,17,18. Было высказано предположение, что у дрозофилы TAD появляются как следствие транскрипции13,17,19,и точная роль независимых ТОс в формировании границ и изоляционных свойствах все еще находится в стадии изучения. Таким образом, вопрос о том, являются ли домены у дрозофилы единственным следствием агрегации областей сходных транскрипционных состояний или же АП, включая CTCF, способствуют формированию границ, еще предстоит полностью охарактеризовать. Исследование геномных контактов с высоким разрешением стало возможным благодаря разработке технологий захвата конформации хромосом в сочетании с секвенированием следующего поколения. Протокол Hi-C был впервые описан с этапом лигирования, выполненным «в растворе»2 в попытке избежать ложных продуктов лигирования между фрагментами хроматина. Однако несколько исследований указали на осознание того, что полезный сигнал в данных исходил от продуктов лигирования, образуемых в частично лизированных ядрах, которые не находились в растворе20,21.

Затем протокол модифицировали для выполнения лигирования внутри ядра в рамках одноклеточного эксперимента Hi-C22. Протокол Hi-C в ядре был впоследствии включен в клеточную популяцию Hi-C, чтобы обеспечить более последовательное покрытие во всем диапазоне геномных расстояний и получить данные с меньшим техническим шумом23,24. Протокол, подробно описанный здесь, основан на популяционно-ядровом протоколеHi-C 23,24 и использовался для исследования последствий генетического удаления ДНК-связывающих мотивов для CTCF и M1BP с границы домена в локусе гена Notch в Drosophila25. Результаты показывают, что изменение ДНК-связывающих мотивов для ТОП на границе имеет радикальные последствия для формирования домена Notch, более крупных топологических дефектов в областях, окружающих локус Notch, и дерегуляции экспрессии генов. Это указывает на то, что генетические элементы на границах домена важны для поддержания топологии генома и экспрессии генов у Drosophila25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Фиксация

  1. Начните с 10 миллионов клеток Schneider line 2 plus (S2R+) для приготовления 17,5 мл клеточной суспензии в среде Schneider, содержащей 10% фетальной бычий сыворотки (FBS) при комнатной температуре (RT).
  2. Добавьте формальдегид без метанола для получения конечной концентрации 2%. Перемешайте и инкубируете в течение 10 минут при RT, заботясь о том, чтобы смешивать каждую минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид является опасным химическим веществом. Соблюдайте соответствующие правила охраны труда и техники безопасности и работайте в вытяжном капюшоне.
  3. Усыхните реакцию добавлением глицина для достижения конечной концентрации 0,125 М и перемешайте. Инкубировать в течение 5 мин на RT, затем 15 мин на льду.
  4. Центрифуга на 400 × г при РТ в течение 5 мин, а затем в течение 10 мин при 4 °С; отбросьте супернатант. Тщательно повторно суспендировать гранулы в 25 мл холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора.
  5. Центрифугу при 400 × г в течение 10 мин при 4 °С, затем выбросьте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы продолжаете работу с протоколом, перейдите к шагу 2.1 для лизиса; в противном случае заморозьте гранулу во вспышке в жидкостиN2 и храните гранулу при -80 °C.

