Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эксплант ткани роговицы свиней для изучения эффективности противовирусных препаратов вируса простого герпеса-1

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62195

⸱

20 сентября 2021 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Illinois at Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Описано применение свиной роговицы для проверки противовирусной эффективности экспериментальных препаратов.

Аннотация

Вирусы и бактерии могут вызывать различные дефекты поверхности глаз и дегенерацию, такие как раны и язвы, через инфекцию роговицы. С серораспространенностью, которая колеблется от 60-90% во всем мире, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) обычно вызывает слизисто-кожные поражения орофациальной области, которые также проявляются как поражения и связанная с инфекцией слепота. Хотя современные противовирусные препараты эффективны, появление резистентности и сохранение токсичных побочных эффектов требует разработки новых противовирусных препаратов против этого вездесущего патогена. Хотя оценка in vitro предоставляет некоторые функциональные данные относительно появляющегося противовирусного препарата, они не демонстрируют сложность глазной ткани in vivo. Однако исследования in vivo стоят дорого и требуют обученного персонала, особенно при работе с вирусными агентами. Следовательно, модели ex vivo являются эффективными, но недорогими шагами для противовирусного тестирования. Здесь мы обсуждаем протокол изучения инфекции ВПГ-1 с использованием роговиц свиней ex vivo и метод их местного лечения с использованием существующих и новых противовирусных препаратов. Мы также демонстрируем метод проведения анализа бляшек с использованием ВПГ-1. Подробные методы могут быть использованы для проведения аналогичных экспериментов по изучению инфекций, которые напоминают возбудителя ВПГ-1.

Введение

Люди, страдающие глазными инфекциями, часто страдают от потеризрения 1. С высокой серораспространенностью во всем мире инфицированные ВПГ лица страдают от повторяющихся глазных инфекций, которые приводят к рубцеванию роговицы, стромальному кератиту и неоваскуляризации2,3,4,5. Инфекции ВПГ также показали, что вызывают реже ряд серьезных состояний среди пациентов с ослабленным иммунитетом, нелеченных пациентов, таких как энцефалит и системная заболеваемость6,7,8. Такие препараты, как Ацикловир (ЯЦВ) и его аналоги нуклеозидов, показали последовательный успех в сдерживании инфекции ВПГ-1 и даже контроле реактивации, однако длительное использование этих препаратов связано с почечной недостаточностью, аномалиями плода и неспособностью ограничить появление лекарственной устойчивости к развивающимся вирусным штаммам9,10,11,12,13. Сложности, связанные с глазными инфекциями ВПГ-1, ранее изучались in vitro с использованием монослоев и 3D-культур клеток роговицы человека и in vivo с использованием мышиных или кроличьих глазных инфекций. Хотя эти модели in vitro предоставляют значительные данные о клеточных биологических компонентах инфекций ВПГ-1, они, однако, не могут имитировать сложную сложность ткани роговицы и мало что делают для освещения дендритного распространения вируса14. Напротив, хотя системы in vivo более проницательны в демонстрации распространения инфекции в роговице и реакций иммунной активации во время инфекции ВПГ-1, они приходят с оговоркой, что им требуются обученные исследователи и большие учреждения по уходу за животными, чтобы игнорировать эксперименты.

Здесь мы используем роговицу свиней в качестве модели ex vivo для изучения раневой системы, вызванной инфекцией ВПГ-1. Как потенциальная фармакология некоторых лекарств, так и клеточная и молекулярная биология раневой системы, вызванной инфекцией, могут быть изучены с помощью тканевых эксплантных культур. Эта модель также может быть изменена для использования при других вирусных и бактериальных инфекциях. В этом исследовании роговицы свиней использовались для проверки противовирусной эффективности доклинической малой молекулы BX795. Использование роговиц свиней было предпочтительным из-за простоты доступа и экономической эффективности. Кроме того, модели роговицы свиней являются хорошими моделями человеческих глаз, причем роговицы легко изолируются, имеют адекватный размер для инфекции и визуализации и надежны для обработки15. Роговицы свиней также сопоставимы со сложностью моделей роговицы человека как по транспроницаемости роговицы, так и по системной абсорбции15. Используя эту модель для исследования, мы смогли выяснить, как BX795 заслуживает дальнейшего изучения в качестве компетентного ингибитора вирусной инфекции ВПГ-1 и добавить к литературе классификацию его как потенциального маломолекулярного противовирусного соединения16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся свиная ткань, используемая в этом исследовании, была предоставлена сторонней частной организацией, и ни одна из обработк животных не была выполнена персоналом Университета Иллинойса в Чикаго.