2. Лизис

  1. Повторно суспендировать клетки в 1 мл ледяно-холодного лизисного буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8; 0,2% неионного поверхностно-активного вещества (см. Таблицу материалов);10 мМ NaCl; 1x ингибиторы протеазы) и корректировать объем до 10 мл с помощью ледяно-холодного лизисного буфера. Отрегулируйте объем для получения концентрации 1 × 106 клеток/мл. Инкубировать на льду в течение 30 мин, перемешивая каждые 2 мин, переворачивая трубки.
  2. Центрифугируют ядра при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С, а затем осторожно отбрасывают супернатант. Вымойте гранулу 1x с 1 мл буфера холодного лизиса и переложите ее в микроцентрифужную трубку. Промыть гранулу 1x с 1 мл холодного 1,25x рестепензиционного буфера и повторно суспендовать каждую ячейку гранулы в 360 мкл 1,25x буфера ограничения.
  3. Добавьте 11 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) на пробирку (0,3% конечной концентрации), тщательно перемешайте путем пипетирования и инкубируют при 37 °C в течение 45 мин, встряхивая при 700-950 об/мин. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрушить сгустки несколько раз во время инкубации.
  4. Омолаживают SDS путем добавления 75 мкл неионного поверхностно-активного вещества (10% раствор, см. Таблицу материалов)на пробирку (конечная концентрация 1,6% и инкубируют при 37 °C в течение 45 мин, встряхивая при 950 об/мин. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки во время инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если скопления большие и их трудно разрушить, уменьшите скорость вращения до 400 об/мин во время обработки SDS и поверхностно-активным веществом. Если сгустки трудно дезагрегировать путем пипетирования, разделите выборку на две части; регулировать объемы буфера ограничения, SDS и поверхностно-активного вещества; и приступить к пермеабилизации. Затем раскрутите ядра с минимальной скоростью (200 × g),осторожно отбросьте супернатант, объедините образцы вместе в 1X рестракционный буфер и приступайте к пищеварению. Возьмите аликвоту 10 мкл в качестве непереваренный образец (UD).

3. Ферментативное пищеварение

  1. Переварить хроматин, добавив 200 единиц (U) Mbo I на пробирку, и инкубировать при 37 °C в течение периода от 4 ч до ночи при вращении (950 об/мин).
  2. На следующий день добавьте дополнительно 50 ЕД МБО I на пробирку и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч при вращении (950 об/мин).
  3. Инактивируют фермент путем инкубации пробирок при 60 °C в течение 20 мин. Поместите трубки на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 10 мкл аликвоты в качестве переваренный образец (D).

4. Биотинилирование концов ДНК

  1. Чтобы заполнить свесы фрагмента рестрикции и пометить концы ДНК биотином, добавьте по 1,5 мкл по 10 мМ dCTP, dGTP, dTTP, 20 мкл 0,4 мМ биотина dATP, 17,5 мкл буфера Tris low-EDTA (TLE) [10 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0] и 10 мкл 5 U/мкл Кленова (днк-полимераза I большой фрагмент) во все трубки. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 75 мин при 37 °C. Встряхивать при 700 об/мин каждые 10 с в течение 30 с. Поместите все трубки на лед во время приготовления лигационной смеси.

5. Лигирование

  1. Переложите каждую переваренный хроматиновую смесь в отдельную пробирку объемом 1 мл с лигационной смесью (100 мкл 10-кратного лигационного буфера, 10 мкл 10 мг/мл бычий сывороточного альбумина, 15 ЕД Т4 ДНК-лигазы и 425 мкл двойной дистиллированной воды [ddH2O]). Тщательно перемешайте путем бережного пипетирования и высиживайте в течение ночи при 16 °C.

6. Реверсирование сшивок и очистка ДНК

  1. Разлагают белки, добавляя 50 мкл 10 мг/мл протеиназы К на пробирку, и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч. Обратные сшивки путем повышения температуры до 65 °C и инкубируют в течение ночи.
  2. Разлагают РНК путем добавления 20 мкл 10 мг/мл РНКазы А и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
  3. Выполните экстракцию фенола: хлороформа с последующим осаждением этанола.
    1. Добавьте 1 объем фенол-хлороформа и тщательно перемешайте путем инверсии, чтобы получить однородную белую фазу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол является опасным химическим веществом. Соблюдайте соответствующие правила охраны труда и техники безопасности. Работа в вытяжном капюшоне.
    2. Центрифуга при 15 000 × г в течение 15 мин. Перенесите водную фазу в свежую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл. Выполните обратное извлечение нижнего слоя со 100 мкл буфера TLE и перенесите водную фазу в ту же трубку объемом 2 мл.
    3. Осаждение ДНК путем добавления 2 объемов 100% этилового спирта (EtOH), 0,1 объема 3 M ацетата натрия и 2 мкл 20 мг/мл гликогена. Инкубировать при -20 °C в течение периода от 2 ч до ночи.
    4. Открутите при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и промыть гранулы 2x ледяным 70% EtOH. Высушите гранулы на RT и повторно суспендируют в 100 мкл буфера TLE. Количественно определить ДНК с помощью фторогенного красителя, который избирательно связывается с ДНК и флуорометра в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить продукты лигирования при 4 °C в течение короткого срока или при -20 °C в течение длительного времени. Используйте аликвоту (100 нг) материала в качестве лигатированного образца (L) для контроля качества.