1. Материалы

  1. Реагентов
    1. Используйте следующие реагенты для анализа бляшек: порошковая метилцеллюлоза, модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM), фетальная бытовая сыворотка (FBS), пенициллин и стрептомицин (P / S) для анализа бляшек.
    2. Используйте кристаллические фиолетовые таблетки и этанол (молекулярно-биологический сорт) для приготовления кристаллического фиолетового раствора для анализа бляшек.
  2. Среда роста клеток Vero - ЦЕЛЬНАЯ среда DMEM
    1. Откройте флакон со средой DMEM внутри вытяжки для культивации тканей. Извлеките 55 мл среды из бутылки с помощью серологической пипетки и выбросьте ее. Добавить 50 мл FBS P/S к DMEM. Хранить в холодильнике при 4 °C.
  3. Среда для анализа бляшек - Запас 5% метилцеллюлозных сред
    1. Отмерьте 2,5 г порошка метилцеллюлозы с помощью перемешивающего магнита внутри стеклянной бутылки объемом 500 мл и автоклавните ее. После того, как бутылка остынет до комнатной температуры, возьмите 500 мл цельной среды DMEM, содержащей 50 мл FBS и 5 мл P/S, и добавьте ее в стеклянную бутылку, содержащую метилцеллюлозу.
    2. Перемешайте при 4 °C в течение 2 дней с помощью магнитной мешалки. Хранить в холодильнике при 4 °C.
  4. Подготовка среды для иссеченной роговицы свиней
    1. Откройте бутылку с минимально необходимыми средами (MEM) внутри вытяжки для культивирование тканей. Выбросьте 10 мл MEM из бутылки с помощью серологической пипетки.
    2. Добавьте 5 мл инсулина-трансферрина-селена (ИТС) и 5 мл антимикотик-антибиотика (АА) в жиму и охладить при 4°C.
  5. Мастер и рабочий фонд хрустальной фиалки:
    1. Чтобы сделать кристаллический фиолетовый бульоновый раствор, добавьте 1 г кристаллического фиолетового порошка к 100 мл 20% этанола в воде. Этот запас (1% мас./v кристаллической фиалки) можно хранить и использовать до года при хранении в темном месте.
    2. Чтобы сделать из этого рабочий запас, добавьте 50 мл оригинального стоковой раствора на 350 мл воды. Добавьте 100 мл этанола в этот раствор, чтобы получить 500 мл рабочего кристаллического фиолетового раствора (0,1% мас./v кристаллического фиолетового).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба этих раствора необходимо хранить в темноте.