7. Оцените качество шаблона Hi-C

  1. Качественный контроль пищеварения и перевязки
    1. Очистите ДНК от аликвот UD и D путем обращения вспять сшивок и выполните экстракцию фенола: хлороформа и осаждение этанола, как описано выше.
    2. Загрузите 100 нг образцов UD, D и L в 1,5% агарозном геле. Ищите мазок, сосредоточенный около 500 bp в образце D, по сравнению с высокомолекулярной полосой для образца L (см. репрезентативные результаты).
  2. Количественный контроль эффективности пищеварения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более точной оценки эффективности пищеварения используйте образцы UD и D в качестве шаблонов для выполнения количественных полимеразных цепных реакций (qPCR) с использованием праймеров, разработанных следующим образом.
    1. Спроектируйте пару праймеров, которая усиливает фрагмент ДНК, содержащий сайт рестрикции ДНК для фермента, используемого для пищеварения (Mbo I в настоящем протоколе), называемого R в формуле на этапе 7.2.3.
    2. Спроектируйте пару праймеров, которая усиливает контрольный фрагмент ДНК, который не содержит рестрикционный сайт для фермента, используемого для пищеварения (Mbo I для настоящего протокола), называемого C в формуле на этапе 7.2.3.
    3. Используйте пороговые значения цикла (значения Ct) усиления для расчета эффективности ограничения в соответствии с формулой, показанной ниже:
      % ограничения = 100 - 100/2{(ctr - ctc)d - (ctr - ctc)UD}
      Где CtR относится к значению Ct фрагмента R, а CtC относится к значению Ct фрагмента C для образца D и образца UD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процент рестрикции отражает эффективность фермента рестрикции, расщепляющего ограниченный (R) фрагмент ДНК по сравнению с контрольным (C) фрагментом ДНК, который не содержит сайт рестригированной ДНК. Рекомендуется КПД ограничения ≥ 80%.
  3. Обнаружение известных взаимодействий
    1. Выполнение ПЦР для ампляции внутреннего контроля лигирования для изучения взаимодействий на коротких и/или средних или больших расстояниях (см. репрезентативные результаты).
    2. В качестве альтернативы, конструкция грунтовки для усиления продукта лигирования, в котором грунтовки находятся в прямо-прямой или обратной ориентации в соседних рестригационных фрагментах.
  4. Контроль заливки и маркировки биотином
    1. Проверить маркировку Hi-C и эффективность лигирования путем амплификации и переваривания известного взаимодействия или продукта лигирования между соседними рестригационными фрагментами в геноме, как описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная заправка и лигирование сайта Mbo I (GATC) генерирует новый сайт для фермента рестрикции Cla I (ATCGAT) в лигативном соединении и регенерирует сайт Mbo I.
    2. Переварите продукт ПЦР с Mbo I, Cla I или обоими. После обведения образцов на 1,5-2% геля оценить относительное число лигационных соединений 3C и Hi-C путем количественной оценки интенсивности разрезанных и неразрезанных полос26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность > 70% желательна (см. репрезентативные результаты).

8. Ультразвук

  1. Обработать образцы ультразвуком для получения 200-500 фрагментов ДНК. Для прибора, используемого в настоящем протоколе (см. Таблицу материалов),разбавляют образец (от 5 до 10 мкг) в 130 мкл ddH2O на пробирку и устанавливают прибор на обработку ультразвуком до 400 bp: уровень заполнения: 10; коэффициент пошлины: 10%; пиковая мощность (Вт): 140; циклов на всплеск: 200; время (ы): 80.

9. Удаление биотина/восстановление конца

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, показанные ниже, скорректированы на 5 мкг ДНК Hi-C.