2. Процедура

  1. Выделение роговицы свиней из цельных глаз17
    1. Получив глаза свиней от подходящего продавца, храните на льду, если есть задержка с обработкой тканей, как показано на рисунке 1.
    2. Убедитесь, что во время этой процедуры используются и носят средства индивидуальной защиты, чтобы избежать загрязнения, а также несчастных случаев от разлива стекловидного подела.
    3. Опрыскивайте рабочую зону 70% этанолом для очистки и дезинфекции. Чтобы обеспечить стабильность рабочего пространства, надежно распределите крышку скамейки и лентой по бокам, как показано на рисунке 2.
    4. Поместите глаза свиней на марлю(рисунок 3). Используя марлю 50 мм, держите заднее сечение(рисунок 4A)глаз свиней, как показано на рисунке 4B, одной рукой.
    5. С помощью иглы 30 Г осторожно сделайте один удар примерно по центру эпителиальной поверхности глаза и убедитесь, что строма не повреждена(рисунок 5). Поке должен быть ограничен эпителием (~ 100-200 мкм), чтобы избежать стромального поражения.
    6. Используя острое стерилизованное лезвие, сделайте небольшой разрез на склере на расстоянии 1 мм от роговицы. Обрежьте край роговицы, чтобы стекловидное тело не протекала, используя быстрое и плавное вращательное действие руки(рисунок 6А). Удерживая роговицу у края роговицы-склеры плоским пинцем, с помощью лезвия отрежьте оставшиеся привязные мембраны глаза(рисунок 6В).
    7. Возьмите роговицу и поместите ее в 12-колодезируемую пластину, наложенную 2 мл роговицы. Роговицу следует располагать лицом вверх, что показано в серии шагов на рисунках 7A-D, рисунок 8).
    8. Добавьте 5 мкл раствора вируса, содержащего 5 х 105 бляшек, образующих единицы (ПФЕ) 17 GFP, к санированной площадке на поверхности роговицы. Поместите 12-колодезную пластину, содержащую зараженные роговицы свиней, в инкубатор с 5% CO2 в течение 72 ч.
    9. Распылите любые дополнительные глаза, не используемые в эксперименте, с 10% отбеливателем и надежно утилизируйте в биологические мешки.
  2. Визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус следует визуализировать каждый день перед добавлением лекарств.
    1. Включите стереомикроскоп и светодиодный источник света и позвольте лампе машины прогреться перед визуализацией роговицы. Аккуратно пронесем пластинку роговицы к инструменту, не нарушая раствор. Измените фильтр таким образом, чтобы для просмотра образцов использовался GFP (380-460 нм). Установите время экспозиции на 500 мс для захвата изображений.
    2. Во-первых, поместите пластину роговицы под стереоскоп и захватите изображения с наименьшим увеличением 7,5x. Затем следует серия изображений с увеличением увеличения (например, 15x, 25x, 35x), так что все вирусное распространение и образование дендритов визуализируются.
    3. Обязательно верните зараженные роговицы обратно в инкубатор культуры тканей и сохраните все снимки, которые были сделаны.
  3. Количественная оценка вирусной инфекции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титры вируса из роговицы свиней следует оценивать каждый день для анализа эффекта от медикаментозного лечения.
    1. Для количественной оценки вируса засейте клетки Vero плотностью 5 х 105 клеток на скважину, если использовать 6-колодезную пластину, как это было сделано в этом эксперименте. Делайте это за день до заражения. Инкубировать позолоченные клетки в течение ночи, чтобы убедиться, что они сливаются для количественной оценки вируса.
    2. Aliquot 500 мкл свободных сред сыворотки в несколько микроцентрифужных пробирок. Вставить стерильный ватный тампон с наконечником, смоченный в сыворотке свободной среды, заполненной пробирками. Ватные тампоны необходимо окунуть и смачивать не менее чем за 5 минут до использования.
    3. Не нарушая подлежащие среды, транспортировать инфицированную пластину роговицы свиней в шкаф биобезопасности. Используя влажные ватные тампоны, сделайте 3 оборота по часовой стрелке и 3 оборота против часовой стрелки на диаметре 5 мм от центра зараженной роговицы свиньи, не применяя чрезмерного давления.
    4. Вставьте обратно ватный тампон в сыворотку свободной среды, заполненную микроцентрифужной трубкой, и поверните ее по часовой стрелке и против часовой стрелки 5 раз. Металлический наконечник ватного тампона должен быть обрезан так, чтобы он полностью помещался в микроцентрифужную трубку, а крышку можно было закрыть.
    5. Поместите трубку микроцентрифуги, содержащую мазанный хлопковый наконечник, на вихревую машину и вихрь на высокой скорости в течение 1 мин.