  1. Для удаления биотина перенесите образец (130 мкл) в свежую микроцентрифужную трубку. Добавьте 16 мкл 10-кратного лигационного буфера, 2 мкл 10 мМ dATP, 5 мкл ДНК-полимеразы T4 (15U) и 7 мкл ddH2O (160 мкл общего объема). Инкубировать при 20 °C в течение 30 мин.
  2. Добавьте 5 мкл 10 мМ дНТП, 4 мкл 10-кратного лигационного буфера, 5 мкл полинуклеотидкиназы Т4 (10 ЕД/мкл), 1 мкл Кленова и 25 мкл ddH2O (200 мкл общего объема). Инкубировать при 20 °C в течение 30 мин.

10. Выбор размера

  1. Чтобы выбрать фрагменты в основном в диапазоне размеров 250-550 bp, выполните последовательный выбор размера обратимой иммобилизации (SPRI) сначала с 0,6x, а затем 0,90x в соответствии с инструкциями производителя и элюируйте ДНК с использованием 100 мкл TLE.

11. Биотин вытягивает / A-хвост / адаптер лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните промывку путем повторного сусщения магнитных шариков путем вихря, вращайте образцы в течение 3 минут на вращающемся колесе, а затем ненадолго раскрутите образец и поместите его на магнитную подставку. Дайте бусинам прилипнуть к магниту, отбросьте супернатант и перейдите к следующему этапу стирки. Выполняйте промывки при 55 °C на термоблоке с вращением вместо вращающегося колеса.

  1. Составьте конечный объем до 300 мкл на образец с помощью TLE для вытягивания. Подготовьте буферы для промывки шариков: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Используйте 150 мкл магнитных шариков, связанных со стрептавидином (см. Таблицу материалов)на библиотеку. Вымойте бусины 2x с 400 мкл 1x TB. Затем повторно суспендирует бусины в 300 мкл 2x NTB.
  3. Смешайте шарики с материалом Hi-C 300 мкл и инкубировать в RT в течение 30 минут на вращающемся колесе, чтобы биотин связывались с шариками стрептавидина.
  4. Вымойте шарики с 400 мкл 0,5 ТБ и высиживайте при 55 °C в течение 3 минут, вращаясь со скоростью 750 об/мин. Вымойте бусины в 200 мкл 1x рестистримного буфера.
  5. Повторно суспендировать шарики в 100 мкл хвостовой смеси dATP (5 мкл 10 мМ dATP, 10 мкл 10-кратного рестренирующего буфера, 5 мкл экзо- кленова и 80 мкл ddH2O). Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
  6. Удалите супернатант, промыть шарики 2x с 400 мкл 0,5x TB, насиживая при 55 °C в течение 3 мин и вращая при 750 об/мин.
  7. Вымойте шарики 400 мкл 1x NTB, а затем 100 мкл 1x лигационного буфера.
  8. Повторно суспендировать шарики в 50 мкл 1x лигационного буфера и перенести суспензию в новую трубку. Добавить 4 мкл предварительно отожженных ПЭ-адаптеров (запас 15 мкМ) и 2 мкл Т4-лигазы (400 ЕД/мкл, т.е. 800 Ед/пробирка); инкубируют на РТ в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно отжиг адаптеров путем добавления равных объемов адаптеров PE 1.0 и PE 2.0 (запас 30 мкМ) и инкубации в течение 10 мин на RT (см. Таблицу материалов).
  9. Отбить бусины, удалив супернатант и промыв бусины в 2 раза 400 мкл туберкулеза. Вымойте бусины 200 мкл 1x NTB, затем 100 мкл 1x буфера ограничения и повторно суспендирует шарики в 40 мкл 1x буфера ограничения.

12. ПЦР-амплификация

  1. Установите ПЦР объемом 25 мкл с 5, 6, 7 и 8 циклами. Для каждой ПЦР используйте:
    Рецепт реакции
    Бусины Hi-C2.5 мкл
    10 мкМ ПЭ ПЦР праймер 1 (Таблица материалов)0.75 мкл
    10 мкМ ПЭ ПЦР праймер 2 (Таблица материалов)0.75 мкл
    10 мМ дНТП0.6 мкл
    5-кратный реакционный буфер5 мкл
    ДНК-полимераза0.3 мкл
    ддН2О14.65 мкл
    Итог25 мкл
    ЦикловТемператураВремя
    198 °С30 с
    n циклов98 °С10 с
    65 °С30 с
    72 °С30 с
    172 °С7 мин