    6. Выполните количественную оценку вируса с помощью анализа бляшек на этих образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап количественной оценки должен быть выполнен на 2, 4 день и, по желанию, на 6 днях после заражения.
  4. Количественная оценка вируса с помощью анализа бляшек
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить анализ бляшек, вырастите и размяжите клетки Vero в 6-колодезную пластину и обеспечьте 90% слияние клеток до начала анализа. Используйте смеяную колбу этих клеток75 см2. Все описанные ниже шаги должны быть выполнены внутри шкафа биобезопасности.
    1. Смыть слеющийся монослой клеток Vero в колбе 10 мл свежего фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) после аспирации питательной среды. Повторите этап стирки еще раз с PBS после аспирации первого набора раствора для стирки.
    2. Добавьте 1 мл 0,05% трипсина в клеточный монослой. Инкубировать колбу при 37 °C в течение 5 мин. Невооруженным глазом убедитесь, что клетки отделены от внутренней поверхности колбы. Если нет, подождите еще 5 минут, прежде чем снова озучить колбу. Когда клетки кажутся отсоединенными, добавьте 9 мл целой среды в монослой, чтобы гарантировать, что клетки полностью вытесняются с поверхности колбы.
    3. Соберите все клетки из колбы вместе со всей средой и поместите их в трубку центрифуги 15 мл.
    4. Для каждого колодца из 6 пластин скважины, которые используются для анализа бляшек, используйте 300 мкл из центрифужной трубки. Пополняйте каждую скважину из 6 плит скважин 2 мл целой среды. Оставьте пластины в инкубаторе на ночь, чтобы они росли и образовывать в каждом колодце сливаемый монослой.
    5. Для того, чтобы выполнить анализ бляшек, необходимо провести серийное разведение образцов перед количественной оценкой вируса.
    6. Выполняютлогарифмное 10-кратноеразведение вируса в микроцентрифужных пробирках с использованием сывороточных свободных сред до достижения разведения 10-8. Когда при разведении10 -3 переложить 1 мл разведения на монослой позолоченных клеток после аспирации ростовой среды на клетках из 6-й пластины, это будет этап заражения. Инкубируют инфицированную пластину при 37 °C инкубатора в течение 2 ч.
    7. Аспирировать существующие инфекционные среды, дважды осторожно промыть PBS для покрытия клеток и добавить 2 мл метилцеллюлозной среды на скважину во все 6 скважин. Насиживают в течение 72 ч или до образования бляшек можно будет увидеть. Бляшки можно выявить по образованию небольших промежутков между клетками в клеточном монослое.
    8. Медленно добавляйте 1 мл метанола в угол каждой скважины, используя стенку в качестве направляющего наконечника. Инкубировать плиту из 6 скважин при комнатной температуре в течение 15 мин. Медленно аспирировать содержимое каждой скважины с пластины, не нарушая и не перемешивая монослой клетки.
    9. Добавьте 1 мл кристаллического фиолетового рабочего раствора в каждую скважину из 6 пластин, обеспечив покрытие всех ячеек. Инкубировать 6-ю пластину в темноте в течение 30 мин. Выбросьте кристаллический фиолетовый раствор, аспирируя его, и высушите колодцы на листе абсорбирующей бумаги.
    10. Подсчитайте количество бляшек в наибольшем разведении, чтобы количественно оценить общее содержание вируса в исходном растворе. Повторите процесс дважды, чтобы подтвердить вирусный титр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы понять эффективность экспериментальных противовирусных препаратов, их необходимо тщательно протестировать, прежде чем они будут отправлены на клинические испытания in vivo на людях. В связи с этим необходимо выявить группы положительного контроля, отрицательного контроля и тестов. Трифтортимидин (ТФТ) уже давно используется в качестве предпочтительного лечения герпетического кератита местно16. Используемые в качестве положительного контроля, группы роговицы, обработанные TFT, показывают боле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие исследования показали, что BX795 играет многообещающую роль в качестве противовирусного средства против инфекции ВПГ-1; путем ингибирования TANK-связывающей киназы 1 (TBK1)16. Как TBK1, так и аутофагия сыграли определенную роль в ингибировании инфекции ВПГ-1, как показано на эпителиальных клетках роговицы человека. Было показано, что BX795 максимально эффективен с противовирусной активностью в концентрации 10 мкМ, и, используя как анализ вестерн-блот, так и анализ вирусных бляшек ключев...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 и RO1 EY029426) для D.S. A.A. было поддержано грантом F30EY025981 от Национального института глаз, NIH. Исследование проводилось с использованием роговицы свиней, полученной от компании Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
30 г игл для подкожных инъекций.BD305128
стеклянная бутылка объемом 500 мл.Scientific844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)GIBCO15240096аликвоту в пробирки объемом 5 мл и хранить в замороженном виде до использования
Benchtop vortexer.Шкаф биобезопасности BioDotBDVM-3200
с сертификацией Bio-Safety Level-2 (BSL-2).Thermofisher ScientificHerasafe 2030i
Calgiswab 6" стерильный альгинат кальция стандартные тампоны.Puritan22029501
- 25 смBiologix BE70-1180 70-1250
Кристаллический фиолетовыйSigma AldrichC6158Хранить порошок в темном месте
Dulbecco' s модифицированный Eagle' с средой - DMEMGIBCO41966029Store at 4° C до использования
этанолаSigma AldrichE7023
Фетальная бычья сыворотка -FBSSigma AldrichF2442Аликвота в пробирках объемом 50 мл и держать замороженной до использования
пинцета с плоскими краями – 2.Harward Instruments72-8595
Морозильные камеры --80 &d;C. -Thermofisher Scientific13 100 790
Свежая коробка лопастей.Thomas ScientificTE05091
GuazeJohnson & 108 квадратных дюймов папка 12 слоев
HSV-1 17GFPвыращен в домашних условиях-Оригинальный штамм от доктора Патриции Спирс, Северо-Западный университет. GFP экспрессирует ВПГ-1 штамм 17
Инсулин, Трансферрин, Селен - ITSGIBCO41400045Аликвоту в пробирки объемом 5 мл и хранить в замороженном виде до использования
магнитной мешалки.Thomas ScientificH3710-HS
Металлические ножницы.Harward Instruments72-8400
Микропипетки от 1 до 1000 &ΰL.Thomas Scientific1159M37
Среда для минимального потребления - MEMGIBCO11095080Store at 4 ° C до использования
OptiMEM Магазин GIBCO31985047по адресу 4° C до использования
пенициллина/стрептомицина.GIBCO15140148аликвоту в пробирки объемом 5 мл и хранить в замороженном виде до использования
Фосфатный буфер физиологического раствора -PBSGIBCO10010072Хранить при комнатной температуре
Porcine CorneasPark Packaging Co., Чикаго, ИллинойсСпециальный заказ по запросу
Процедура чехлов для скамеек - по мере необходимости.Thermofisher ScientificS42400
Серологические пипеткиThomas ScientificP7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Оборудование для серологического пипетирования.Thomas ScientificEzpette Pro
СтереоскопCarl ZeissSteREO Discovery V20
Магнит для перемешивания.Thomas ScientificF37120
Колбы для культуры тканей, T175 см2.Thomas ScientificT1275
Инкубаторы для культивирования тканей, которые могут поддерживать 5% CO2 и 37 ° С температура.Thermofisher ScientificForma 50145523
Tissue Culture, обработанные планшетами (6-луночные).ThomasScientific T1006
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол красныйGIBCO25-300-062Аликвота в пробирках объемом 10 мл и хранить в замороженном виде до использования
клеток VeroAmerican Type Culture Collection ATCCCRL-1586
Thomas Скребок для клеток Johnson

Ссылки

  1. Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
  2. Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
  3. Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
  4. Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
  5. Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
  6. Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
  7. Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
  8. Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
  9. Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
  10. Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
  11. Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
  12. Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
  13. Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
  14. Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559(2017).
  15. Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
  16. Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).
  17. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эксплантат роговицы свиньипротивовирусная эффективностьмодель ex vivoинфекция роговицыметод расчета бляшекзаболевание поверхности глазаколичественное определение вирусавыделение тканистереоскопическая визуализация
Эксплант ткани роговицы свиней для изучения эффективности противовирусных препаратов вируса простого герпеса-1
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.