13. Окончательная ПЦР-амплификация

  1. Выполните окончательную амплификацию ПЦР, используя те же условия, которые описаны выше, и количество выбранных циклов. Разделите образец, используя 5 мкл шариков Hi-C в качестве шаблона в реакциях по 50 мкл.
  2. Соберите все реакции ПЦР и перенесите их в свежую трубку. Используйте магнит для удаления шариков стрептавидина и восстановления супернатанта (продукты ПЦР). Переложите бусины в свежую трубку, вымойте бусины, как указано на этапе 11.2.9, и храните в 1x буфере ограничения при 4 °C в качестве резервной копии.
  3. Очищайте продукты ПЦР, используя в 0,85 раза больше объема шариков SPRI в соответствии с инструкциями производителя. Elute с 30 мкл буфера TLE.
  4. Количественно оцените библиотеку Hi-C с помощью флуорометрического прибора и подтвердите качество библиотеки с помощью капиллярного электрофореза на основе чипа.
  5. В качестве последней контрольной точки качества используйте 1 мкл библиотеки Hi-C в качестве шаблона для выполнения реакции ПЦР с использованием 10 циклов с использованием тех же условий, описанных на этапе 12.1. Разделите продукт ПЦР на две микроцентрифужные трубки: переварите одну с Cla I и оставьте другую непереваренным в качестве контрольной. Запускают препараты в 1,5-2% агарозном гелевом (см. репрезентативные результаты).
  6. Переходите к парной последовательности 50 bp или 75 bp на подходящей платформе секвенирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ниже описаны результаты успешного протокола Hi-C (см. сводку рабочего процесса протокола Hi-C на рисунке 1A). Существует несколько контрольных точек контроля качества во время эксперимента Hi-C в ядре. Образцы аликвот собирали до (UD) и после (D) этапа ограничения хроматина, а также после лигирования (L). Сшивки были обращены вспять, а ДНК была очищена и запущена на агарозном геле. Мазок 200-1000 bp наблюдался при успешном ограничении Mbo I(рисунок 1B). Ожидаемы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь метод Hi-C в ядре позволил детально исследовать топологию генома дрозофилы с высоким разрешением, обеспечивая представление о геномных взаимодействиях в различных геномных масштабах, от хроматиновых петель между регуляторными элементами, такими как промоторы и энхансеры, до TAD и идентификации большого компартмента25. Эта же технология была также эффективно применена к тканям млекопитающих с некоторыми модификациями33. Например, при обработке ткани вмес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Программы технологических инноваций и поддержки исследований UNAM (PAPIIT) IN207319 и грантом Национального совета по науке и технике (CONACyT-FORDECyT) номер 303068. А.Е.-Л. является студентом магистратуры при поддержке Национального совета по науке и технике (CONACyT) CVU No 968128.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% (об/об.) раствор параформальдегидаAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
фермент ClaINEBR0197S
COVARIS UltrasonicatorCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne стрептабидин C1Invitrogen65002
Фетальная бычья сыворотка (FBS) стерильная фильтрованнаяSigmaF9665
Klenow Dna PolI большой фрагментNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
Буфер для лигированияNEBB020S
Фермент MboINEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Неионогенное поверхностно-активное вещество для добавления в буфер лизиса
PE адаптер 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
адаптер 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGCT
CTTCCGATCT-3'PE
ПЦР праймер 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR праймер 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'Фенол
: Хлороформ:Изоамиловый спирт 25:24:1SIGMAP2069
Праймер 1 (известное взаимодействие, Рисунок 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (известные взаимодействия, Рисунок 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAAACGTTTT-3'Коктейль
ингибитора протеазыRoche4693132001
Proteinase KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseРош10109142001
Бусины SPRIBeckmanB23318
T4 ДНК-лигазаInvitrogen15224-025
T4 ДНК-полимеразаNEBM0203S
T4 полинуклеотидкиназа (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SДНК-полимераза
Triton X-100Неионогенное поверхностно-активное вещество для гашения SDS

Ссылки

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Организация хроматинатопологически ассоциированные доменыграницы TADархитектурные белкипереваривание хроматинабиотиновое осаждениегенетическое редактирование CRISPRгеномные взаимодействия
In-Nucleus Hi-C в клетках дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.